药学专业毕业论文 任务书 开题报告 文献综述 外文翻译10

药学专业毕业论文 任务书 开题 文献综述 外文10 药学专业毕业论文+任务书+开题报告+文献综述+外文 翻译10 本科毕业论文设计 届 题 目 新型去除血清白蛋白方法的研究 学 院 专 业 学 号 姓 名 指导老师 职称 目 录 中文摘要 5 英文摘要 6 引言 7 1 血液蛋白质组学的概述 7 2 8 21 材料 8 com 标本 8 com 试剂 8 com 主要仪器 8 com 实验所需液体配置 9 com 样品去脂 9 22 血清中白蛋白的去除 9 com 柠檬酸沉淀法 9 com1 不同有机溶剂实验 9 com2 不同浓度的柠檬酸实验 9 com3 不同物种适用性实验 9 com 改良的TCA丙酮沉淀法 10 com DAC沉淀法 10 3 结果及讨论 10 31 优化血浆白蛋白的沉淀条件 10 32 与其他不同的方法的比较 13 33 不同物种之间的使适用性 14 4 结论 14 5 展望 15 参考文献 致谢 17 新型去除血清白蛋白方法的研究 摘要对血清蛋白质的分析是一种寻找疾病生物标记及药物发现的重要方法之一每升血液中血清蛋白浓缩物只有皮克到克含量这样微少的含量对深入蛋白质分析之一种阻碍因此除去高含量蛋白质比如白蛋白有利于更容易检测和鉴别低含量蛋白质本论文旨在评估在二维双向电泳之前以柠檬酸-乙醇处理血清是否高效去除白蛋白从而能更好的检测出低含量蛋白浓缩物首先实验中用该方法去 除白蛋白结果显示能够有效以及迅速的去除白蛋白而且更环保更加简单 关键词白蛋白双向凝胶电泳血清蛋白质组柠檬酸沉淀 A new precipitation method to remove albumin from serum Abstract The proteomic analysis of serum has been a major approach to determining biomarkers for early diseases and drug discorevy The protein concentration of serum ranges from picograms to grams per liter making it difficult to achieve in-depth proteomic analysis So removal of highly abundant proteins such as serum albumin is required for facilitating detection and identification of low-abundant proteins The aim of the present study was to evaluate whether treatment of serum with citric acid-ethnol method before two-dimensional gel electrophoresis 2-DE analysis removed serum albumin to allow the visualization of low abundant proteins Here we first use this method to remove serum albumin The results indicate that this method achieved good albumin removal and is a rapid economical and a simple easy Method Keywords Albumin Two-dimensional gel electrophoresis Serum proteome Citric acid precipitation 引言 蛋白质组学研究已经成为当今生命科学的热点之一蛋白质作为生命活动的 主要承担者在机体生理功能中发挥着重要作用一直以来也是研究的重点蛋白质 组学是在特定细胞或组织水平上对蛋白质的表达进行研究运用这项技术可以在 正常与病理情况下检测蛋白的差异表达应用蛋白质组学在临床研究方面可以研 究特定蛋白与疾病的关系从而找到疾病标记蛋白为临床提供新的诊断依据血液中的蛋白质是持续变化机体很多病理变化都能在血液蛋白中得到相应的体现而且血浆易于获取因此在蛋白质组学研究方面将会有很大的应用 双向电泳[1]是蛋白质组学研究的核心技术之一提高分辨率和重复性是双向电泳最重要的两个技术目标而样品处理在实现以上目标过程中起到了核心作用目前还没有一种能广泛应用于各种生物样品制备的方法本文采用3种方法分别对血清进行处理通过比较电泳结果分析对血清双向电泳结果的影响并对柠檬酸沉淀方法做单一因素考察为双向电泳技术的优化提供参考 1 血液蛋白质组学的概述 