食品中维生素K1的测定（食品安全国家标准）

食品安全国家食品中维生素K1的测定范围本标准规定了食品中维生素K1的测定方法。本标准第一法为高效液相色谱—荧光法，第二法为液相色谱—串联质谱法，均适用于婴幼儿食品、乳品、植物油、水果和蔬菜中维生素K1的测定。第一法高效液相色谱—荧光检测法原理高脂样品经脂肪酶酶解，高淀粉样品经淀粉酶酶解，正己烷提取样品中的维生素K1后，用高效液相色谱C18柱将维生素K1与其他杂质分离，锌柱柱后还原，荧光检测器检测，外标法定量。果蔬等低脂性植物样品，用异丙醇分散后，正己烷提取其中的维生素K1，经中性氧化铝柱净化，去除叶绿素等干扰物质。用高效液相色谱C18柱将维生素K1与其他杂质分离，锌柱柱后还原，荧光检测器检测，外标法定量。3试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1无水乙醇（CH3CH2OH）。3.1.2碳酸钾（K2CO3）。3.1.3无水硫酸钠（Na2SO4）。3.1.4异丙醇（C3H8O）：色谱纯3.1.5正己烷（C6H14）。3.1.6甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.7四氢呋喃（C4H8O）：色谱纯。3.1.8乙酸乙酯（C4H8O2）。3.1.9冰醋酸（CH3COOH）：色谱纯。3.1.10氯化锌（ZnCl2）3.1.11无水乙酸钠（CH3COONa）。3.1.12氢氧化钾（KOH）。3.1.13磷酸二氢钾（KH2PO4）3.1.14脂肪酶：酶活力≥700U/mg。3.1.15淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。3.1.16中性氧化铝：装层析柱用，100目~200目。3.1.17中性氧化铝柱※：2g/6mL，填料中含10%水，可直接购买商品柱，也可自行装填。※注：中性氧化铝柱装填方法：填料处理：取200克中性氧化铝于500mL的广口瓶中，于150℃干燥箱中烘烤2h，加盖后于干燥器中冷却至室温，缓慢加入20mL纯水，边加边摇，加完后加上瓶盖，放入80℃烘箱中平衡3~5min，取出后，剧烈振摇，直至瓶内氧化铝自由流动，无结块，置于干燥器中冷却30min，备用。层析柱装填：取6mL的针筒式柱套，加入筛板，称取2.00g上述经脱活化处理的填料，再加入一块筛板，用装填工具压紧。3.1.18锌粉：粒度50µm～70µm。3.1.19锌柱※：50mm×4.6mm，锌柱可直接购买商品柱，也可自行装填。※注：锌柱填装方法：将锌粉密集装入还原柱（4.6mm×50mm，不锈钢材质）中。装柱时，应连续少量多次将锌粉装入柱中，边装边轻轻拍打，以使装入的锌粉紧密。锌柱接入仪器前，须将液相色谱仪所用管路中的水排干。3.2试剂配制3.2.1氢氧化钾溶液（40%，质量分数）：溶解40g氢氧化钾于100mL水中。3.2.20.8mol/L的磷酸盐缓冲液（pH=7.9-8.0）：溶解54.0g磷酸二氢钾于300mL水中，用氢氧化钾溶液调节pH到7.9-8.0，加水定容到500mL。3.2.3正己烷-乙酸乙酯（90:10，V/V）溶液：取90mL的正己烷，加入10mL的乙酸乙酯，混匀。3.2.4流动相：甲醇900mL，四氢呋喃100mL，冰醋酸0.3mL，氯化锌1.5g，无水乙酸钠0.5g，溶解后用0.45µm有机系滤膜过滤于干燥试剂瓶中。3.3标准品3.3.1维生素K1标准品（C31H46O2，CAS：84-80-0）：纯度≥99%。3.4标准溶液配制3.4.1维生素K1标准贮备溶液：（1mg/mL）：称取0.05g（精确到0.1mg）维生素K1标准品于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。此溶液浓度约为1mg/mL。将溶液转移至试剂瓶中后，在-20℃下避光保存。临用前进行浓度校准（校准方法参见附录A.1）。3.4.2维生素K1标准中间液（10µg/mL）：取标准贮备液1.00mL，加甲醇定容至100mL。3.4.3标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素K1中间液10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、400μL，加甲醇定容至10mL，维生素K1标准系列工作液浓度分别为10μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L，200μg/L，400μg/L。