Biolog方法与ECO板碳源

EcoPlateTM各区井中的碳源Al空A2多A3有A4氨AlA2A3A4AlA2A3A4白碳糖机酸基酸WaterB-MetD-GalL-ArgWaterB-MetD-GalL-ArgWaterB-MetD-GalL-Arg水hyl-Dactoninine水hyl-Dactoninine水hyl-D-actoniinine二区-GluccL-精三区-GlucicL-精一区GlucocAcidL-精osideAcid氨酸osideAcid氨酸sidey-Lact氨酸B-甲y-LacB-甲y-LacB-甲one基D-tone基D-tone基D-D-半葡萄D-半葡萄D-半葡萄乳糖糖苷乳糖糖苷乳糖糖苷内酯内酯内酯B1有B2多B3有B4氨B1B2B3B4BlB2B3B4机酸碳糖机酸基酸PyruvD-XylD-GalL-AspPyruviD-XylD-GalL-AspPyruviD-XylD-GalL-AspicoseacturoaragincAcidoseacturoaragincAcidoseacturoaraginAcidD-木niceMethyD-木niceMethyD-木niceMethy糖AcidL-天lEster糖AcidL-天lEster糖AcidL-天lD-半冬酰丙酮D-半冬酰丙酮D-半冬酰Ester乳糖胺酸酸甲乳糖胺酸酸甲乳糖胺酸丙酮醛酸脂醛酸脂醛酸酸甲脂Cl聚C2其C3有C4氨C1C2C3C4ClC2C3C4合物他多机酸基酸TweenI-Eryt2-HydL-PheTweenI-Eryt2-HydL-PheTween元醇2-HydL-Phe40hritolroxynylala40hritolroxynylala40I-Erytroxynylala吐温I-赤藻Benzonine吐温I-赤藻Benzonine吐温hritolBenzonine40糖醇icL-苯40糖醇icL-苯40I-赤藻icL-苯Acid基丙Acid基丙糖醇Acid基丙2-羟氨酸2-羟氨酸2-羟氨酸苯甲苯甲苯甲酸酸酸D1聚D2其D3有D4氨D1D2D3D4D1D2D3D4合物他多机酸基酸TweenD-Ma4-HydL-SeriTweenD-Ma4-HydL-SeriTween元醇4-HydL-Seri80nnitolroxyne80nnitolroxyne80D-Maroxyne吐温D-甘BenzoL-丝吐温D-甘BenzoL-丝吐温nnitolBenzoL-丝80露醇ic氨酸80露醇ic氨酸80D-甘ic氨酸AcidAcid露醇Acid4-羟4-羟4-羟基苯基苯基苯甲酸甲酸甲酸E1聚E2胺E3有E4氨E1E2E3E4E1E2E3E4合物N-Ace机酸基酸a-CycN-Acey-HydL-Thra-CyclN-Acey-HydL-Thra-Cycltyl-D-y-HydL-Thrlodextyl-D-roxybeonineodextrtyl-D-roxybeonineodextrGlucoroxybeoninetrinGlucoutyricL-苏inGlucoutyricL-苏insaminutyricL-苏a-环saminAcid氨酸a-环saminAcid氨酸a-环eAcid氨酸式糊ey-羟式糊ey-羟式糊N-乙y-羟精N-乙基丁精N-乙基丁精酰基基丁酰基酸酰基酸-D-葡酸-D-葡-D-葡萄胺萄胺萄胺F1多F2胺F3有F4氨F1F2F3F4F1F2F3F4碳糖酸机酸基酸GlycoD-GluItaconGlycylGlycoD-GluItaconGlycylGlycoD-GluItaconGlycylgencosamic-L-Glgencosamic-L-Glgen肝糖cosaminicAcidD-葡萄胺酸icAcid衣康酸-L-GlutamicAcid甘氨酰-L-谷氨酸肝糖inicAcidD-葡萄胺酸Acid衣康酸utamicAcid甘氨酰-L-谷氨酸肝糖inicAcidD-葡萄胺酸Acid衣康酸utamicAcid甘氨酰-L-谷氨酸G1多G2其G3有G4胺G1G2G3G4G1G2G3G4碳糖他机酸PhenyD-CelGlucoa-KetoPhenyD-CellGlucoa-KetoPhenyD-CellGlucoa-Ketolethyl-lobiose-1-Pbutyrilethyl-obiosese-1-Pbutyrilethyl-obiosese-1-PbutyriaminesehosphcAcidamineD-纤hosphcAcidamineD-纤hosphcAcid苯乙D-纤atea-丁苯乙维二atea-丁苯乙维二糖ate葡萄糖-1-磷酸盐a-丁酮酸基胺维二糖葡萄糖-1-磷酸盐酮酸基胺糖葡萄糖-1-磷酸盐酮酸基胺H1多H2多H3有H4胺H1H2H3H4H1H2H3H4碳糖元醇机酸Putresa-D-LD,L-a-D-MalPutresa-D-LD,L-a-D-MalPutresa-D-LD,L-a-D-MalcineactoseGlycericcineactoseGlycericcineactosea-D-乳糖GlycerolD,L-a-甘油icAcidD-苹果酸腐胺a-D-乳糖olD,L-a-甘油AcidD-苹果酸腐胺a-D-乳糖olD,L-a-甘油AcidD-苹果酸腐胺1.4.3统计试验采用SAS/pc统计分析系统(6.04版本)中的Proccluster,ProcPrincomp(factor)程序分别进行聚类、主成份（因子）分析;并采用Biolog系统的Mlclust程序进行聚类分析.表2.9计算微生物群落多样性指数的公式多样性指数用途公式备注Shannon多样性指数评估丰富度和均度（lnPi）Pi为第i孔的相对吸光值（C-R）与整个平板相对吸光值总和的比率Shannon均匀度通过Shannon指数计算出的均度E=HTlnSS为颜色变化的孔的数目Simpson指数评估某些最常见种的优势度指数D=X(ni(ni—1))(N(N-1))ni是第i孔的相对吸光值（C-R）；N是相对吸光值总和；Simpson指数用1/D表示McIntosh指数基于群落物种多维空间U巳:迄ni2)同上上的Euclidian距离的多样性指数McIntosh均匀度由McIntosh指数计算得N-U同上出的均匀度E=N--N/7s2・2・4・6・1BIOLOGGN微平板BIOLOGGN微平板是一种多底物的96孔ELISA反应平板。除对照孔A1只装有四氮叠茂和一些营养物质外，其余95孔作为反应孔还装有不同的单一碳底物。在进行ELISA反应时，各孔中的微生物利用碳底物，呼吸作用产生NADH,引起四氮叠茂发生氧化还原变色反应用于检测（BIOLOGInc,1993）。微生物对不同碳底物的利用情况可用反应孔中的颜色变化来表示。通过对孔中颜色变化的光吸收值的测量，可获得较准确的信息。2・2・4・6・2操作步骤参照Garland和Mills（1991）和杨永华等（2000）的方法，利用BIOLOGGN微平板来研究不同微生物群落对不同单一碳源利用能力（Sole-Carbon-SourseUtilization,SCSU）的差异，以获得堆肥微生物群落结构和功能多样性方面的信息。具体步骤如下：加250mL0.1mol/L磷酸缓冲液（K2HPO4/KH2PO4,pH7.0）于三角瓶中，灭菌;或用250ml0.85%的NaCl生理盐溶液，灭菌。称相当于25g烘干重的新鲜堆肥，加入三角瓶中，封口（1：10提取液）；摇床振荡1min后，冰浴1min，如此重复3次；静置2min，取上清液3mL于已灭菌的50mL的三角瓶中，加入27mL无菌0.1moL/L磷酸缓冲液，稍加振荡（1：100提取液）;重复步骤d,直至稀释到每毫升稀释液大约3x104〜4X104个微生物；将BIOLOGGN微平板从冰箱内取出，预热到25°C;用200gL移液器将稀释液加到微平板孔中，每孔加150卩L。将加好样的BIOLOGGN微平板在28C条件下温育；在温育过程中，每隔一定时间（24、48、72、96、120h），用318-微平板读数器（318-microplatereader）在590nm处读数来测定各孔吸光值（abs）,凡吸光值大于0.25的井，则属于阳性反应。与对照井abs相减得负值的井，在统计分析时其反应定为零。在实验过程中，应记录的数据为：吸光值（abs）、吸光值（abs）大于0.25的井数、呈阳性反应井对应的碳源类型。2.3.2生物多样性数据处理方法堆肥微生物群落BIOLOGGN微平板在温育过程中的平均每孔颜色变化率（Averagewellcolordevelopment,AWCD）的计算方法如下：AWCD值=[工（C-R）]/95,其中C指各反应孔在578nm下测定的吸光值（OD578），R是对照孔A1的吸光值。