高效液相色谱法测定1_3_丙二醇发酵液中的有机酸

高效液相色谱法测定 1, 3-丙二醇发酵液中的有机酸 牟 英1 王元好1 修志龙* 1 王龙星 2 肖红斌 2 1 (大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系,大连 116024) 2 (中国科学院大连化学物理研究所, 大连 116023) 摘 要 采用高效液相色谱法在 Krom asilC18色谱柱 ( 5 Lm, 250 mm @ 416 mm .i d. )上测定了 1, 3-丙二醇发酵 液中的有机酸, 流动相为 012% ( V /V )磷酸和乙腈混合溶液 (体积比为 961 5B315) ,发酵液经氯仿处理后直接 分离定量, 8 m in内可将发酵液中的甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸及延胡索酸完全分离定量。流动相流速 为 11 0 mL /m in,紫外检测波长为 214 nm,柱温为 20e 。方法的回收率为 9717% ~ 1001 5% ; RSD为 0198% ~ 21 35%。实验结果表明,该法是测定发酵液中有机酸的快速、有效的定量分析方法。 关键词 反相高效液相色谱,有机酸, 1, 3-丙二醇,发酵液 2005-12-28收稿; 2006-03-10接受 本文系国家自然科学基金 ( No. 20176005 )、科技部 / 十五 0科技攻关计划 ( N o. 2004BA713B06-03 ) 和 / 9730计划项目 ( No. 2003CB716000)基金资助 1 引 言 1, 3-丙二醇 ( 1, 3-PD)可应用于油墨、涂料、抗冻剂、保护剂以及医药等行业,可以作为生产优质的聚 酯和聚氨酯的单体,因此具有广阔的应用前景 [ 1]。 在 1, 3-PD发酵过程中,生成 1, 3-PD的同时还有其它一些有机酸生成。对有机酸的分析可以比较 直观地了解菌种代谢途径,对于确定菌体内的代谢通量分布、从代谢工程角度实现菌体生理代谢网络途 径的优化或阻遏以改变代谢流、发酵过程的优化控制以及 1, 3-PD高产基因工程菌株的构建都具有重要 意义。用于分析有机酸的方法有色谱法、薄层色谱法 [ 2]和气相色谱法 [ 3 ] ,但这些方法都要进行衍生化 处理,操作麻烦。而高效液相色谱法 (HPLC )分析有机酸不仅简单快速, 而且选择性好、准确度高 [ 4]。 B lanco等 [ 5]采用液相色谱法分析酒中有机酸; D ing[ 6 ]和牟世芬 [ 7]用离子色谱法测定了酒和饮料中的有 机酸; C accamo等 [ 8 ]采用衍生化液相色谱法分析酒中有机酸; Daood等 [ 9]以四丁基氢氧化铵作离子对试 剂,分析了果汁和蔬菜中的有机酸。衍生化法和添加离子对试剂都使操作变得繁琐, 而专门的有机酸柱 价格又较昂贵。白冬梅等 [ 10 ]采用 Ec lipse XDB-C8柱,对琥珀酸发酵液中有机酸进行了测定, 415m in可 以把 6种混合酸标样分离定量, 分析速度快,重现性也较好。但从得到的样的色谱图可以看出, 峰 拖尾严重而且未能达到基线分离,甲酸和苹果酸的出峰时间都在 2 m in内, 这样会造成在分析复杂的发 酵液样品时受到其他组分的干扰,而且在分析实际样品时,只得到两种有机酸的含量, 信息量较少。本 实验选用普通的 K romasil C18色谱柱,对以前的高效液相色谱法 (多采用硫酸或磷酸缓冲体系 )进行了改 进,在磷酸缓冲液中添加了适量乙腈,建立了测定 1, 3-PD发酵液中有机酸的方法, 8 m in内将发酵液中 6种有机酸完全分离定量,分析速度快,精密度高,重现性好。 2 实验部分 2. 1 仪器与试剂 LC-1100高效液相色谱仪,含 G1313A自动进样器、G1311A四元泵、G1314A VWD检测器、G1316A 柱温箱、1100化学工作站 (美国 Ag ilent公司 ) ; SK2200H超声清洗器 (上海科导超声仪器有限公司 ); LG16-W离心机 (北京医用离心机厂 ); GM-0. 15Ⅱ隔膜真空泵 (天津市腾达过滤器件厂 ); Jasco V-560紫 外可见分光光度计。HPLC级乙腈 ( Burd ick& Jackson, USA ); 磷酸 (沈阳市试剂一厂 ); 氯仿 (天津市天 河化学试剂厂 ); 甲酸 (辽宁省医药经贸公司试剂厂 ) ;乙酸 (天津科密欧化学试剂开发中心 ) ;柠檬酸、琥 珀酸 (沈阳市试剂三厂 ) ;延胡索酸 (北京金龙化学试剂有限公司 ), 除乙腈外,所用试剂均为分析纯。