4仪器和设备4.1匀浆机。4.2高速粉碎机。4.3组织捣碎机。4.4涡旋混合器。4.5恒温水浴振荡器。4.6pH计：测量精度±0.02。4.7天平：感量0.01g和0.00001g。4.850mL具塞PVC离心管。4.9离心机：转速≥6000转/min。4.10定量移液管：5.0mL，10.0mL，20.0mL。4.11玻璃试管：10mL。4.12旋转蒸发仪。4.13氮吹仪。4.14超声波震荡器。4.15一次性微孔滤头：带0.22μm微孔滤膜。4.16高效液相色谱仪：带荧光检测器。4.17色谱分离柱：C18柱（4.6mmX250mm,粒径5μm），或相当者。5分析步骤5.1试样制备将一定数量的样品按经过粉碎、均质、缩分后，储存于样品瓶中，避光冷藏。5.2试样处理※注：处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。5.2.1婴幼儿食品、乳品、植物油5.2.1.1酶解准确称取经均质的试样1g（精确到0.1mg,维生素K1含量不低于0.2µg）于50ml离心管中，加入5ml温水溶解（液体样品直接吸取5mL，植物油不需加水稀释），加入5mL磷酸盐缓冲液（3.2.2），混匀，加入0.2g脂肪酶，高淀粉样品需加入0.2g淀粉酶。涡旋均质后于37℃±2℃恒温水浴振荡器中振荡2h以上，使其充分酶解。5.2.1.2提取取出酶解好的试样，分别加入10mL乙醇及1gK2CO3，混匀后加入15mL正己烷，涡旋提取10min，5000rpm离心3min，转移上清液至100mL旋蒸瓶中，再加入15mL正己烷至上述离心管中，涡旋5min，5000rpm离心3min，合并上清液于旋蒸瓶中。5.2.1.3浓缩将上述正己烷提取液旋蒸至干（如有残液，可氮吹至干），5mL甲醇定容，用0.22µm滤膜过滤，滤液待进样。5.2.2水果、蔬菜样品5.2.2.1提取准确称取1~5g（精确到0.1mg,维生素K1含量不低于0.2µg）经均质匀浆的蔬菜或水果样品于50ml离心管中，加入5mL异丙醇，涡旋1min，超声5min，加入10mL正己烷并涡旋振荡提取3min，7000rpm转速离心5min，移取上清液，向下层溶液中加入10mL正己烷并涡旋2min，合并上清液，定容至25mL，用移液管准确分取上清液1~5mL（视样品中维生素K1含量而定）至10ml试管中，氮气吹干，加入1mL正己烷(3.1.5)溶解，待净化。5.2.2.2净化、浓缩将上述1mL样品溶液转移至预先用5mL正己烷活化的中性氧化铝柱中，待样品溶液流至近干时，先用5mL正己烷淋洗后，再用6mL正己烷-乙酸乙酯溶液（90:10，V/V）洗脱至10mL试管中，氮气吹干后加入1mL甲醇，过0.22um滤膜，滤液供分析测定。5.3色谱参考条件色谱柱:C18色谱柱，250mm×4.6mm，5µm，或具同等性能的色谱柱；锌还原柱:4.6mm×50mm；流动相:甲醇900mL，四氢呋喃100mL，冰醋酸0.3mL，氯化锌1.5g，无水乙酸钠0.5g，溶解后用0.45µm滤膜过滤；流速：1mL/min；检测波长：激发波长为243nm，发射波长为430nm；进样量：10µL。标准色谱图和样品色谱图见附录B。5.4标准曲线的制作本法采用外标标准曲线法进行定量。将维生素K1系列标准工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高，以峰面积或峰高为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线,计算直线回归方程。6结果计算按式（1）计算维生素K1的量。··························································（1）式中：X——试样中维生素K1的含量，单位为微克每百克，µg/100g；A——根据标准曲线计算得到的试样中维生素K1的浓度，单位为纳克每毫升，ng·mL-1；m——试样的称样量，单位克，g；V1——提取液总体积，单位毫升，mL；V2——分取的提取液体积（婴幼儿强化食品V1=V2），单位毫升，mL；V3——定容体积，单位毫升，mL。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值示，计算结果保留三位有效数字。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他本方法的检出限：婴幼儿食品和乳品、植物油，当取样量为1g时，检出限为1µg/100g；果蔬样品，当取样量为2g时，检出限为1.5µg/100g。