新冠病毒核酸检测SOP

新冠病毒核酸检测SOP1.目的根据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》，规中心新型冠状病毒感染的肺炎的检测方法。2.适用范围体外定性检测新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的口咽拭子、鼻咽拭子和痰液样本检测。3.职责3.1检测人员：负责按照本检测细则对被检样品进行检测；3.2复核人员：负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核；3.3科室负责人：负责对科室综合管理和检测报告的签发。4.检测依据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》5.操作程序5.1实验前准备5.1.1检测人员进入污染区前，必须穿好一次性防护服、一次性帽子、N95口罩、双层手套、一次性靴套、护目镜、防护面屏不得将与实验无关物品带入实验室。5.1.2调节室温至20-25℃，湿度20-80%。5.1.3检测试剂在室温平衡半小时;并检查试剂是否在有效期内。5.1.4检查仪器是否正常，做好检测前准备工作。5.1.5开启实验室污染区生物安全柜5.2实验方法见试剂说明【检验方法】5.2.1试剂准备（试剂准备区）从试剂盒中取出核酸扩增反应液、酶混合液、ORF1ab/N反应液，室温融化，充分振荡混匀后瞬间离心。计算试剂使用份数N（N=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照），根据下表配置反应体系，加入一适当体积离心管中，充分振荡混匀后瞬间离心，按20μL分装至PCR反应管中，并转移至样本处理区。组分名称加入体积（μL）/人份核酸扩增反应液12酶混合液4ORF1ab/N反应液4总体积205.2.2样本处理（样本处理区）①核酸提取：待测样本、阳性对照及阴性对照按照核酸提取试剂盒说明书进行操作。②加样：在上述准备好的PCR反应管中分别加入待测样本核酸、阳性、阴性对照各5μL，终体积为25μL/管，盖紧管盖，瞬时离心。5.2.3PCR扩增检测（核酸扩增区）①将PCR反应管置荧光定量PCR仪扩增检测。插上仪器电源线，打开仪器背部的电源开关，仪器开机初始化。等待至指示灯停止闪动，变成稳定绿色，进入下一步操作。②打开电脑桌面qsoft4.1软件，进入qsoft4.1用户界面，表明仪器与电脑连接成功，进入下一步操作。③新建程序：单击菜单栏中“项目”，创建新的程序。或者调入已保存的PCR程序模板文件，运行程序。④若创建新程序，点击创建项目。设置PCR基本参数、文件名、反应体系、操作者等。⑤设置实验程序，温度循环设置按试剂盒说明书中“循环参数设定”设置（如图）。循环参数设定步骤温度时间循环数1逆转录50℃10min1cycle2预变性95℃5min1cycle变性95℃10s340cycles退火/延伸/检测荧光55℃40s说明：A、步骤3中55℃时设置荧光检测。B、在勾选基因通道时需要填写检测信号（管1，在此处可以填写检测基因信号或者1,2,3,4）点击保存，保存我们所创建的新程序。⑥在界面左下角点击Home，实验Home界面提供了多种进入实验向导的入口，用户点击实验向导。⑦更改文件名、操作者，勾选模块，基因通道默认为我们所设置的，如需要可勾选全通道扫描。⑧“孔板编辑”设置样品孔定义，根据我们样品数设置孔板，点击右下侧的样本项目，进行样本类型的更改，设置阴阳对照。⑨反应条件全部设好后，打开仪器蓝色滑盖，放入样品，盖上盖子，点击“实验运行”，再点击开始，即可开始运行程序。停止程序，暂停程序。运行程序前，会要求设置好结果文件保存路径，运行结束后，结果文件自动保存在指定的文件夹中。⑩结果分析参数设定根据分析后扩增曲线图调节起止值，（建议起始设在3～15、终止设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），点击分析，在报告界面查看结果。【阳性判断值】根据临床样本检测结果，利用ROC曲线法确定ORF1ab、N参考值均为Ct值等于38。【检验结果的解释】质控以下要求需在同一实验中同时满足，否则本次实验无效序：检测靶标阴性对照阳性对照通道FAM通道ORF1ab无Ct值Ct≤30HEX/VIC通道N无Ct值Ct≤30ROX通道内参—Ct≤30结果判读检测通道FAM通道HEX/VIC通道ROX通道结果判读Ct值≤38Ct值≤38Ct值≤38样本阳性无Ct值或Ct值>38无Ct值或Ct值>38Ct值≤38样本阴性无Ct值或Ct值>38Ct值≤38Ct值≤38Ct值≤38无Ct值或Ct值>38Ct值≤38复测**痰液样本：建议复测，如复测结果两个通道均为Ct值≤38则结果判读为阳性，否则为阴性；口咽拭子和鼻咽拭子：建议采集痰液样本进行复测，并按照痰液样本的标准进行结果判读，即两个通道均为Ct值≤38则结果判读为阳性，否则为阴性。⑪实验结束后，打开仪器蓝色滑盖，取出八联管丢弃，并依次关闭PCR仪电源和电脑电源。6仪器维护6.1仪器的表面应每周用软抹布加少量清水擦洗1次，清洁后将仪器擦干；6.2若有试剂泄漏在仪器表面，应用软抹布加75%酒精擦拭干净；6.3清洁仪器前必须关闭电源，并拔掉电源线；6.4不要将液体倾倒在模块中或者仪器内部；6.5不能用强腐蚀性溶剂或者有机溶剂擦洗仪器；6.6反应孔沾染灰尘或杂质后，会影响PCR扩增和荧光检查，因此要每3个月用吹气球轻轻吹拭；6.7若有试剂泄漏在反应孔内，应用无尘纸或者无尘布加75%酒精擦拭。6.8仪器不使用时，要盖上方机。7操作注意事项7.1实验室操作按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室》进行。实验操作必须严格分区，各区域使用的仪器、设备、耗材和工作服必须专用，不得交叉使用，避免污染。试剂盒不同批号的组份不可以互换使用，各组份使用前应室温融化，充分振荡混匀，瞬间离心后使用。7.2反应液分装时应避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧。7.3实验结束后，应及时清理台面，并用10%次氯酸钠、75%酒精和紫外灯等进行消毒。7.4试剂盒涉及的待测样本应视为具有传染性，实验室所有操作应符合《病原微生物实验室生物安全通用准则》；医疗废弃物处理应按照《医疗废弃物管理条例》进行管理。7.5咽拭子检测结果为阴性并不能作为排除依据，建议依据临床症状采集病毒载量较高的下呼吸道样本如痰液进行复测。7.6试剂保存运输及使用过程中多种因素可能导致性能变化，如保存运输不当、样本采集、样本处理及检测过程操作不规范等，请严格按照说明书操作。因拭子等样本采集过程及病毒感染过程本身的特点，可能存在采集到的样本量不足等原因带来的假阴性结果，应结合临床其他诊疗信息综合判断，必要时复测。7.7待检标本和试剂盒及废弃物有潜在传染性，应严格遵守消毒隔离制度。7.8实验操作后应立即去除手套，用清洁液洗手。7.9避免标本溅出，污染环境。7.10每次实验完毕，必须作一次性严格消毒。7.11不能使用过期试剂。7.12流感检测试剂必须保存在2℃～8℃环境中。7.13移液器应经常校正。8支持性文件8.1《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》9质量记录9.1检验原始记录。9.2检验报告。