动物实验基本技术

动物实验基本技术动物实验基本技术 实验动物抓取与固定 实验动物分组与标记 实验动物被毛去除方法 实验动物给药 实验动物麻醉 实验动物取血 实验动物处死一、实验动物抓取与固定目的：暴露手术操作部位小鼠的抓取保定大鼠的抓取保定豚鼠的抓取保定家兔的抓取保定1.小鼠的抓取保定抓取：右手抓住鼠尾并提起，把小鼠置于笼盖或其他粗糙面上，向后方轻拉左手拇指和食指捏住其两耳和颈部皮肤右手拉紧小鼠尾部，拉直鼠身，左手无名指和小指压紧尾巴和后肢，中指和手掌心夹住背部皮肤，使小鼠呈一直线保定：四肢及门牙用棉线固定在解剖台上1.小鼠的抓取保定抓取：右手抓住鼠尾并提起，把小鼠置于笼盖或其他粗糙面上，向后方轻拉左手拇指和食指捏住其两耳和颈部皮肤右手拉紧小鼠尾部，拉直鼠身，左手无名指和小指压紧尾巴和后肢，中指和手掌心夹住背部皮肤，使小鼠呈一直线保定：四肢及门牙用棉线固定在解剖台上2.大鼠的抓取保定抓取：基本同小鼠右手抓住鼠尾并提起，把大鼠置于笼盖或其他粗糙面上，向后方轻拉左手顺序按卡大鼠背部，稍加压力向头部滑行，拇指和食指捏住其两耳和颈部皮肤右手拉紧大鼠尾部，拉直鼠身，左手其余三指固定背部皮肤在大鱼际肌上保定：同小鼠3.豚鼠的抓取保定抓取：左手轻轻扣、按住豚鼠背部，顺势抓住其肩胛上方皮肤，拇指和食指环握颈部右手托住其臀部抓取时必须快、准、稳、柔4.家兔的抓取保定抓取：右手抓住颈背部皮肤，提起家兔左手托住其臀部保定：四肢和门牙固定在手术台上，其中前肢是交叉固定。4.家兔的抓取保定抓取：右手抓住颈背部皮肤，提起家兔左手托住其臀部保定：四肢和门牙固定在手术台上，其中前肢是交叉固定。二、实验动物分组与标记1.分组：分组原则--随机分组每只动物都有同等机会被分配到各个实验组中去，避免人为因素对实验造成影响。建立对照组分组原则--随机分组(1)完全随机分组：将全部动物编号从随机数表中任取一段随机数字，给各个动物依次配号按所配数字的奇偶（两组）或除以组数后的余数（两组以上）作为归入的组次分组最后随机调整，使各组的动物数达到均等分组原则--随机分组(1)完全随机分组--如小鼠20只，分甲、乙两组小鼠编为1号～20号随机数表中取出20个随机数依次分配给1～20号动物设单数为甲组，双数为乙组（下表），结果甲组9只，乙组11只 动物编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 随机数 03 47 43 73 86 36 96 47 36 61 68 34 30 13 70 55 74 30 77 12 组别 甲 甲 甲 甲 乙 乙 乙 甲 乙 甲 乙 乙 乙 甲 乙 甲 乙 乙 甲 乙分组原则--随机分组(1)完全随机分组--如小鼠20只，分甲、乙两组小鼠编为1号～20号随机数表中取出20个随机数依次分配给1～20号动物设单数为甲组，双数为乙组（表1-3-2），结果甲组9只，乙组11只再查随机数表的第21个数为13，将13÷11＝1余2。则将乙组中的第二位（6号动物）取出给甲组。若差数﹥2，可依次法调整直至两组动物数相等。分组原则--随机分组(2)简化随机分组--实际工作中从随机数表中的任一数字开始顺序取数，把取得的随机数除以组数，将所得余数作为这一轮开始分配的组次，从该组开始顺序分配一只再取下一个随机数，除以组数，所得余数作为下一轮分配开始的组次，顺序分配每组一只，直到分完为止。建立对照组空白对照--不加任何处理，排除动物本身的影响实验对照--实验条件对照对照--标准值对照（阳性对照）自身对照--自身前后对照相互对照--各实验组相互对照2.标记编号目的--将同种动物进行区别，以便于观察。要求--编号方法不对动物生理或实验反应产生影响，且号码清楚、易认和耐久。