实 第 34卷 2006年 9月 分析化学 ( FENXIHUAXUE) 研究简报 Ch inese Journa l o f Ana ly tica l Chem istry 特刊 S183~ S186 验用水为超纯水。 2. 2 流动相的配制 量取 H 3PO4 2mL,用超纯水定容至 1000 mL,用 0145 Lm孔径的合成纤维素滤膜进行真空抽滤, 再 经超声波脱气即可用作流动相。 2. 3 有机酸标准混合液 精确称取一定量的甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸和延胡索酸, 用上述流动相配制成有机酸标准 溶液, 经过稀释, 得到有机酸标准混合液,浓度为甲酸 2186 g /L,乳酸 2156 g /L, 乙酸 5132 g /L,柠檬酸 5144 g /L, 琥珀酸 5157 g /L,延胡索酸 01073 g /L。 2. 4 样品预处理 取经离心 ( 12000 r /m in, 20m in)除去克雷伯氏菌体的 1, 3-PD发酵液,加入等体积氯仿,离心除去发 酵液中蛋白,进行适当稀释,然后以 0122 Lm孔径的滤膜过滤,即得到待测样品。 2. 5 色谱分析条件 色谱分析柱 K romasil C18, 250 mm @416mm .i d. , 5 Lm (中国科学院大连化学物理研究所 ); 流动相 A如 212所述, B为乙腈, A BB= 9615B315 ( V /V ) , 等度分离; 紫外检测波长: 214 nm; 流动相流速: 110mL /m in; 柱温: 20e 。 3 结果与讨论 3. 1 分析条件的选择 3. 1. 1 检测波长的选择 用紫外分光光度计分别对标准有机酸溶液进行扫描,发现有机酸的紫外吸收 大多在 214 nm左右,而磷酸缓冲溶液在紫外区几乎无吸收,故选用此波长为检测波长。 3. 1. 2 分离条件的选择 乙腈-水系统和磷酸缓冲系统是在十八烷基柱中应用较多的流动相。而后者 适于分析有机酸。本实验流动相选择磷酸溶液与乙腈体系,甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸分离效果很好, 完 全达到了基线分离,琥珀酸和延胡索酸稍差。但如果增加流动相中乙腈含量使它们完全分开,前面的乳 酸和乙酸就会部分重合。所以,确定磷酸溶液与乙腈体积比为 9615B315。在同样色谱条件下, 在 Intersil ODS3( 250mm @ 416 mm .i d. )柱上也实现了 6种有机酸的良好分离。 3. 1. 3 柱温的选择 有机酸在水溶液中存在离解平衡 HA = H + + A -。当温度升高时, 会增加溶质的 图 1 有机酸标准混合液与发酵液的液相色谱图 F ig. 1 Chrom atog ram o f standa rd organ ic ac id and ferm entation bro th a.有机酸标准混合液 ( s tandard organ ic acid) ; b. 发酵液 ( ferm en tation broth) ; 1. 甲酸 ( form ic acid ); 2.乳酸 ( lactic acid) ; 3.乙酸 ( acet ic acid) ; 4.柠檬酸 ( citric acid ) ; 5.琥 珀酸 ( succin ic acid) ; 6.延胡索酸 ( fum aric acid)。 离解, 离子受 DONNAN作用, 导 致保留时间减少 [ 11] , 不利于有机 酸的分离。但温度超过 20e 时, 琥珀酸和延胡索酸难以分开。所 以,实验选择柱温 20e , 色谱图见 图 1。 3. 2 回归分析与检出限 采用自动进样器分别吸取混 标 110、210、410、610、810、1010 和 20 LL, 在上述色谱条件下进 样,线性回归处理峰面积 y和有 机酸含量 x ( Lg ), 得到 6种有机 酸的标准曲线方程, 6种有机酸相关系数都在 0199999~ 1之间,说明线性关系良好。表 1列出了回归 分析结果以及检出限,以 3倍信噪比 ( S /N )计算最小检出限量, 6种有机酸的检出限都较低。其中延胡 索酸最低,因为它分子中含有两个碳碳双键,所以检测的灵敏度较高。 3. 3 精密度测定 本方法对 1, 3-PD发酵液进行定性定量分析 5次, 结果见表 2。从表中可以看出, 6种有机酸的相对 184 分 析 化 学 第 34卷 标准偏差 ( RSD, % )都小于 215%, 说明这种分析方法是可靠的。 