近年来将蛋白质组学运用于临床医学研究越来越受人关注通过对血清蛋白质组的分析来进行疾病的诊断和药物的发现存在巨大的潜力迄今为止因为血清容易获得所以常被用来做实验的材料[2]理和病理状态的蛋白往往来自组织泄露细胞死亡分解和肿瘤细胞的分泌等因此人体异常的状态往往在血液蛋白水平上显现出来测定蛋白质浓度的变化相关性或绝对性对显示人体状态具有重要作用而且部分蛋白是生理异常指示疾病早期的重要标记通过血清蛋白分析来鉴别疾病特征生物标记将是一种重要的诊断方法推进了临床诊断疾病的发展如癌症类风湿性关节炎以及肌肉骨骼损伤等疾病都采用分析蛋白质组以进更深入的研究[3]因为早期诊断有利于减少病人的痛苦提高生活质量目前蛋白质组学研究主要采用二维脉冲电泳然后再用质谱鉴别蛋白在这些技术操作之前主要的是血清蛋白样品的制备人血清是一种包含脂质核酸糖类荷尔蒙激素以及多种蛋白质的复杂混合物[4]外不同蛋白质在血清中表达呈现一种宽量程的数量级目前已发现有超过10000种不同的蛋白质其中大部分是低丰度的蛋白质[5]将近22种组成血浆 蛋白质含量98[6]血浆蛋白中白蛋白结合免疫球蛋白表达含量高达60-80[6]如此高含量的蛋白质会阻碍对低丰度蛋白质的检测然而往往是与疾病有重要潜在关系的生物标记蛋白多存在于这些低含量蛋白质中因此为了使低含量蛋白更容易被检测出必须去除高丰度蛋白质越来越多的研究组织着手研究新型有效去除白蛋白的方法众多优化的实验设计以及商业去除白蛋白试剂盒被用来去除血浆中的高含量蛋白质其中不乏有实用价值的策略比如运用Multiple Affinity Removal Column可以有效去除包括白蛋白免疫球蛋白g抗胰蛋白酶免疫球蛋白A移动蛋白结合珠蛋白6种高含量蛋白另外白蛋白还可以运用亲和色谱法为基础的方法去除比如再如在亲和树脂上固定蛋白A或G可以去除免疫球蛋白g 本实验的目的在于发现一种新型制备血清样品化学方法柠檬酸乙醇法首先用环保的试剂去除血浆白蛋白提供一种快速简洁的白蛋白沉淀方法重要的是这种方法对人鼠兔的血浆均适用并能获得良好的沉淀结果因此这种方法开辟了制备血清样品的新方法 2 材料和方法 21 材料 com 标本 人血采集于浙江省第一医院一名健康男士志愿者的静脉血从大鼠眼底采血获得大鼠血样品取兔子的腹主动脉血做样品室温不加抗凝血剂自然放置30分钟接着3000g高速离心机分离20分钟去除血细胞移取上清液与新的管-80?下冷藏备用 com 试剂 丙烯酰胺 Acr N N2甲叉双丙烯酰胺 Bis 十二烷基磺酸钠 SDS 过硫酸铵 APS 四甲基乙二胺 TEMED 尿素32[32 胆酰氨丙基 二甲铵基]丙磺酸内盐 CHAPS 二硫苏糖醇 DTT 三羟甲基氨基甲烷 TriS 甘氨酸 Gly 琼脂糖牛血清白 蛋白 BSA 三氯乙酸 TCA 溴酚蓝碘乙酰胺 IAA 硫代硫酸钠 Na2S2O3 5H20 乙二 胺四乙酸二钠 EDTA 乙酸钠 NaAc3H20 甲醇乙醇丙醇甲酮低分子量蛋白缓 冲液 IPG Buffer com 主要仪器 24D制胶器DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂EPSON PERFECTION V700 PHOYO扫描仪购自EPSON公司concertrator 5301蒸发仪购自德国eppendrof公 司AB204N电子天平购自梅特勒托利多仪器公司冷冻台式高速离心机购自Thermo公司Transferen Decoloring摇床购自QILINBEIER公司Image Master 2D2Elite图像分析软件购自英国Amersham PharmaciaBiotech公司MILLIPORE S A 67120 去离子水器系法国MOL2SHEM公司产 com 实验所需液体配置 ?1倍电泳液03Tris base01SDS144甘氨酸 ?固定液4乙醇10醋酸 ?3倍SDS-Lodaing buffer10mL 0363g DTT06g SDS3Glycerol3mL 05Mtris-HCL滴加 1溴酚蓝至溶液显蓝色 ?10APS ?Resolving胶体缓冲液500ml pH88 9075g Tris base2g SDS13-15mL HCL以超纯水溶解调H至88终体积为500m?stacking胶体缓冲液500mH683025g Tris base2g SDS17-20mHCL以超纯水溶解调H至68终体积为500m com 样品去脂 取上步液体15000g设置温度4离心15分钟弃除上层悬浮类脂和下层沉淀将 澄清黄色血清移与新管中备用这一系列的步骤除去了大部分富含甘油三脂的乳 糜微粒和低密度脂蛋白[7]从而减少类脂对蛋白质分离的影响 22 血清中白蛋白的去除 com 柠檬酸沉淀法 com1 不同有机溶剂实验取四支分别装有20μ血清的E管分别加入三倍体积的3柠檬酸甲醇柠檬酸乙醇柠檬酸丙醇柠檬酸甲酮涡旋混匀后-20?