采用堆肥微生物在BIOLOGGN微平板反应72h的数据进行计算。除Shannon多样性指数外，在计算其它多样性指标时，将数据扩大1000倍以防止出现负数。用于计算土壤微生物群落多样性的公式如表2.9（骆世明和彭少麟，1996；杨永华等，2000）。BIOLOGGN微平板的碳底物组成如表2.10所示，用于将95种碳底物分类。表2.10BIOLOGGN微平板的碳底物组成CarbohydratesAdonitol(8)D-Mannitol(22)i-Erythritol(12)Mono-methyL-succinate(35)a-D-Glucose(17)D-Mannose(23)L-Arabinose(9)N-acetyL-D-galactosamine(6)a-D-Lactose(19)D-Raffinose(27)Cellobiose(11)N-AcetyL-D-glucosamine(7)D-Melibiose(24)L-Rhamnose(28)D-Psicose(26)Methylpyruvate(34)L-Fucose(14)Sucrose(30)Lactulose(20)m-Inositol(18)D-Sorbitol(29)D-Galactose(15)Turanose(32)Xylitol(33)D-Fructose(13)Gentiobiose(16)Maltose(21)卩-MethyL-glucoside(25)D-Trehalose(31)D-Arabitol(10)CarboxylicacidsAceticacid(36)Itaconicacid(49)a-Ketobutynicacid(50)a-Ketoglutaricacid(51)cis-Aconiticacid(37)Citricacid(38)D,L-Lacticacid(53)D-Galactonicacidlactone(40)D-Glucosaminicacid(43)D-Glucuronicacid(44)D-Saccharicacid(57)丫-Hydroxy-butyricacid(47)Malonicacid(54)Formicacid(39)Propionicacid(55)a-Hydroxybutyricacid(45)a-Ketovalericacid(52)Quinicacid(56)D-Gluconicacid(42)P-Hydroxybutyricacid(46)D-Galacturonicacid(41)Sebacicacid(58)Succinicacid(59)p-Hydroxy-phenylaceticacid(48)AminoacidsD,L-Carnitine(82)D-Alanine(64)D-Serine(79)Y-Aminobutyricacid(83)L-Leucine(74)Hydroxy-L-proline(73)L-Alanine(65)L-Alanyl-glycine(66)L-Asparticacid(68)L-Glutamicacid(69)L-Histidine(72)GlycyL-L-aspariticacid(70)L-Phenylalanine(76)L-Proline(77)L-Threonine(81)L-Pyroglutamicacid(78)L-Serine(80)L-Asparagine(67)L-Ornithine(75)Glycyl-L-glutamicacid(71)Amines-Amides2-Amino-ethanol(90)Alaninamide(63)Glucuronamide(62)PhenyL-ethylamine(88)Putrescine(89)Succinamicacid(61)PolymersTween80(5)Dextrin(2)Glycogen(3)a-Cyclodextrin(1)Tween40(4)Others2,3-Butanediol(91)Bromosuccinicacid(60)Inosine(85)Glucose-1-phosphate(94)Glucose-6-phosphate(95)Glycerol(92)urocanicacid(84)D,L-a-glycerolphosphate(93)Thymidine(87)Uridine(86)表中数字表示碳底物在微平板中的位置