triton x-100法制备牛颈静脉脱细胞血管支架

triton x-100法制备牛颈静脉脱细胞血管支架 参考资料 ,,,,,, ,-,,,法制备牛颈静脉脱细胞血管 支架 作者:陆 军， 张镜方， 陈欣欣， 黄薇 作者单位:广东省人民医院 心外科， 医学研究中心， 广东 广州 510080 【摘要】 【目的】 研究经Triton X-100 脱细胞处理的牛颈静脉的组织结构和生物力学特性以及作为组织工程血管支架的可能性。【方法】 获取10条新鲜带瓣牛颈静脉，随机分为两组，新鲜对照组(n = 5)和脱细胞实验组(n = 5)，脱细胞组血管使用2.5 mL/L Triton X-100等进行脱细胞处理48 h， 病理切片染色和扫描电镜观察血管壁和瓣膜自身细胞的脱除情况和细胞外基质变化情况;生物力学性能检测血管组织强度变化;体外人内皮种子细胞种植以了解脱细胞支架的生物相容性。【结果】 脱细胞处理后，管壁和瓣膜的自身细胞完全脱除而弹力纤维和胶原纤维无明显改变;与新鲜牛颈静脉相比，脱细胞血管的拉伸强度[(16.5 ? 2.61)MPa vs (15.5 ? 3.1)MPa; P > 0.05] 和最大持线力[(7.9 ? 0.9)N vs (7.0 ? 1.1)N; P > 0.05]无明显改变，在100 mm Hg液压下脱细胞血管无异常扩张;内皮种子细胞在脱细胞血管支架上生长黏附良好。【结论】 Triton X-100法对新鲜牛颈静脉进行脱细胞处理效果良好，脱细胞牛颈静脉可作为细胞种植的血管支架使用。 【关键词】 牛颈静脉;脱细胞支架;组织工程;细胞种植 Bovine Jugular Vein Decellularized with Triton X-100 as a 专业 专心 专注 参考资料 Potential Scaffold for Vascular Tissue Engineering LU Jun， ZHANG Jing-fang， CHEN Xin-xin， HUANG Wei (Department of Cardiovascular Surgery， Research Center of Medical Sciences， Guangdong Provincial People's Hospital， Guangzhou 510080， China) Abstract: 【Objective】To study the composition and strength of bovine jugular vein decellularized with Triton X-100 and to determine its potential as a vascular tissue-engineering scaffold. 【Methods】 Fresh bovine jugular veins (n = 10) were obtained and divided into two groups (n = 5) at random， the fresh group and the decellularized group， specimens in decellularized group were treated with 2.5 mL/L Triton X-100 and sodium-deoxycholate for 48 h. Residual cells and extracellular matrix composition were studied with light and electron microscopy. The strength of graft was measured in vitro by insufflation and pull-through techniques. Decellularized specimens were seeded with human endothelial cells and cultured for 7 d. 【Results】 2.5 mL/L Triton X-100 together with sodium-deoxycholate completely removed native bovine cells. Collagen morphology and elastin staining appeared unchanged. Compared with fresh bovine jugular vein， decellularized vein had similar in vitro tensile stress [(16.5 ? 