放置90分钟接着15000g设置温度4离心15分钟取出EB管后分别将四支管中的上清液移至空EB管中分别标记为甲醇乙醇丙醇和甲酮各管中的沉淀用乙醇溶液缓和清洗两次每次吹打4至5次沉淀及上清液分别都蒸发至干 com2 不同浓度的柠檬酸实验 取七支分别装有20μ血清的EB管分别加入三倍体积60μ的1柠檬酸已醇3柠檬酸已醇5柠檬酸已醇7柠檬酸已醇10柠檬酸已醇12柠檬酸已醇15柠檬酸已醇20柠檬酸已醇涡旋混匀后-20放置90分钟接着15000g设置温度4?离心15分钟取出EB管后分别将七支管中的上清液移至空EB管中分别标记为135710121520各管中的沉淀用乙醇溶液缓和清洗两次每次吹打4至5次沉淀及上清液分别都蒸发至干 com3 不同物种适用性实验 取3支分别装有20μ人鼠及兔血清的ED管分别加入三倍体积60μ的3柠檬酸乙醇涡旋混匀后-20放置90分钟接着15000g设置温度4离心15分钟取出ED管后分别将三支管中的上清液移至空ED管中分别标记为人鼠和兔各管中的沉淀用乙醇溶液缓和清洗两次每次吹打4至5次沉淀及上清液分别都蒸发至干 com 改良的TCA丙酮沉淀法 该实验方法血液样品处理方法略有不同取血清样品0放置15分钟后 15000g4离心20分钟取其20μ加入四倍体积10TCA丙酮混合均匀-20放置90分钟接着15000g设置4离心20分钟分离上清液和沉淀将沉淀低温冷冻干燥上清液中则加入1m丙酮以使沉淀完全[8] com DAC沉淀法 血清中加入氯化钠达到01mo浓度4下涡旋60分钟接着加入42的乙醇4下放置60分钟然后16000g温度4离心45分钟取上清液以08molL醋酸钠调节p值至57然后4放置60分钟后再用二次16000g温度4离心45分钟将其沉淀与第一次的沉淀加和用10mM Tris bufferpH 68和 1 M 尿素溶解[9] 3 柠檬酸是一种常见的弱有机酸常作为食品添加剂使用细胞内三羧酸循环中柠檬酸起着重要作用本实验中首先用柠檬酸作为沉淀去除血浆中的白蛋白为了会获得最有效的去除白蛋白的方法实验进行不同浓度柠檬酸有机溶剂盐以及时间等实验操作的比较同时也比较该方法与其他不同沉淀方法以及不同物种间的沉淀效果实验证明该方法的确能够去除血浆中的白蛋白 31人血清是一种包含脂质核酸糖类荷尔蒙激素以及多种蛋白质不同蛋白质在血清中表达呈现一种宽量程的数量级目前已发现有超过10000种不同的蛋白质其中大部分是低丰度的蛋白质将近22种组成血浆蛋白质含量98血浆蛋白中白蛋白结合免疫球蛋白表达含量高达60-80如此高含量的蛋白质会阻碍对低丰度蛋白质的检测然而往往是与疾病有重要潜在关系的生物标记蛋白多存在于这些低含量蛋白质中因此为了确定沉淀最佳的柠檬酸浓度用乙醇溶解1到20等不同的浓度进行实验比较结果显示低浓度CA ,1 或高浓度CA ,10 都不能有效去除血清中的白蛋白从胶条上看1的柠檬酸不足以去除血浆中的白蛋白从而上清 液中胶条没有显现白蛋白另一方面12到20的柠檬酸沉淀了白蛋白的同时却沉淀也其他多种蛋白质由此可得低柠檬酸不足以去除白蛋白高浓度柠檬酸则易造成其他血液蛋白的流失只有3到10的浓度沉淀效果最好图1因此我们选择以沉淀效率高且试剂用量少的3浓度的柠檬酸作为最有沉淀浓度试 图3-1A为不同柠檬酸浓度沉淀蛋白胶条M为低分子量标准蛋白胶条1为原血清2-9为不同浓度的柠檬酸分别为135710121520浓度的柠檬酸乙醇处理后的沉淀蛋白胶条B为不同柠檬酸浓度上清蛋白胶条2-9为不同浓度柠檬酸乙醇处理后的沉淀蛋白胶条 实验条件的另外选择之一则是3柠檬酸沉淀剂的体积选择实验通过在20μ血清中加入不同体积的CA来比较最优体结果可以明显发现2至3倍血清体积的CA沉淀效果最好如图图2显示当加入多倍体积的3柠檬酸则不能有效去除白蛋白白蛋白在原血清中依然有较高的含量不能达到实验所预期想要得到的结果超过7倍体积则基本不能去除白蛋白图2 A为不同体积柠檬酸沉淀蛋白胶条M为低分子量标准蛋白胶条1为原血清2-9为不同体积3的柠檬酸分别为12345678倍3柠檬酸乙醇处理后的沉淀蛋白胶条B为不同柠檬酸浓度上清蛋白胶条此外实验中将柠檬酸溶解在甲醇乙醇及丙酮等不同有机溶剂中来确定柠檬酸的最佳溶剂结果显示乙醇和甲醇比另外两种溶剂更有效的去除白蛋白图3比较这两者的性质可得甲醇毒性高如果摄入10m则会损坏视神经从而导致永久性失明[10]而乙醇低价且普遍使用于实验中选择乙醇作为最佳有机溶剂有机溶剂的极性是提取蛋白实验的另一重要因素因此用不同浓度的乙醇进行确定意外的是以纯水到20浓度的乙醇溶解3的柠檬酸低浓度乙醇基本不能沉淀白蛋白其最适是在50的乙醇浓度高于50则连同其他蛋白一起去除这是因为低浓度高极性的乙醇不利于 沉淀 图3- M带为低分子量标准蛋白胶条1为原血清2-5分别为甲醇乙醇酮和丙醇沉淀蛋白6-9分别为其顺序对应上清液蛋白 实验中值得注意的是提取操作的另一影响因素是加入盐类在染色液中加入NaCl NaAc MgCl2 CaCl2 ZnCl2 Zn NO3 2 ZnSO4 Zn Ac 2 AlCl3 及 