BMB 实验室苏云金芽胞杆菌伴胞晶体和晶体蛋白的制备

BMB 实验室苏云金芽胞杆菌伴胞晶体和晶体蛋白的制备 一、胞晶混合物和伴胞晶体的制备 按下述方法制备的样品可用于生物测定,提取晶体蛋白和SDS-PAGE 电泳等。主要适用 于苏云金芽胞杆菌库斯塔克和苏云金等亚种的伴胞晶体或130-140kDa 晶体蛋白,如 HD-1,HD-2,HD-73,CT-43 等菌株。 (一) 胞晶混合物的制备 1.菌体的培养 用PM 或LB 液培养基于30℃培养2-3 天(至芽胞完全脱落)。注意:这是至关重要的一步。一定要让菌体生长充分,在油镜下观察99.9%的细胞形成芽胞(石碳酸复红染色),也就是要求清晰的看到只存在芽胞和伴胞晶体,不能看见或只能极少看见营养体细胞。苏云金芽胞杆菌是好氧细菌,在其生长过程中一定要保证充足的供氧条件,否则芽胞形成会不顺利、不完全,导致晶体形成不发生或不彻底,从而严重影响后续操作。例如,在用500ml 的三角 瓶培养时,装量在50-100ml 之间、瓶口用8 层纱布扎、摇床转速在220rpm 或以上可较好 保证通气要求。 2.胞晶混合物的制备 收集培养物,0.5 mol/L NaCl 洗涤三次,无菌水再洗三次(3500rpm.20min, or 5000-6000rpm 5min。离心时间和转速的设定以能将晶体和芽胞沉淀下来为准,离心时间不要太长)。注意:在保证菌体生长充分的情况下,此时培养物中的颗粒成分就只有芽胞和伴胞晶体,离心过程中只有它们才会沉淀。在洗涤过程中,若出现漂浮物或粘性成分,尽量将其除去。总的原则是,对颗粒状的晶体和芽胞进行洗涤,去除细胞碎片和细胞溶解物等,将纯净的晶体和芽胞保留下来。 (二) 伴胞晶体的制备 伴胞晶体的纯化有很多方法,如双相法,密度梯度离心法等(此处不列文献,感兴趣 者自查)。这些方法相对繁琐,此处一般不推荐使用,除非研究伴胞晶体的形态和结构,或单纯检测纯晶体的毒力。因为在晶胞混合物中,芽胞在许多生化条件下是惰性的,易于通过离心去除。如果只需使用晶体蛋白,如用于纯化晶体蛋白或用SDS-PAGE 检测晶体蛋白的分 子量,可将上述提纯的晶胞混合物用作伴胞晶体。 二、晶体蛋白的制备 1.伴胞晶体的溶解 伴胞晶体或胞晶混合物(2~10mg/ml)用50mmol/L Na2CO3-HCl(5%2-巯基乙醇,pH9.5) 充分悬浮,37℃保温1 小时。离心(3500rpm 20min 或5000rpm 5min 或10000rpm 1min),去沉淀(去除不溶解的伴胞晶体和芽胞)。上清液即为晶体蛋白溶液的初制品。 注意:这种溶解方法适用于常见的130kDa 晶体蛋白(即Cry1A 或cry1 晶体蛋白,其 它类型的晶体蛋白不保证适用)。对于初学者,建议用SDS-PAGE 检测上清夜和沉淀的蛋白质组成。即,将沉淀用ddH2O 或Na2CO3-HCl 洗涤后(去除溶解的晶体蛋白),用等体积的 Na2CO3-HCl 悬浮沉淀,分别取100ul 上清夜和沉淀悬浮液,分别与等体积SDS-PAGE 的2xloading buffer 混合,98-100℃ 2min。离心后可直接run SDS-PAGE。电泳后会发现, 伴胞晶体中的65kDa 晶体蛋白是不溶解的,其溶解可在50mmol/L Na2CO3-HCl(pH10.5)条件下进行。 2.晶体蛋白的浓缩沉淀 上述晶体蛋白上清液,滴加4mol/L Na2Ac-HAc(pH4.4),约1/20 体积。离心,去上清, 沉淀用去双蒸水洗三次(洗去Na2Ac-Hac)。注意:在滴加过程中可见沉淀物出现,滴加至不再出现更多的沉淀。如果此时的蛋白沉淀能满足需要,可立即离心收集蛋白沉淀,这样的蛋白相对纯度较高。如果需要更多的蛋白,可于4℃静置1hr 或过夜,再离心。 3.晶体蛋白溶液 4.再用50mmol/L Na2CO3-HCl (pH9.5)溶解上述蛋白沉淀,离心(沉淀为少量变性蛋白 和杂质),上清液即为可溶性晶体蛋白。 三、晶体蛋白的酶解 1.首先获得晶体蛋白溶液,最好测定蛋白质含量。 2.按胰蛋白酶:晶体蛋白=1:50 (或根据情况调整),加如胰蛋白酶溶液,37℃处理30 -60min。建议用SDS-PAGE 检测酶解前后的变化。对于130kDa 的Cry1A 蛋白来说,酶解后变成60kDa 的蛋白(电泳检测为纯净蛋白,无杂蛋白);对于140kDa 的Cry1B 蛋 白来说,酶解后变成66kDa 和55kDa 两种蛋白,随着酶解时间的延长,66kDa 蛋白逐渐消失,变成55kDa 蛋白。 3.晶体蛋白的酶解产物可象晶体蛋白一样作浓缩沉淀。 四、培养基 LB:1.0%蛋白胨,0.5%酵母粉,0.5%NaCl,pH7.0-7.2。该培养基对部分菌株不 利于形成芽胞和晶体。 PM:1.0%蛋白胨,0.5%葡萄糖,0.2%酵母粉,0.1%KH2PO4,0.03%MgSO4·7H2O, 0.002%FeSO4·7H2O,0.002%ZnSO4·7H2O,0.002%MnSO4,pH7.2(配制时,可 将微量元素单独混合配成高浓度母液(如100 倍),过滤除菌或低压灭菌(如8 磅); 葡萄糖也应单独低压灭菌)。该培养基对大多数菌株有很好效果。 BP:0.5%蛋白胨,3%牛肉膏,0.5%NaCl,pH7.0-7.2。该培养基为旧时配方,由于配 制不便,现多用LB 取代。AMP 使用浓度:100ug/ul,取0.1g Amp 粉末加1ml 灭菌水配成 100mg/ml,用时稀释1000 倍。 Cm 使用浓度:20-30ug/ml,取0.02-0.03g Cm 加1ml 无水乙醇配成20-30mg/ml,用时稀释1000 倍。 RNAase 母液配法:20mg/ml,将胰RNA(RNA 酶A)溶于10mM Tris-cl(pH7.5)、15mM Nacl 中,配成20mg/ml 浓度,于100 度加热15-30 分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20 度,用时稀释1000 倍,使用浓度为20ug/ml。 溶菌酶配法:50mg/ml,用10mM Tris-cl(pH 8.0)溶解溶菌酶配成。 10mM Tris-cl:1.211g/L 用浓盐酸调至pH 8.0。