5种蟋蟀的RAPD研究初报_直翅目_蟋蟀总科__cropped

5种蟋蟀的RAPD研究初报_直翅目_蟋蟀总科__cropped ()第 30 卷 第 2 期 Vol . 30 No . 2 自然科学版陕西师范大学学报 ( ) Journal of Shaanxi Normal U niversity Nat ural Science Editio n J un. 2002 2002 年 6 月 () 文章编号 :100123857 20020220091203 5 种蟋蟀的 RAPD 研究初报 ( 直翅目 :蟋蟀总科) 1 2 田英芳,郑哲民 ()1 西安交通大学医学院 , 陕西 西安 , 710061 ; 2 陕西师范大学动物研究所 , 陕西 西安 710062 摘 要 :应用 RA PD 技术对 5 种蟋蟀的基因组 DNA 进行扩增 ,从 10 种随机引物中 筛选出一种引物 S8 可以对 5 个种扩增出稳定且相异的 DNA 图谱 ,每个种的 DNA 扩增条带的相对分子质量为 : 长颚斗蟋 V . as pe rs us S8 - 1 900 , 1 510 , 1 320 , 830 ,740 ,370 ;小斗蟋 V . p a rv us S8 - 1 900 ,1 150 ,830 ,600 ,350 ;石首棺头蟋 L . equest ris S8 - 1 900 ,960 ,560 ;多伊棺头蟋 L . doeni t z i S8 - 1 900 ,800 ; 黄脸油葫芦 T . e m m a S8 - 1 490 ,1 290 ,1 180 . 结果明 ,引物 S8 可用于 5 种蟋蟀的分类鉴定. 关键词 : RA PD ; 蟋蟀 ; 昆虫分类 中图分类号 : Q966 文献标识码 : A ( ) 随机扩增多态性 DNA RA PD技术是 1990 年由 Williams 和 Wellsh 两个研究小组同时发 展起来的一项 DNA 分子水平上的大分子多态检测技术 . 由于其简便 、快速 、可在无任何分子 生物学背景下对物种的 DNA 进行多态性分析等特点 ,该技术被广泛应用于物种亲缘关系和 系统分类的研究 , RA PD 技术在昆虫分类方面的应用 ,已涉及鳞翅目 、同翅目 、鞘翅目 、直翅目1 ,3 等. 本文应用 RA PD 技术对 5 种蟋蟀进行分类鉴定. 1 材料与方法 1 . 1 实验材料表 1 实验材料 实 验 材 料 均 为 酒 精 浸 泡 Ta b. 1 L ist of spec ies and local ity of sa mples 标本 ,每种取 6 个个体进行实 属 名 种 名 采集时间 、地点 数量 验 ,由于蟋蟀雌性个体较难鉴 斗蟋属 长颚斗蟋 V . aspersus 1997 年 7 月 ,陕西石泉 6 ? V el a rif ietor us 小斗蟋 V . parv us 1997 年 8 月 ,陕西安康 6 ? 定 , 除 多 伊 棺 头 蟋 , 黄 脸 油 葫棺头蟋属 6 ? 石首棺头蟋 L . equest ris 1997 年 8 月 ,陕西西安 芦每个种取 2 个雌体进行雌雄 L ox oblem m us 多伊棺头蟋 L . doenitz i 1997 年 8 月 ,陕西西安 4 ?2 ? 油葫芦属 差异比较研究外 , 其余皆选雄 黄脸油葫芦 T . em m a 1997 年 8 月 ,陕西西安 4 ?2 ? Teleog ryl l us 性标本 ,数量 、产地见表 1 . 1 . 2 D NA 的提取 4 材料处理及实验方法参见田英芳等的方法. 收稿日期 :2001206209 () 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 3957010 () 作者简介 :田英芳 1972 - ,女 ,陕西澄城人 ,西安交通大学讲师 1 . 3 引物 本实验所用的引物为上海 Sago n 出品 ,引物序号为 S1,S5 ,S22 ,S83 ,S142 ,S283 . 1 . 4 RAPD 扩增反应 μμ( 反应总体积为 20 L ,其中 10 ×buffer 2 L 500 mmol/ L KCl 100 mmoL / L Tris2HCl p H ) ( ) μTrito n X - 100, Taq 酶 华美2 L , DNA 8 . 0 0 . 1 mmol/ L ED TA , 1 mmol/ L D T T 0 . 1 25,50 ng , PCR 仪为 P E - 9600 , 反应程序为 94 ?预变性 5 min , 94 ?变性 30s , 37 ?复性 1 min ,72 ?延伸 2 min ,共 45 个循环 , 完成最后一个循环后 , 72 ?延伸 10 min . 