FeCl3等可溶性无机盐来探索是否会增加染色敏感度实验显示加入磺酚丁不能白蛋白硝酸锌硝酸镁则不能获得良好的效果盐不如氯化氯化钙是好的白蛋白剂 为了使实验更加精准对沉淀过程机制的认识极其重要柠檬酸和乙醇是白蛋白提取中的重要因素血浆用柠檬酸沉淀之后其中的白蛋白溶解在上层机溶剂中而其他主要蛋白则在沉淀中为了确定是何种成分去除白蛋白进行了实验结果显示纯水不能去除白蛋白随着乙醇浓度的增加血浆中白蛋白逐渐被去除可能是因为白蛋白和柠檬酸结合成柠檬酸白蛋白复合物而溶解在有机溶剂中从而存在于上清液中柠檬酸羧基和蛋白质外露的羟基位置通过静电作用结合从而溶解在乙醇中 32 实验进行了DAC和TCA丙酮沉淀法同柠檬酸乙醇方法进行比较尽管每种方法对白蛋白有一定的去除但是沉淀结果都不很理想比如DAC不能高效去除白蛋白图4而且这种方法费时45小时不说在溶解沉淀步骤上更是复杂与此相比TCA丙酮方法虽然在沉淀白蛋白上明显提高可是与柠檬酸乙醇法相比它也沉淀了血浆中的其他蛋白总的来说柠檬酸乙醇法去除了大部分白蛋白的同时尽可能的减少了其他蛋白的损失而且从实际操作层面上来说三者中柠檬酸乙醇方法简便且高效迄今为止已有多种去除白蛋白的方法其主要基本都是以化学染料方法或免疫 亲和性等为基础差的方法cibacron blue dye是一种传统的方法但是对非特异性结合的配体有一定的损害与此相比免疫亲和性分离方法更加具有选择性常常被用来做白蛋白去除和获取实验但是尽管可以循环利用由于价格昂贵而不被实验室常用NaClEtOHTCA丙酮以及硫酸铵沉淀等都是化学方法这些方法简便且高效 图4 该图为不同方法去除白蛋白效果比较ABC分别为DACTCA和柠檬酸乙醇沉淀方法M带为低分子量标准蛋白胶条1为原血清2为沉淀蛋白胶条3为上清液蛋白胶条 33 不同物种之间的使适用性 不管在人类还是动物上疾病特别生物标记对诊断的判断都能适用但是高浓度的血清白蛋白阻碍生物因子发现人类药物的发现早于动物种类上的疾病生物标记人类白蛋白更具有应用价值因为一些疾病模型不能在像动物模型在实验中建立所以实验中将柠檬酸沉淀法用于人鼠兔这三种在实验中常用的血液结果显示三种物种对此方法都适用由此可以认为此方法可用于猪马等其他物种 图3-5 A为不同物种人蛋白胶条1为标准低分子量蛋白M为原血清蛋白2为3柠檬酸乙醇处理后的血清沉淀3为处理后的血清上清液图B为不同物种蛋白胶条1为标准低分子量蛋白M为原血清蛋白2为3柠檬酸乙醇处理后的血清沉淀3为处理后的血清上清液图C为不同物种兔蛋白胶条1为标准低分子量蛋白M为原血清蛋白2为3柠檬酸乙醇处理后的血清沉淀3为处理后的血清上清液 4 血浆是一种寻找疾病标志的重要材料来源然而如白蛋白之类的高含量蛋白阻碍低丰度蛋白的检测必须在检测低丰度蛋白之前去除高含量的白蛋白 清除血清中高丰度蛋白提高了低丰度蛋白检测的灵敏度血浆中的蛋白质是 一种巨大前景的疾病标记物本论文中我们提供了一种快速实惠简便的白蛋白去除方法改方法适用于人鼠以及兔血清总而言之实验结果显示这是一种有效的白蛋白去除方法我们希望柠檬酸-乙醇沉淀方法能在未来为血清疾病蛋白标记的发现实现更好的发展 5 由于血浆成分极其复杂因此对其进行有效的分离则成为血液蛋白质组学的关键所在一些高丰度蛋白常常会掩盖低丰度蛋白的检测[11]而低丰度蛋白极微量的变化都会放映机体的状态在疾病标记蛋白方面有广阔的应用前景血液中白蛋白的含量高达50达到了30gL其次是免疫球蛋白为12gL此血液蛋白质组学研究的首要问题就是如何有效地去除这些高丰度蛋白Colanto[12]等运用化学提取的方法有效的去除血浆中的白蛋白大大减少了白蛋白对其他蛋白的干扰Pieper[12]等利用免疫吸附色谱技术去除血浆中多数高丰度蛋白然后利用阴离子交换树脂和分子排阻色谱法对低丰度蛋白进行分离大大提高了蛋白质分离的效果近年来随着蛋白质分离方法的不断改进血液蛋白的研究也将逐渐深入 人体在正常情况下血液中各种蛋白质含量均受到严格的控制从而能有效平衡机体的生理功能血液蛋白功能的丧失以及功能失调可以导致一定的病理过程组织蛋白释放细胞死亡或劈裂肿瘤细胞的异常分泌等与疾病有很大的相关性血液蛋白质的电泳分离技术已经广泛应用于临床研究例如结合珠蛋白有可能在临床诊断方面作为癌症的标记蛋白通过分析怀孕妇女的血清发现有先兆子痫的妇女与正常妇女相比clusterin含量大大高于后者急性髓细胞样白血病与对照组相比可以诊断红细胞是否被疟疾原虫感染在肝脏疾病方面血液蛋白质组有可能作为一种发现疾病蛋白的有效手段人类血液是较易获得的样品可在疾病的不同 阶段进行取样利用蛋白质组学对血浆蛋白组成进行研究对了解疾病的分子机制 方面有广阔的前景参考文献1]王班琴秦兆宇等双向电泳中人血清蛋白样品不同 处理方法的比较[J] 山东大学学报医200947 11 90-90 [2]Hu S Loo JA Wong DT Human body fluid proteome analysis[J] Proteomics 2006 6 23 