本方法的定量限：婴幼儿食品和乳品、植物油，当取样量为1g时，定量限为3µg/100g；果蔬样品当取样量为2g时，定量限为5µg/100g。第二法液相色谱--串联质谱法9原理高脂样品经脂肪酶酶解，高淀粉样品经淀粉酶酶解，用正己烷提取样品中的维生素K1后，用高效液相色谱C18柱将维生素K1与其他杂质分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。果蔬等低脂性植物样品，用异丙醇分散后，正己烷提取其中的维生素K1，经中性氧化铝柱净化，去除叶绿素等干扰物质。用高效液相色谱C18柱将维生素K1与其他杂质分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。10试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂10.1.1无水乙醇（CH3CH2OH）：分析纯。10.1.2碳酸钾（K2CO3）：分析纯。10.1.3氢氧化钾（KOH）：分析纯。10.1.4甲酸(HCOOH)：色谱纯。10.1.5甲酸铵（HCOONH4）：色谱纯。10.1.6异丙醇（（CH3)2CHOH）：色谱纯10.1.7正己烷（CH3（CH2）4CH3）：分析纯。10.1.8甲醇（CH3OH）：色谱纯。10.1.9乙酸乙酯（C4H8O2）：色谱纯。10.1.10脂肪酶：酶活力≥700U/mg。10.1.11淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。10.1.12中性氧化铝：装层析柱用，100目~200目。10.1.13中性氧化铝柱※：2g/6mL，填料中含10%水，可直接购买商品柱，也可自行装填。※注：中性氧化铝柱装填方法：填料处理：取200克中性氧化铝于500mL的广口瓶中，于150℃干燥箱中烘烤2h，加盖后于干燥器中冷却至室温，缓慢加入20mL纯水，边加边摇，加完后加上瓶盖，放入80℃烘箱中3~5min，取出后，剧烈振摇，直至瓶内氧化铝自由流动，无结块，置于干燥器中冷却30min，备用。层析柱装填：取6mL的针筒式柱套，加入筛板，称取2.00g上述经脱活化处理的填料，再加入一块筛板，用装填工具压紧。10.2试剂配制10.2.1氢氧化钾溶液（40%，质量分数）：溶解40g氢氧化钾于100mL水中。10.2.20.8mol/L的磷酸盐缓冲液（pH=7.9-8.0）：溶解54.0g磷酸二氢钾于300mL水中，用氢氧化钾溶液调节pH到7.9-8.0，加水定容到500mL。10.2.3正己烷-乙酸乙酯（90:10，V/V）溶液：取90mL的正己烷，加入10mL的乙酸乙酯，混匀。10.2.4流动相：1000mL甲醇中加入0.25mL甲酸和0.1575g甲酸铵,超声溶解后，用0.45µm滤膜过滤。10.3标准品10.3.1维生素K1标准品（C31H46O2，CAS：84-80-0）：纯度≥99.3%。10.3.2同位素内标维生素K1-D7（C31H46O2，CAS：1233937-39-7）：纯度≥99.5%。10.4标准溶液配制10.4.1维生素K1标准贮备溶液（1mg/mL）：称取0.05g维生素K1标准品（精确到0.1mg），用甲醇溶解并定容至50mL容量瓶中。此溶液浓度约为1mg/mL。将溶液转移至试剂瓶中后，在-20℃下避光保存。临用前进行浓度校准（校准方法参见附录A.1）。10.4.2维生素K1标准中间液（10µg/mL）：取标准贮备液1.00mL，加甲醇定容至100mL容量瓶中。10.4.3维生素K1-D7同位素内标贮备溶液（100µg/mL）:称取1mg维生素K1-D7同位素内标，用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中。10.4.4维生素K1-D7同位素内标中间液（10µg/mL）:取维生素K1-D7同位素内标贮备液1.00mL，加甲醇定容至10mL容量瓶中。10.4.5标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素K1中间液10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、400μL，各加入K1-D7同位素内标中间溶液50μL，加甲醇定容至10.00mL，此标准系列工作液维生素K1浓度分别为10μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L，200μg/L，400μg/L。