表 1 回归分析和检出限 Table 1 Regress ion equation, linear range and de tection lim it 有机酸 O rgan ic acid 回归方程 Regress ion equat ion 相关系数 Correlat ion coefficien t(R ) 线性范围 L inear range( Lg) 检出限 D etect ion lim it( ng) 甲酸 Form ic acid y= 1. 67548+ 51. 57925x 1 2. 86~ 57. 15 5. 82 乳酸 Lact ic acid y= 7. 84968+ 119. 20901x 1 2. 56~ 51. 17 2. 52 乙酸 A cetic acid y= - 39. 26378+ 31. 79417x 0. 99927 5. 32~ 102. 32 9. 44 柠檬酸 C itric acid y= 11. 50014+ 61. 53346x 0. 99999 5. 44~ 108. 84 4. 88 琥珀酸 Succin ic acid y= 20. 90137+ 25. 00677x 0. 99959 5. 57~ 111. 39 12. 00 延胡索酸 Fumaric acid y= - 68. 69139+ 9464. 84763x 0. 99994 0. 07~ 1. 47 0. 03 表 2 精密度实验结果 ( n= 5) Table 2 P rec ision of determ ination( n = 5) 有机酸 O rgan ic acid 1 2 3 4 5 X RSD(% ) 甲酸 Form ic acid 738. 5 741. 0 735. 5 732. 5 737. 5 737. 0 1. 43 乳酸 Lact ic acid 368. 5 370. 5 367. 5 363. 0 363. 5 366. 6 1. 45 乙酸 A cetic acid 1789. 5 1795. 5 1790. 0 1790. 5 1794. 5 1792. 0 1. 24 柠檬酸 C itric acid 648. 0 650. 0 642. 0 645. 0 642. 0 645. 4 1. 60 琥珀酸 Succin ic acid 355. 0 357. 0 361. 0 358. 0 358. 5 357. 9 0. 98 延胡索酸 Fum aric acid 1352. 5 1362. 5 1349. 5 1350. 0 1353. 0 1353. 5 2. 35 表 3 有机酸的回收率测定结果 Table 3 Recovery study o f organ ic ac ids 有机酸 O rgan ic acid 本底值 Background (Lg) 加入量 Added ( Lg) 计算值 C a.l ( Lg) 制得量 Found ( Lg) 回收率 Recovery (% ) 平均回收率 Average recovery(% ) 甲酸 2. 876 100. 1 Form ic acid 1. 402 1. 4710 2. 8732 2. 888 100. 5 100. 3 2. 882 100. 3 乳酸 0. 3392 100. 5 Lact ic acid 0. 1582 0. 1792 0. 3374 0. 3405 100. 9 100. 4 0. 3365 99. 7 乙酸 6. 348 99. 9 A cetic acid 3. 376 2. 977 6. 352 6. 352 100. 0 100. 0 6. 366 100. 2 柠檬酸 1. 0580 99. 7 C itric acid 0. 2991 0. 7619 1. 0610 1. 0630 100. 2 100. 1 1. 0638 100. 3 琥珀酸 1. 368 97. 4 Succin ic acid 0. 6249 0. 7798 1. 4047 1. 370 97. 6 97. 7 1. 380 98. 2 延胡索酸 0. 0295 100. 8 Fum aric acid 0. 0145 0. 0148 0. 0293 0. 0296 101. 2 100. 7 0. 0294 100. 1 3. 