6326-6353 [3]Vudev NS Roisean E Ferguson David A Cairns et al Serum biomarker discovery in renal cancer using 2-DE and Prefractionation by immunodepletion and isoelectric focusing increasing coverage or more of the same[J] Proteomics 2008 8 23-24 5074-5085 [4]Thadikkaran L Siegenthaler MA Tissot JD et al Recent advances in blood-related proteomics[J] Proteomics 2005 5 12 3019-3034 [5]Adkins JN Adkins JN Varnum SM et al Toward a human blood serum proteome analysis by multidimensional separation coupled with mass spectrometry[J] Mol Cell Proteomics 2002 1 12 947-955 [6]Anderson NL Anderson NG The human plasma proteome history character and diagnostic prospects[J] Mol Cell Proteomics 2002 1 11 845-867 [7] Terpstra AH Isolation of serum chylomicrons prior to density gradient ultracentrifugation of other serum lipoprotein classes[J] Anal Biochem 1985 150 1 221-227 [8]Chen YY Wu CY Wang AH et al A modified protein precipitation procedure for efficient removal of albumin from serum[J] Electrophoresis 2005 26 11 2117-2127 [9]Choi JK Kwon TI Yoo GS et al Background-free fast protein staining in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel using counterion dyes zincon and ethyl violet[J] Electrophoresis 2002 23 24 4053-4059 [10]Vale A Methanol[J] Medicine 2007 35 12 6333-6634 [11]苟黎明邵小宝李克等 蛋白质组学研究中高丰度蛋白质去除方法的研究 进展[J] 临床检验杂志201028 4 298-300 [12] 张鹏辉崔健金艳等 血液蛋白质组学[J] 临床血液血杂志201127 2 186-188 致 谢 本科毕业论文 设计 任务书 学 院 专 业 药学 姓 名 学 号 指导老师 职 称 合 作老师 职 称 论文题目 一课题的内容和任务要求 1 课题内容比较DACTCA-丙酮柠檬酸-乙醇等不同方法对沉淀血液白蛋白的 结果对柠檬酸沉淀方法的影响因素进行单因素考虑探索不同提取方法的最佳实 验条件并对柠檬酸乙醇的实验条件进行考察以确定一种环保高效的白蛋白沉淀 方法 2 任务要求本实验以柠檬酸沉淀方法对不同物种血清进行白蛋白沉淀考察 柠檬酸不同浓度不同体积不同有机溶剂等条件对血清白蛋白的去除的效果并且 考察盐金属等其他因素对该实验的影响并以双向凝胶电泳检验沉淀后上清液与 白蛋白含量比较 二进度安排起止时间 2010年12月04 日 , 2011年04月09日 2010年12月04日-2010年12月25日 确定毕业论文设计题目拟定论文设计初步方案论证导师提出毕业论文 设计期间咨询方式及具体联系时间 2010年12月25日-2011年01月04日 外文文献翻译及原稿查询 2011年01月04日-2011年01月14日 撰写毕业论文设计文献综述 2011年01月15日-2011年01月25日 撰写毕业论文设计开题报告 2011年01月26日-2011年01月29日 填写毕业论文设计任务书 2011年01月30日-2011年02月07日 填写毕业论文设计进度表 2011年02月20日-2011年0月日 上交中期检查材料 2011年03月01日-2011年03月31日 撰写毕业论文完成初稿 2011年04月01日-2011年04月日 