11仪器和设备11.1匀浆机。11.2高速粉碎机。11.3组织捣碎机。11.4涡旋混合器。11.5恒温水浴振荡器。11.6pH计：测量精度±0.02。11.7天平：感量0.01g和0.00001g。11.850mL具塞PVC离心管。11.9离心机：转速≥6000r/min。11.10定量移液管：5.0mL，10.0mL，20.0mL。11.11玻璃试管：10mL。11.12旋转蒸发仪。11.13氮吹仪。11.14超声波震荡器。11.15一次性微孔滤头：带0.22μm微孔滤膜。11.16液相色谱-质谱联用仪：带电喷雾离子源；质量范围：1质荷比（m/z）-2000质荷比（m/z）；分辨率：0.1原子质量单位（AMU）。11.17色谱分离柱：C18柱2.1mmX50mm,粒径1.8μm，或相当者。12分析步骤12.1试样制备※注：将一定数量的样品按要求经过粉碎、均质、缩分后，储存于样品瓶中，避光冷藏。12.2试样处理处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。12.2.1婴幼儿食品和乳品、植物油12.2.1.1酶解准确称取经均质的试样1~5gg（精确到0.1mg,维生素K1含量不低于0.2µg）于50ml离心管中，加入25μL维生素K1-D7内标溶液，加入5ml温水溶解（液体样品直接吸取5mL稀释到15mL，植物油不需加水稀释），加入5mL磷酸盐缓冲液，混匀，加入0.2g脂肪酶，高淀粉样品需加入0.2g淀粉酶。涡旋均质后于37℃±2℃恒温水浴振荡器中振荡2h，使其充分酶解。12.2.1.2提取取出酶解好的试样，分别加入10mL乙醇及1gK2CO3，混匀后加入10mL正己烷，涡旋提取10min，5000rpm离心3min，转移上清液至另一50mL离心管中，向下层液再加入10mL正己烷，涡旋5min，5000rpm离心3min，合并上清液，正己烷(10.1.7)定容至25mL，待净化。12.2.1.3净化在上述提取液中加入20mL水，涡旋0.5min，静止分层后，分取5mL上清液于10mL的玻璃试管中，氮吹至干，加入1mL甲醇溶解，用0.22µm滤膜过滤，滤液待进样。12.2.2水果、蔬菜样品12.2.2.1提取准确称取1~2g（精确到0.1mg，维生素K1含量不低于0.2µg）经均质匀浆的蔬菜或水果样品于50ml离心管中，加入25μL维生素K1-D7内标溶液(10.4.4)，涡旋混匀后加入5mL异丙醇，涡旋1min，超声5min，加入10mL正己烷并涡旋振荡提取3min，7000rpm转速离心5min，移取上清液，向下层溶液中加入10mL正己烷并涡旋2min，合并上清液，正己烷定容至25mL，待净化。12.2.2.2净化分取上清液1~5mL至10ml试管中，氮气吹干，加入1mL正己烷溶解，将该样品溶液转移至预先用5mL正己烷活化的中性氧化铝层析柱中，待样品溶液流至近干时，用5mL正己烷淋洗后，用6mL正己烷-乙酸乙酯溶液洗脱至10mL试管中，氮气吹干后加入1mL甲醇，过0.22um滤膜，滤液供分析测定。12.3色谱参考条件色谱柱：C18柱2.1mmx50mm,粒径1.8μm；流动相：甲醇（0.025%甲酸+2.5mmol/L甲酸铵,含1%的水），流动相流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：5uL。12.4质谱参考条件质谱条件：电喷雾（ESIwithAgilentJetStream）正离子扫描方式；鞘气温度：375℃；鞘气流速：12L/min；喷嘴电压：500V；雾化器压力：25psi；毛细管电压：4500V；干燥气温度：325℃；干燥气流速：10L/min；多反应监测（MRM）模式。锥孔电压和碰撞能量见表1。标准质谱图见附录A表1MRM分析的质谱参数 化合物 Ion（m/z） Fragmentor(V) dwell（s） Collisionenergy（eV） 维生素K1 451/187 155 50 23 451/227 155 50 22 维生素K1-D7 458/178 138 50 30 458/194 138 50 2312.5定性试样中目标化合物色谱峰的保留时间与标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5％之内。待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10（S/N≥10）。