常用方法：染色法耳孔法烙印法挂牌法染色法用化学药品在实验动物身体明显部位涂染，以染色部位、颜色标记区分实验动物。缺点：长时间使用，染色剂会自行褪色，需不断补充和加深染色--慢性实验不适用染色剂的毒性对实验动物的影响适用动物--大、小鼠染色法--常用染色剂3%～5%苦味酸，染成黄色0.5%中性红或品红溶液，染成红色2%硝酸银溶液，染成咖啡色煤焦油酒精溶液，染成黑色染色法--染色方法单色涂染法：单一颜色的染色剂涂染涂染顺序：从左到右，从上到下适用于每组实验动物不超过10只染色法--染色方法双色涂染法：两种颜色同时染色标记，一种标记为个位数，另一种标记为十位数涂染方法同单色涂染法可标记100位以内的号码直接标号法：染色剂直接在实验动物身上编写号码实验动物太小或号码位数太多不适宜耳孔法用打孔机直接在实验动物的耳朵上打孔编号，根据打在动物耳朵上的部位和孔的多少来区分实验动物。打孔后须用消毒过的滑石粉抹在打孔局部，以免伤口愈合将耳孔闭合。也可用剪刀在实验动物的耳廓上剪缺口的方法来区分实验动物。适用动物--家兔耳孔法用打孔机直接在实验动物的耳朵上打孔编号，根据打在动物耳朵上的部位和孔的多少来区分实验动物。打孔后须用消毒过的滑石粉抹在打孔局部，以免伤口愈合将耳孔闭合。也可用剪刀在实验动物的耳廓上剪缺口的方法来区分实验动物。适用动物--家兔烙印法直接把标记编号烙印在实验动物身上，如盖印章一样，用来区别实验动物。适用动物--犬挂牌法将编好的号码烙印在金属牌上，挂在实验动物颈部、耳部、肢体或笼具上，用来区别实验动物。适用动物--犬、猴和猫三、实验动物被毛去除方法目的：去除实验操作局部的被毛，可避免影响实验操作和观察。常用被毛去除方法：拔毛法剪毛法剃毛法脱毛法1.拔毛法方法：固定动物后，用食指和拇指将暴露部位的毛拔去。优点：刺激局部组织产生扩张血管的作用采用部位：血管暴露，进行采血或动、静脉穿刺，如兔耳缘静脉、鼠尾静脉采血2.剪毛法方法：固定动物后，用水湿润局部被毛，绷紧局部皮肤，用剪刀紧贴皮肤表面剪去被毛。采用部位：皮肤暴露，进行手术操作的需要，如兔和犬颈部手术，兔胸、腹部手术注意：剪毛过程中不可提起被毛剪下的被毛应及时清理3.剃毛法方法：固定动物后，用刷子蘸温肥皂水将局部被毛湿润，用剪毛法剪去被毛，然后用剃毛刀逆被毛生长方向剃去残余被毛。采用部位：皮肤暴露，大动物手术区域皮肤的术前准备注意：剃毛时必须绷紧局部皮肤4.脱毛法方法：剪去局部被毛，用镊子夹棉球或纱布蘸脱毛剂涂抹在已剪去被毛部位，35min后用温水洗去脱下的毛和脱毛剂，用干纱布擦干后涂上一层油脂。采用部位：皮肤暴露，如大动物无菌手术、局部皮肤刺激性实验和局部血液循环常用脱毛剂：(鼠和兔用1、2，犬用3)配方1：硫化钠8g溶于100ml水中配方2：硫化钠:肥皂粉:淀粉为3:1:7，加水成糊状配方3：硫化钠10g和生石灰15g溶于100ml水中四、实验动物给药灌胃皮下注射静脉注射腹腔注射1.灌胃准备：连接灌胃针的注射器吸入待灌药液1.灌胃准备：连接灌胃针的注射器吸入待灌药液过程：一手固定动物，并使体位为头高位一手持注射器，将灌胃针从动物口角插入，并紧贴上腭，经咽后壁插入至预定深度深度：小鼠3cm，大鼠5cm灌胃量：小鼠0.01～0.03ml/g，大鼠0.01～0.02ml/g1.灌胃准备：连接灌胃针的注射器吸入待灌药液过程：一手固定动物，并使体位为头高位一手持注射器，将灌胃针从动物口角插入，并紧贴上腭，经咽后壁插入至预定深度深度：小鼠3cm，大鼠5cm灌胃量：小鼠0.01～0.03ml/g，大鼠0.01～0.02ml/g2.皮下注射准备：注射器吸入待注射药液过程：局部皮肤消毒（背部）一手拇指和中指将背部皮肤提起，食指轻按其皮肤，使其形成一个三角小窝一手持注射器从三角窝下部刺入皮下，轻轻摆动针头，易摇动表明针尖在皮下，回抽无血后注入药液拔针时左手捏住针刺部位片刻，防止药液流出注射量：小鼠0.01ml/g，大鼠0.01～0.03ml/g3.