毕业论文审阅修改自评总结指导教师填写评语书写毕业论文设计答辩申请 按要求打印装订及全套材料上交 本科毕业论文设计成绩评定书里评阅老师评审意见 2011年05月07日900 论文答辩填写评审意见 三主要参考资料 1]王班琴秦兆宇等双向电泳中人血清蛋白样品不同处理方法的比较[J] 山 东大学学报医200947 11 90-90 [2]Hu S Loo JA Wong DT Human body fluid proteome analysis[J] Proteomics 2006 6 23 6326-6353 [3]Vudev NS Roisean E Ferguson David A Cairns et al Serum biomarker discovery in renal cancer using 2-DE and Prefractionation by immunodepletion and isoelectric focusing increasing coverage or more of the same[J] Proteomics 2008 8 23-24 5074-5085 [4]Thadikkaran L Siegenthaler MA Tissot JD et al Recent advances in blood-related proteomics[J] Proteomics 2005 5 12 3019-3034 [5]Adkins JN Adkins JN Varnum SM et al Toward a human blood serum proteome analysis by multidimensional separation coupled with mass spectrometry[J] Mol Cell Proteomics 2002 1 12 947-955 [6]Anderson NL Anderson NG The human plasma proteome history character and diagnostic prospects[J] Mol Cell Proteomics 2002 1 11 845-867 [7] Terpstra AH Isolation of serum chylomicrons prior to density gradient ultracentrifugation of other serum lipoprotein classes[J] Anal Biochem 1985 150 1 221-227 [8]Chen YY Wu CY Wang AH et al A modified protein precipitation procedure for efficient removal of albumin from serum[J] Electrophoresis 2005 26 11 2117-2127 [9]Choi JK Kwon TI Yoo GS et al Background-free fast protein staining in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel using counterion dyes zincon and ethyl violet[J] Electrophoresis 2002 23 24 4053-4059 [10]Vale A Methanol[J] Medicine 2007 35 12 6333-6634 [11]苟黎明邵小宝李克等 蛋白质组学研究中高丰度蛋白质去除方法的研究 进展[J] 临床检验杂志201028 4 298-300 [12] 张鹏辉崔健金艳等 血液蛋白质组学[J] 临床血液血杂志201127 2 186-188 签名栏 学生 指导老师 学院领导 本科毕业论文 设计 开题报告 学 院 专 业 药学 姓 名 学 号 指导老师 职 称 合 作老师 职 称 论文题目 新型去除血清白蛋白方法的研究 题目性质 ?实验研究 技术开发 工程设计 应用型 调查型 其他 一选题依据和目标 该研究的目的意义国内外研究现状及发展趋势 研究目的 蛋白质组学已经成为当今生命科学的热点之一血浆成分相当复杂因 此对其进行有效的分离则成为血液蛋白质组学研究的关键所在实验的目的在于 用新型的化学方法将血液中的白蛋白从血浆中有效去除并且获得具有继续使用价值的去除白蛋白后的血浆 2研究意义 蛋白质组学是在特定细胞或组织水平上对蛋白质的表达进行研究运用这项技术可以在正常与病理情况下检测蛋白质的差异表达血液中的蛋白质是在持续的变化中机体很多病理变化都能在血液蛋白质的微量变化中得到相应的体现而求血浆相对容易获取应用蛋白质组学研究血液蛋白质的临床方面可以联系特定蛋白与疾病的关系从而找到疾病标记蛋白为临床提供新的诊断依据 国内外研究现状 