每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表1规定的范围。表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% ＞20%至50% ＞10%至20% ≤10% 允许相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50%各检测目标化合物以保留时间和两对离子的（特征离子对/定量离子对）所对应的LC-MS/MS色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于20%），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子对应LC-MS/MS色谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致。12.6空白试验不称取试样，按12.2的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。13结果计算13.1标准曲线绘制将标准系列溶液由低到高浓度进样检测，以维生素K1色谱峰与内标色谱峰的峰面积比值-浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数应大于0.99。13.2定量测定待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应减少取样量重新按5.2和5.3进行处理后再进样分析。13.3计算按式（1）计算维生素K1的量。··································································（2）式中：X——试样中维生素K1的含量，单位为微克每千克，µg/100g；A——根据试样中维生素K1的色谱峰与对应内标色谱峰的峰面积关系，经计算所得的浓度，单位为纳克每毫升，ng·mL-1；m——试样的称样量，单位克，g；V1——提取液总体积，单位毫升，mL；V2——分取的提取液体积（婴幼儿强化食品V1=V2），单位毫升，mL；V3——定容液的体积，单位毫升，mL。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示。计算结果保留三位有效数字。14精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15其他本方法的检出限：婴幼儿食品和乳品、植物油、果蔬样品，当取样量为1g时，检出限为2.8µg/100g。本方法的定量限：婴幼儿食品和乳品、植物油、果蔬样品，当取样量为1g时，定量限为9µg/100g。附录A维生素K1标准浓度校正方法维生素K1标准溶液配制后需要对其浓度进行校正，具体操作如下：取维生素K1标准储备溶液1.00mL，用N2吹干甲醇后，用正己烷定容至100mL，按给定波长测定吸光值，以正己烷为空白，用1cm的石英比色杯在248nm波长下测定吸收值，标准储备液（3.4.1）的质量浓度按公式（3）计算，测定条件见表A.1。表A.1维生素K1吸光值的测定条件 标准 比吸光系数 波长λ（nm） 维生素K1 419 248计算公式如下：……………………………………（3）式中：—维生素K1标准储备液浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；—标准校正测试液在248nm波长下的吸收值；；419—在248nm波长下的百分吸光系数，即在248nm波长下，液层厚度为1cm时，浓度为1%的维生素K1正己烷溶液的吸光度（系数“419”同BSEN14148-2003和AOACOfficialMethod999.15）100—稀释因子。附录B高效液相色谱参考图B．1维生素K1标准溶液色谱图见图B.1图B.1维生素K1标准溶液色谱图B.2奶粉中维生素K1测定色谱图见图B.2图B.2奶粉中维生素K1测定色谱图B.3橄榄油中维生素K1测定色谱图见图B.3图B.3橄榄油中维生素K1测定色谱图B.4菠菜中维生素K1测定色谱图见图B.4图B.4菠菜中维生素K1测定色谱图1附录C质谱参考图C.1维生素K1质谱图见图C.1图C.1维生素K1质谱图C.2VK1和VK1-D7的MRM谱图见图C.2图C.2VK1和VK1-D7的MRM谱图C.3葡萄样品中的VK1和VK1-D7的的MRM图见图C.3图C.3葡萄样品中的VK1和VK1-D7的的MRM图