静脉注射（尾静脉）准备：全新注射器吸入待注射药液动物固定在固定器中，并露出尾巴用45℃～50℃的温水浸泡尾部半分钟或用75%的酒精棉球擦拭尾部，使血管扩张充血、表皮角质软化3.静脉注射（尾静脉）准备：过程：(1)一手拇指与食指捏住尾部两侧，中指从下托起尾巴，无名指和小指夹持尾尖部一手持注射器使针头与静脉平行（小于30°角）刺入，推动药液无阻力、无皮丘，可注入药液注射完毕后尾部向注射侧弯曲或以消毒棉签止血3.静脉注射（尾静脉）准备：过程：(1)一手拇指与食指捏住尾部两侧，中指从下托起尾巴，无名指和小指夹持尾尖部一手持注射器使针头与静脉平行（小于30°角）刺入，推动药液无阻力、无皮丘，可注入药液注射完毕后尾部向注射侧弯曲或以消毒棉签止血3.静脉注射（尾静脉）准备：过程：(2)一手食指与中指从下托起尾巴，无名指和小指夹持尾尖部,拇指轻按尾部3.静脉注射（尾静脉）准备：过程：注射量：0.005～0.01ml/g4.腹腔注射准备：注射器吸入待注射药液过程：一手固定动物，腹部向上，且呈头低位4.腹腔注射准备：注射器吸入待注射药液过程：一手固定动物，腹部向上，且呈头低位局部皮肤消毒一手持注射器刺入下腹部皮下，针头向前推进3mm后，注射针头与皮肤面呈45°角刺入腹肌4.腹腔注射准备：注射器吸入待注射药液过程：一手固定动物，腹部向上，且呈头低位局部皮肤消毒一手持注射器刺入下腹部皮下，针头向前推进3mm后，注射针头与皮肤面呈45°角刺入腹肌4.腹腔注射准备：注射器吸入待注射药液过程：一手固定动物，腹部向上，且呈头低位局部皮肤消毒一手持注射器刺入下腹部皮下，针头向前推进3mm后，注射针头与皮肤面呈45°角刺入腹肌4.腹腔注射准备：注射器吸入待注射药液过程：一手固定动物，腹部向上，且呈头低位局部皮肤消毒一手持注射器刺入下腹部皮下，针头向前推进3mm后，注射针头与皮肤面呈45°角刺入腹肌注射量：0.01～0.02ml/g五、实验动物麻醉目的：消除动物在手术或实验中的疼痛，减少挣扎，使实验便于操作和顺利进行。关键：选择麻醉药和麻醉方法常用麻醉药的给药方法和剂量(表)五、实验动物麻醉 麻醉药物 浓度 动物 给药方法 剂量（g/kg） 维持时间（h） 备注 乙醚 各种动物 持续吸入 实验决定 戊巴比妥钠 3% 兔、狗、猫 iv、ip 0.03 2～4 sc 0.05 2～4 2% 小鼠、大鼠 ip 0.04 2～4 豚鼠 ip 0.04 2～4 硫喷妥钠 5% 兔、狗、猫 iv 0.02 15～30min 呼吸抑制较严重，注射必须缓慢 ip 0.04 15～30min 2% 小鼠、大鼠 ip 0.04 15～30min 氨基甲酸乙酯 20% 兔、狗、猫 iv、ip 1.00 2～4 毒性较小，安全 10% 小鼠、大鼠 ip 1.00 2～4 豚鼠 ip 1.00 2～4 蛙 淋巴囊 2.00 2～4 氨基甲酸乙酯+氯醛糖 10%+1% 兔、猫、大鼠 iv、ip 0.5+0.05 56 安全，肌松不完全六、实验动物取血剪尾取血法眼眶动脉和静脉取血法颈动脉及静脉、股动脉及静脉取血法断头取血法1.剪尾取血法过程：动物固定并露出尾巴用45℃～50℃的温水浸泡尾部半分钟或用75%的酒精棉球擦拭尾部，使血管扩张充血用剪刀剪断尾尖或锋利刀片切割一段尾静脉，即可流出。用手轻轻地从尾根部向尾尖挤捏，可取到更多的血液。取血量：0.3～0.5ml/次2.眼眶动脉和静脉取血法过程：一手将鼠倒置固定，且用拇指和食指捏紧头颈部皮肤，使鼠眼球突出。一手持眼科弯镊或止血钳，钳夹一侧眼球根部，将眼球摘出，并用镊子头部捅破眼球后包膜，将血滴入玻璃管内，直至流血停止取血量：体重4%～5%血液量3.