国内从1997年开始开展蛋白质组研究其中中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所建立的蛋白质组研究中心在2000年的Electrophoresis上发表了我国第一篇蛋白质组研究论文并在生命科学研究院生物信息中心的协助下建立了我国第一个大型的蛋白质组数据库并实现了网络共享目前已建立起基本蛋白质组平台技术的有中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研究中心和军事医学科学院已开展相关研究的单位还有湖南师范大学生命科学院中国科学院大连化学物理研究所复旦大学等 此外国际生物学主流也对蛋白质组学的研究重视美国国立卫生研究院所属的国立肿瘤研究所投入了大量经费支持蛋白质组研究其中最大的一项资助是投入一千万美金用蛋白质组的方法对肺癌肝癌乳腺癌和子宫癌进行数据采集以补充基因组和转录组的结果进一步的目标是构建一个包含双向电泳的蛋白质组数据库同时和美国食品与药物管理局FDA 联合开发可用于临床的蛋白质组技术特别感兴趣的是测试药物的疗效和毒性欧共体目前正在资助酵母蛋白质组研究英 国生物技术和生物科学研究委员会最近也资助了三个研究中心对一些已完成或即将完成全基因组测序的生物开展蛋白质组研究在法国五个研究不同模式生物的实验室得到为期三年的资助每年约500万美元平均分配到基因组转录组和蛋白质组研究中 发展趋势 蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处在于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的它从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明生命活动的基本规律 在基础研究方面近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域如细胞生物学神经生物学等 在研究对象上覆盖了原核微生物真核微生物植物和动物等范围涉及到各种重要的生物学现象如信号转导细胞分化蛋白质折叠等等 在应用研究方面蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一在对癌症早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的前景 在技术发展方面蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存各有优势和局限的特点而难以像基因组研究那样形成比较一致的方法除了发展新方法外更强调各种方法间的整合和互补以适应不同蛋白质的不同特征 在未来的发展中蛋白质组学的研究领域将更加广泛 二课题关键问题及难点 关键问题 1白蛋白沉淀方法的建立 2不同物种对此方法的适用性 3实验结果数据的合理分析比较 难点实验中沉淀方法的单因素考虑例如沉淀剂的选择及浓度沉淀时间溶解剂的选择不同物种血液沉淀的影响 三完成该课题研究已具备的条件有关的研究工作基础仪器设备条件经费情况研究工作基础 1温州医学院图书馆提供数据库进行中英文文献检索收集所需资料 2已有数据库中国期刊全文数据库Medline数据库中国生物医学文献数据库等 3温州医学院药学院提供实验室实验设备及老师指导 2仪器设备条件124D制胶器 北京市六一仪器厂2DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂3PERFECTION V700 PHOYOEPSON 4concertrator 5301 德国eppendrof公司5AB204N电子天平梅特勒托利多仪器公司6冷冻台式高速离心机 Thermo 7Transferen Decoloring ShakerQILINBEIER 四研究方案 1 拟采取的研究方法或试验方法及主要技术路线 1研究方法本实验通过对已有的血液白蛋白沉淀方法的大量实验比较各实验的优劣初步形成新型的沉淀方法方案 2主要技术路线不同方法因素的考察?分析各方法中的有利沉淀条件?沉 淀方法的初步确定?针对方法各单因素的条件进行大量的实验?分析实验数据 结果?