扩增产物用含 0 . 05 %溴化乙锭的 1 . 5 %的琼脂糖凝胶电泳 ,电泳缓冲液为 1 ×TB E ,恒压 2V/ cm , 电泳约 4 . 5 h ,紫外透射仪上观察拍照记录. 1 . 5 扩增产物相对分子质量的计算 ( ) ( ) 因随机引物扩增的 DNA 片段在电场中的迁移率 d 与相对分子质量 M 的对数成正比 , ( )λd = k lo g M ,所以 ,以相对分子质量 M DNA/ Eco R ?+ Hind ?作为标记 ,在半对数图纸 上作标准曲线 ,然后根据待测 DNA 片段的迁移距离 ,即可从标准曲线上查出其相对分子质量. 2 结果与讨论 10 条引物对 5 种蟋蟀的 RA PD 扩增中 ,不同引物扩出的带从 0,10 条不等 ,扩出的 DNA ( )片段在 320,2 500 bp 之间. 我们所使用的 10 条引物的扩增产物大致分为四种类型 : 1 5 对 种蟋蟀都无扩增或不能完全扩出 5 ( ) 个种 ; 2对 5 个种 皆 有 扩 增 图 谱 , ( ) 但 5 个种间的谱带差异不大 ; 3对 5 个种皆有扩增图谱 ,但种内变异太 () 大 ; 4对 5 个种皆 有 扩 增 图 谱 , 谱 带稳定 , 种间的 DNA 图谱的条带及 相对分子质量有很大差异 ,同种个体 具一定数目的共有谱带 ,同种不同个 体和性别之间的带型稍有差异 ,但明 () 显小于种间差异 如图 1. 10 条引物 中仅有 S8 的扩增图谱如此 , 去除种 内特 异 性 谱 带 , 同 种 个 体 仅 取 共 有 带 ,统计如下 :长颚斗蟋 V . A s pe rs us 图 1 引物 S8 对 5 种蟋蟀的扩增结果 S8 - 1 900 , 1 510 , 1 320 , 830 , 740 , Fig. 1 Amplificatio n of geno mic DNA of 370 ;小斗蟋 V . p a rv us S8 - 1 900 , 1five species using p rimer S8 λ150 , 830 , 600 , 350 ; 石 首 棺 头 蟋1 ,17 . DNA 相对分子质量标记 , DNA/ Eco R ?+ Hind ?; 16 . 阴性对照 ;2 ,3 . 长颚斗蟋 ,4 ,5 . 小斗蟋 ; L . equest ris S8 - 1 900 , 960 , 560 ; 多 6 ,7 . 石首棺头蟋 ;8 ,9 . 多伊棺头蟋 ?;10 ,11 . 多伊棺头蟋 ?;伊 棺 头 蟋 L . doeni t z i S8 - 1 900 , 12 ,13 . 黄脸油葫芦 ?;14 ,15 . 黄脸油葫芦 ?800 ; 黄 脸 油 葫 芦 T . e m m a S8 - 1 490 ,1 290 ,1 180 . 目前 ,分类研究最直接可靠的方法是对其 DNA 进行分析 ,而其中 RA PD 技术更受到普遍 1 () 重视. RA PD 反应使用单个寡聚核苷酸引物 10bp,对所研究的基因组 DNA 进行扩增反应 , ()田英芳 等 :5 种蟋蟀的 RA PD 研究初报 直翅目 :蟋蟀总科 93 第 4 期 多态性 ,所以这种扩增产物的多态性本身即可用于分类学研究和系统推测. 我们将 RA PD 技术用于西北地区常见的 5 种蟋蟀的分类鉴定 ,由于引物是随机选择的 , 与模板的结合也是随机的 ,不像常规 PCR ,引物按模板序列特定设计 ,所以会出现扩增类型 () 1的情况. 同时由于蟋蟀的种间必定存在亲缘关系 ,一定有同源序列 ,当引物与同源序列结合 () 时 ,5 个种扩增产物差异不大 ,会出现 2的情况. 另外 ,由于蟋蟀个体之间存在差异 ,当引物在 () 种内变异序列上有结合位点时 ,种内个体扩增谱带差异极大 ,会出现 3的情况. 当引物恰好在 种内同源序列上有结合位点时 ,扩增谱带表现为同种个体具一定数目的共有谱带 ,不同种间的 谱带数目及相对分子质量有很大差异 ,体现出了种内的一致性和种间差异 ,可用于种的鉴定.同时由于存在个体差异 ,种内不同个体和性别之间的谱带不可能完全相同 ,带型稍有差异 ,但 1 ,5 ,7 () 同种不同个体和性别之间的差异均小于种间差异 ,扩增类型 4的情况应属于此. 结果表 明 ,引物 S8 可用于 5 种蟋蟀的分类鉴定. 参考文献 : () 1 鲁亮 ,归鸿. RA PD 的技术特点及在昆虫分类中的应用 J . 昆虫学报 ,1995 ,38 1:117,122 .2 赵郁光 ,余传信 . 随机引物扩增多态性 DNA 聚合酶链反应技术用于蚊细胞的鉴定 J . 中国媒介生物学及 () 控制杂志 ,1993 ,4 6:401,406 . 