颈动静脉、股动静脉取血法过程：一手将鼠麻醉仰卧固定，分离暴露出上述血管一手持注射针沿动脉或静脉走向平行刺入血管，抽取所需血量取血量：小鼠抽血0.6ml/20g大鼠抽血8ml/300g4.断头取血法准备：实验者带上厚手套过程：一手拇指和食指抓紧鼠颈部位皮肤，并将动物头朝下一手持剪刀，剪掉鼠颈部，让血流入试管内取血量：小鼠抽血0.8～1.2ml大鼠抽血5～10ml七、实验动物处死和器官剖解实验动物处死目的：发扬人道主义精神，爱护和善待动物--实验结束后，应让动物无痛苦地死亡或尽量减少死亡的痛苦。小鼠和大鼠的处死实验动物器官剖解小鼠和大鼠器官剖解1.小鼠和大鼠处死颈椎脱臼法：用摄子或用左手拇指与食指向下压住鼠头部枕骨处，另一只手抓住鼠尾用力向后拉，使之颈椎脱臼，鼠立即死亡。断头法：在鼠颈部用剪刀快速将鼠头剪掉，鼠因断头和大出血而死。打击法：用手抓住鼠尾并提起，将其头部猛击地面，或用小木锤用力敲击鼠头，使鼠致死。过量麻醉法：快速过量注射麻醉药（麻醉时的30倍）2.小鼠和大鼠器官剖解时间：处死后应立即剖解，越早越好，最好在处死后2～3min内解剖器官。体位：以仰卧位固定动物尸体顺序：先腹腔后胸腔，再脑、脊髓、骨髓和皮肤肌肉等腹腔器官暴露器官：沿腹部正中线切开腹前壁，再沿最低位肋骨分别向左右两侧切开侧腹壁至脊柱两旁，完全暴露腹腔器官。剖取顺序：脾、肝、胃、胰、肠、肾和肾上腺等。盆腔器官：剥离相连的组织后，将雄性动物两侧输尿管、膀胱、睾丸、精囊腺、前列腺一同取出；雌性动物可将两侧卵巢、输卵管、子宫角、子宫体一同取出。胸腔器官用镊子夹住胸骨剑突，剪断膈肌与胸骨的连接，提起胸骨，在胸椎两侧分别剪断左、右侧胸壁的肋骨，取下整个胸壁，依次取出胸腺和心脏。将下颌的两下颌支内侧与舌连接的肌肉切断，将咽、喉、气管、食管与周围组织分离，用镊子夹住气管向上提起，剪断肺与胸膜的连接韧带，然后将咽、喉、气管、食管边同整个肺一并取出。颅腔及脑小动物：从枕骨剪开颅骨，小心剪去颅顶骨片，暴露大脑、小脑和延髓。大动物：可用弓形锯沿眉弓至枕外隆凸上0.5cm连线锯开，用刀背轻轻将脑从颅底分出，依次切断各对脑神经，借脑本身重量从颅内脱出，再切断延髓和脊髓交界处，用尖小刀从蝶骨鞍槽内剥离与脑垂体相连的周围组织，最后将整个脑和脑垂体托出。小鼠肿瘤的移植一般要求：无菌条件下进行，瘤块污染常是接种失败的主要原因。操作环境：无菌室内操作实验动物：动物处死后，须消毒实验器械：手术器械须灭菌接种部位：皮下接种部位为右前肢腋下小鼠肿瘤的移植瘤细胞悬液的制备：在无菌条件下取瘤块，除去坏死组织，将数个瘤块混合，剪成小块用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，并把容器放置于冰块上加生理盐水适量稀释成1:3～1:4的瘤细胞悬液（细胞数为107/ml）小鼠肿瘤的移植瘤细胞悬液的接种：用针筒抽吸瘤细胞悬液0.2ml，接种于同种异体动物（异种移植于裸鼠）右前肢腋窝皮下（接种部位皮肤应先消毒）注意：每次用针筒抽吸前应将瘤细胞悬液混匀，整个操作应在30min内完成实验内容分组标记：小鼠(10只/组)(染色法)抓取：小鼠、大鼠(2只/组)给药：小鼠(灌胃、皮下注射和尾静脉注射)、大鼠(灌胃、腹腔注射麻醉)固定、剪毛和取血：小鼠(摘眼球取血)、大鼠(颈部剪毛、颈动静脉分离插管取血)处死和器官剖解：小鼠(颈椎脱臼法)、大鼠(过量麻醉法)、大鼠(器官剖解)肿瘤移植：小鼠(皮下注射)实验内容小鼠(10只/组)分组、标记编号(染色法)、抓取灌胃、皮下注射(腋下)和尾静脉注射摘眼球取血、颈椎脱臼法处死大鼠(2只/组)抓取灌胃、腹腔注射麻醉和固定、颈部皮肤剪毛颈动静脉分离插管取血、过量麻醉法处死，器官剖解