2.6)MPa vs (15.5 ? 3.1)MPa; P > 0.05] and suture-holding strength [(7.9 ? 0.9)N vs (7.0 ? 1.1)N; P > 0.05]， and had no abnormal dilation under 100 mm Hg intraluminal 专业 专心 专注 参考资料 pressure. Endothelial cells attached to acellular specimens and grew well. 【Conclusion】 Bovine jugular vein rendered acellular with Triton X-100 presented an excellent scaffold for recellularization with human cells. Key words:bovine jugular vein; decellularized scaffold; tissue engineering; seeding 带瓣牛颈静脉作为移植管道材料近年来逐渐引起国内、外学 者重视[1，2]。戊二醛固定处理的牛颈静脉带瓣管道已逐渐商品化并 开始应用于临床[3]。但随着临床应用病例数的增多和随访时间的延 长，戊二醛固定处理的带瓣牛颈静脉的缺点逐渐显露，例如:宿主的 内皮细胞无法迁移生长;容易出现血栓、狭窄和炎性反应;另外，牛颈 静脉自身固有细胞残留还能诱发宿主移植免疫排斥反应，最终导致管 道钙化和衰败[4-6]。 最近的国内、外研究发现脱细胞的天然血管支架的细胞外基 质完整，可促进细胞黏附、生长，而且理化特性与天然血管相似[7-10]， 但关于牛颈静脉脱细胞处理的研究鲜见报道。国内吕卫东等[11]曾报 道联合使用5 mL/L Triton X-100 和0.25 g/L 胰蛋白酶等对新鲜牛颈 静脉进行脱细胞处理72 h，虽然管壁细胞完全去除但血管组织稳定性 明显下降。因此结合国内外研究经验，本研究采用2.5 mL/L Triton X-100和2.5 g/L 脱氧胆酸钠等对新鲜带瓣牛颈静脉进行脱细胞处理 48 h，制备血管基质支架，并在此基础上进行细胞种植，了解脱细胞 牛颈静脉的生物力学特性和组织相容性变化情况，为进一步动物体内 试验提供理论基础。 专业 专心 专注 参考资料 1 材料和方法 1.1 新鲜带瓣牛颈静脉获取 从当地菜牛屠宰厂获取新鲜带瓣牛颈静脉，尽量清洁条件下取出，浸泡在0 ?, 4 ?磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS，Gibco，USA)中运回，2 h内在无菌条件下剥除血管外膜，挑选管壁完整、内附1 , 2组瓣膜、长度8 cm的血管10条，使用PBS液反复冲洗5遍，保存在含有抗生素的4 ? PBS液中(青霉素100 kU/L，链霉素0.1 g/L， Gibco， USA)。 1.2 血管脱细胞处理 10条牛颈静脉分两组，脱细胞实验组和新鲜对照组，每组5根血管，分别放入50 mL无菌离心管(Corning， USA)中，脱细胞实验组:离心管内加入含2.5 mL/L Triton X-100(Sigma， USA)、2.5 g/L脱氧胆酸钠(Amresco， USA)、0.2 g/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，Gibco， USA)、0.1 g/L核糖核酸酶( ribonuclease， RNase， Sigma) 和0.2 g/L脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuc-lease，DNase，Sigma)的PBS液40 mL，脱细胞处理48 h，24 h换液1次;新鲜对照组:牛颈静脉仅使用PBS液浸泡，24 h换液1次。脱细胞过程在37 ?恒温摇床(SCS-24 Shaker， 上海市离心机械研究所)中持续振荡(200 r/min)完成。 