3 Cha pco W N , Ashto n W , Martel R K B , et al . A feasibility st udy of t he use of rando m amplified polymorp hic DNA in t he pop ulatio n genetics and systematics of grasshoppersJ . Geno me , 1992 , 35 : 569 ,574 . ( ) 4 田英芳 ,黄 刚 ,郑哲民 ,等 . 一种简易的昆虫基因组 DNA 提取方法 J . 陕西师范大学学报 自然科学版, () 1999 ,27 4:82,84 . 5 Kambham pati S , Black IV W C , Kan K S. Rando m amplified polymorp hic DNA of mosquito species and () pop ulatio ns Dip tera : Culicidaetechniques , statistical analysis , and applicatio nsJ . J Med Emto mol , 1992 , () 29 6:939,945 . 6 L an M Y , Shen g W H , Huang C Q , et al . RA PD- PCR met hod for detecting DNA polymorp hism in Boop hilus () () microplus Acari : IxodidaeJ . S ystematic and Applied Acarology , 1992 , 1:11,14 . () 7 鲍小明 ,黄百渠 . 用 RA PD 技术鉴定两个小冰麦易位系 J . 遗传学报 ,1993 ,20 1:81,87 . 〔责任编辑 王 勇〕 Ran dom a mpl if ied pol ymorphic D NA in ()f ive spec ies of crickets Orthoptera : Gryll oidea 1 2T IAN Ying2f ang, ZH EN G Zhe2min ( 1 Medical School , Xi′an J iaoto ng U niversit y , Xi′an , 710061 Shaanxi , China ; ) 2 Instit ute of Zoology , Shaanxi No r mal U niversity , Xi′an , 710062 Shaanxi , ChinaAbstract : The RA PD p rotocols is first used to st udy t he geno mic DNA of 5 species of cricket s. The geno mic DNA of 5 species of cricket s is amplified wit h 10 different oligo2nucleotide 102mer p rimer . Primer S8 is screened by RA PD2PCR and five separate DNA map s are o btained t hro ugh amplif ying t he geno mic DNA of t he cricket s , lengt hs of t he DNA bands of each map : V el a ri f ictor us. as pe rses S8 - 1 900 , 1 510 , 1 320 , 830 , 740 , 370 , V . p a rv us S8 - 1 900 , 1 150 , 830 , 600 , 350 , L . equest ris S8 - 1 900 , 960 , 560 , L . doeni t z i S8 - 1 900 , 800 , T . e m m a S8 - 1 490 , 1 290 , 1 180 . The st udy also show s t hat amplified DNA exist sexual and individuals differences , but t hese differences distinctly differ f ro m t ho se amo ng t he species. The test result s are stable and rep ro ducible . Prime S8 co uld be used fo r t he identificatio n of five species of cricket s. Key words : RA PD ; cricket ; insect taxo no my