4 有机酸的回收率测定 取同一发酵液样品 2份,其中一 份作本底,另一份添加一定量的 6种 有机酸标准品溶液后测定各成分含 量,每份样品进行 3次平行测定, 考 察方法的回收率,结果见表 3。 从表 3可以看出, 6种有机酸的 回收率在 9717% ~ 10014%之间,说 明方法的准确度较高,重现性较好。 3. 5 1, 3-PD发酵液中有机酸分析 分别对厌氧批式流加发酵不同 时间的发酵液进行了分析, 图 2是 各有机酸的浓度曲线。从图 2可见, 6种有机酸含量随发酵时间变化趋 势大致相同,都是随发酵时间增加而 增加。乙酸、琥珀酸和乳酸在发酵过 程中有一定程度的积累,乙酸和琥珀 酸最高都达到了 10 g /L左右, 乳酸 浓度也较高, 达到了 8 g /L, 甲酸稍 低,接近 3 g /L,而柠檬酸和延胡索酸 浓度最低,不到 1 g /L。从克雷伯氏菌利用甘油生产 1, 3-PD的代谢途径 [ 12 ]可以看出,乙酸的产生伴随 有 ATP生成,这对 1, 3-PD生成是有利的。而琥珀酸的产生伴随有 ATP生成同时消耗了 NADH, 乳酸生 成也消耗了 NADH, 所以不利于 1, 3-PD生产。若要提高 1, 3-PD产量, 应阻断或减弱流向琥珀酸和乳酸 的代谢流,但它们也是重要的化工原料。如果能增强流向它们的代谢流,达到利用克雷伯氏菌来生产它 们的目的,也具有很大的现实意义,这些都为菌种选育工作提供了参考。 综上所述,采用 K rom asil C18色谱柱, 8 m in内即可把 1. 3-PD发酵液中 6种有机酸完全分离定量,灵 敏度高、分析速度快、准确度高和重现性好。 185特 刊 牟 英等:高效液相色谱法测定 1, 3-丙二醇发酵液中的有机酸 图 2 厌氧批式流加发酵各有机酸浓度曲线 F ig. 2 Concentration of organ ic acids in fed-batch ferm en ta- tion under anaerob ic cond ition 1.乙酸 ( acet ic acid) ; 2. 琥珀酸 ( su ccin ic acid ) ; 3. 乳酸 ( lact ic acid) ; 4.甲酸 ( form ic acid) ; 5.柠檬酸 ( citric acid) ; 6.延胡索酸 ( fum aric acid)。 References 1 X iu Zhilong (修志龙 ). 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The form ic acid, lactic acid, acetic acid, citric ac id, succinic acid and fumaric acid w ere complete ly separated and determ ined in 8 m inutes. The flow rate ofmobile phase w as 110 mL /m in and the co lumn temperature w as 20e . The detect ion w avelength w as 214 nm. The reg res- sion equation, the linear range, the corre lation coefficient and detection lim it of the standard curves w ere determ ined. The re lative standard deviat ion ( RSD, n= 5) w as in the range of 110% - 214%, and the average recoveries o f themethod ranged from 9717% to 10015% . Themethod w as proved to be a rapid, effective w ay to determ ine the organ ic acids in 1, 3-propanediol fermentation broth. Keywords R eversed phase high perfo rmance liqu id chromatography, organic ac ids, 1, 3-propanedio,l fermentation broth ( Received 28 D ecem ber 2005; accep ted 10M arch 2006 ) 186 分 析 化 学 第 34卷