1.3 病理组织学检查 脱细胞过程完成后留取两组血管的部分管壁和瓣膜使用100 mL/L福尔马林固定，石蜡包埋后切片，苏木素-伊红染色 专业 专心 专注 参考资料 (hematoxylin-eosin， HE染色)，光学显微镜下观察牛颈静脉自身细胞残留情况。细胞外基质中的胶原和弹力纤维分布排列情况则使用Verhoff-vonGieson染色(VG染色)结合Masson染色显示。 1.4 扫描电镜 两组血管的部分管壁和瓣膜用25 mL/L 戊二醛固定，逐步脱水，置换，临界点干燥，喷金，扫描电镜(Quanta 400，FEI company， Holland)观察管壁和瓣膜细胞脱落和纤维排列情况。 1.5 生物力学性能检测 将两组血管壁纵向裁剪成0.5 cm × 2 cm大小血管条，使用万能电子拉力机(Instron5566，USA)测量两组血管条(n = 10)的纵向拉伸强度(tensile stress)。将4-0 聚丙烯滑线(prolene， Ethicon Inc， USA)缝于同样大小的血管条边缘，边距约2 mm，同样使用万能电子拉力机测量两组血管条(n = 10) 纵向最大持线力(suture-holding strength)。两组完整血管截取4 cm长行注水试验，近端插管，灌注充满PBS液，远端阻断钳封闭，使用冠状动脉球囊扩张测压装置(ACS Indeflator，USA)和压力换能装置连接心电监护仪，测量100 mm Hg压力下两组血管(n = 5)的直径变化，同时观察有无渗漏情况。 1.6 血管支架细胞种植试验 将脱细胞牛颈静脉纵向剪开，PBS液反复冲洗3遍，使用特制的圆形刀具将牛颈静脉壁裁剪成12个直径1 cm的血管圆片，管腔面向上放入24孔细胞培养板(Corning，USA)中，每孔加入1 mL 含100 mL/L胎牛血清(fetal calf serum，FCS，四季青公司，杭州)的专业 专心 专注 参考资料 DMEM/F-12细胞培养液(Gibco， USA)并放入37 ?细胞培养箱中预衬24 h，然后吸去预衬液，将自人骨髓间充质干细胞诱导分化而来的内皮细胞[12]使用DMEM/F-12培养液消化吹打成密度为7 × 108个/L的细胞悬液，在放有血管圆片的12孔中每孔加入0.5 mL细胞悬液，调整最终种植全培养液为1 mL含100 mL/L FCS 、100 kU/L青霉素、0.1 g/L链霉素的DMEM/F-12培养液，放入37 ?、50 mL/L CO2、相对饱和湿度的培养箱中培养7 d，每两天换液1次。第7天取血管片固定，行常规HE染色和扫描电镜检查，观察种植细胞在血管片面的生长情况。 1.7 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件包处理数据。所得数据采用均数?差表示，采用t检验作统计分析，P < 0.05具有统计学意义。 2 结果 2.1 大体肉眼观察 脱细胞后的牛颈静脉泛白，管壁和瓣膜完整，内膜光滑，质地与新鲜牛颈静脉相比无明显变化。 2.2 牛颈静脉脱细胞情况 病理染色和扫描电镜显示，牛颈静脉管壁全层和瓣膜上自身细胞基本完全脱除， 未见明显细胞残留(图1)，组织结构紧凑， 无明显水肿。扫描电镜可见管腔面和瓣膜表面的内皮细胞脱除后其深层纤维组织裸露(图2)。 2.3 脱细胞后牛颈静脉胶原纤维和弹力纤维变化 专业 专心 专注 参考资料 光学显微镜下观察，新鲜牛颈静脉管壁细胞外基质主要由胶原和弹力纤维构成，约占50% , 60%以上，瓣膜细胞外基质主要由胶原纤维组成，约占90%以上，弹力纤维极少。脱细胞前后管壁的胶原纤维无明显变化，弹力纤维结构完整，瓣膜胶原纤维排列稍松散，但无明显断裂。 2.4 生物力学性能测试结果 注水前两组血管直径(n = 5)无明显差异[新鲜组(9.5 ? 0.4)mm vs 脱细胞组:(9.3 ? 0.4)mm; t = 0.669，P = 0.54];在管腔内液压为100 mm Hg时，两组血管膨胀，但均未出现渗漏情况，脱细胞血管与新鲜血管相比[新鲜组:(20.2 ? 2.1)mm vs 脱细胞组:(21.7 ? 2.2)mm;t = 1.108，P = 0.33]直径变化无显著性差异，并没有出现异常扩张(表1)。血管壁的拉伸强度[(16.5 ? 2.6)MPa vs(15.5 ? 3.1)MPa; t = 0.558，P = 0.59]和最大持线力[(7.9 ? 0.9)N vs(7.0 ? 1.1)N;t = 1.35，P = 0.21]在脱细胞前后无明显变化。 2.5 血管支架细胞种植试验 光学显微镜(图3)和扫描电镜(图4)显示内皮种子细胞在脱细胞血管支架表面生长良好，呈现铺路石状，形成一层连续生长的单细胞层，细胞间出现纤维连接。 3 讨论 3.1 脱细胞方法的选择 有多种方法可以使血管组织脱细胞，目前常用的脱细胞方法主要是酶消化法和除垢剂洗涤法。不同的脱细胞方法在支架细胞清除专业 专心 专注 参考资料 率、种子细胞黏附率及维持血管支架的生物力学特性等方面存在不同。Triton X-100 是一种非离子型表面活性剂，可以通过其分子上的亲水基团溶解细胞而达到清除血管壁细胞成分的目的。Samouillan等[13]研究发现使用Triton X-100 和胆盐处理瓣膜组织并不影响胶原和弹力纤维的结构稳定性。Kasimir等[14]研究也发现不同浓度的Triton X-100(2.5 mL/L和 5 mL/L)都可以完全清除猪主动脉管壁和瓣膜的内皮细胞，细胞外基质结构可以完整保留，但胰蛋白酶脱细胞法却可以严重破坏血管支架的基质结构。吕卫东等[11]使用Triton X-100 和胰蛋白酶相结合的方法对牛颈静脉进行脱细胞处理，也发现去细胞处理后牛颈静脉的组织稳定性明显下降。本试验前期研究曾经使用过两种脱细胞方法， 一种方法是单独使用0.5 g/L胰蛋白酶对新鲜牛颈静脉脱细胞处理24 h、48 h和72 h;另一种方法是联合使用0. 5 g/L胰蛋白酶和2.5 mL/L Triton X-100分别处理24 h，病理切片和扫描电镜检查发现这两种脱细胞方法虽然可使管壁和瓣膜表面的内皮细胞完全脱除，胶原纤维改变轻微，但管壁和瓣膜深层仍有大量牛自身细胞残留，而且弹力纤维破坏严重，管壁和瓣膜组织疏松。考虑到胰蛋白酶对组织结构的损害，再结合国内外文献资料[10，15-17]和自身前期实验结果，本研究摒弃胰蛋白酶，而采用2.5 mL/L Triton X-100 + 2.5 g/L脱氧胆酸钠 + 0.2 g/L EDTA + RNase + DNase的脱细胞方法，实验结果显示脱细胞效果满意而且血管支架的生物力学特性等无明显改变。 3.2 细胞外基质的保存 胶原纤维主要起到维持血管组织自身强度的作用，其中?型专业 专心 专注 参考资料 胶原纤维更有利于内皮细胞的黏附和生长，弹力纤维则负责血管的舒张和收缩，因此这两种纤维结构完整对于进一步的内皮种子细胞种植和组织工程血管的构建极其重要。Triton X-100法即能将新鲜牛颈静脉自身固有细胞完全清除又能较好维持细胞外基质结构完整，为内皮种子细胞种植提供了良好的脱细胞血管基质支架。 3.3 脱细胞血管生物力学特性的变化 适当的初始管壁强度对于构建心外移植管道来说非常重要，如果移植管道组织结构松散，不仅不利于手术缝合，而且会出现漏血或管道扩张，甚至迅速出现瘤状改变。本研究结果表明经过Triton X-100等处理48 h后牛颈静脉管壁强度并没有发生明显改变，这一结果也与胶原纤维和弹力纤维的形态学变化相一致。本实验之所以采用100 mm Hg液压测量有关数据，是因为脱细胞牛颈静脉主要作为重建右心室流出道的移植管道，而右心系统压力较低，所以100 mm Hg液压基本可以反映脱细胞牛颈静脉是否适合作为组织工程血管支架。由于牛颈静脉自身瓣膜窄小、菲薄，常规力学测量仪器无法对其相关组织强度数据进行测量，故本试验仅能根据其胶原和弹力纤维的情况推测其力学性能无明显改变，进一步关于管壁和瓣膜的生物力学性能研究将通过动物在体试验来完成。 3.4 脱细胞血管的生物相容性 内皮种子细胞在脱细胞牛颈静脉的管腔面生长黏附良好，表明经过Triton X-100等处理的脱细胞牛颈静脉生物相容性良好，Triton X-100等无残留毒性，适合内皮种子细胞种植。 专业 专心 专注 参考资料 综上所述，本研究认为:2.5 mL/L Triton X-100等对新鲜牛 颈静脉进行脱细胞处理的方法切实有效;使用上述方法获得的脱细胞 牛颈静脉的力学特性无明显改变而且能够进行细胞种植，这为下一步 体外动态细胞种植和动物体内实验提供了理论依据。 【参考文献】 胡盛寿，李守军，宋云虎，等. 国产牛颈静脉带瓣管道重建 右室流出道临床应用[J]. 中华胸心血管外科杂志，2005，21(6): 328-331. 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