改良实验方案的方案 研究进度安排2010年12月04日-2010年12月25日 确定毕业论文设计题目拟定论文设计初步方案方案论证导师提出毕业论文 设计期间咨询方式及具体联系时间 2010年12月25日-2011年01月04日 外文文献翻译及原稿查询 2011年01月04日-2011年01月14日 撰写毕业论文设计文献综述 2011年01月15日-2011年01月25日 撰写毕业论文设计开题报告 2011年01月26日-2011年01月29日 填写毕业论文设计任务书 2011年01月30日-2011年02月07日 填写毕业论文设计进度表 2011年02月20日-2011年0月日 上交中期检查材料 2011年03月01日-2011年03月31日 撰写毕业论文完成初稿 2011年04月01日-2011年04月日 毕业论文审阅修改自评总结指导教师填写评语书写毕业论文设计答辩申请 按要求打印装订及全套材料上交 2011年04月19日-2011年04月30日 本科毕业论文设计成绩评定书里评阅老师评审意见 2011年05月07日900 论文答辩填写评审意见 五参考文献 [1]王班琴秦兆宇等双向电泳中人血清蛋白样品不同处理方法的比较[J] 山 东大学学报医200947 11 90-90 [2]Hu S Loo JA Wong DT Human body fluid proteome analysis[J] Proteomics 2006 6 23 6326-6353 [3]Vudev NS Roisean E Ferguson David A Cairns et al Serum biomarker discovery in renal cancer using 2-DE and Prefractionation by immunodepletion and isoelectric focusing increasing coverage or more of the same[J] Proteomics 2008 8 23-24 5074-5085 [4]Thadikkaran L Siegenthaler MA Tissot JD et al Recent advances in blood-related proteomics[J] Proteomics 2005 5 12 3019-3034 [5]Adkins JN Adkins JN Varnum SM et al Toward a human blood serum proteome analysis by multidimensional separation coupled with mass spectrometry[J] Mol Cell Proteomics 2002 1 12 947-955 [6]Anderson NL Anderson NG The human plasma proteome history character and diagnostic prospects[J] Mol Cell Proteomics 2002 1 11 845-867 [7] Terpstra AH Isolation of serum chylomicrons prior to density gradient ultracentrifugation of other serum lipoprotein classes[J] Anal Biochem 1985 150 1 221-227 [8]Chen YY Wu CY Wang AH et al A modified protein precipitation procedure for efficient removal of albumin from serum[J] Electrophoresis 2005 26 11 2117-2127 [9]Choi JK Kwon TI Yoo GS et al Background-free fast protein staining in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel using counterion dyes zincon and ethyl violet[J] Electrophoresis 2002 23 24 4053-4059 [10]Vale A Methanol[J] Medicine 2007 35 12 6333-6634 [11]苟黎明邵小宝李克等 蛋白质组学研究中高丰度蛋白质去除方法的研究 进展[J] 临床检验杂志201028 4 298-300 [12] 张鹏辉崔健金艳等 血液蛋白质组学[J] 临床血液血杂志201127 2 186-188 六指导老师意见 签名 年 月 日 七学院意见 学院负责人签名 年 月 日 本科毕业论文 设计 文献综述 学 院 专 业 药学 姓 名 学 号 指导老师 职 称 合 作老师 职 称 文献综述题目 蛋白质组学技术及应用的发展概述 文献综述主要包括国内外现状研究方向进展情况存在问题参考文献等 蛋白质组学技术及应用的发展概述 摘要蛋白质组学是一门对细胞或组织内成千上万的蛋白质同时进行研究的 科学对组织和细胞中的蛋白质的鉴定可以为人类提供疾病生理及病理学方面的 重要信息不仅可以诊断疾病预防疾病甚至提供临床治疗途径本文就上述背景介 绍了蛋白质组学研究的技术应用关注程度及发展前景 关键词蛋白质组蛋白质组学双向电泳质谱生物标记 AbstractProteomics is a study of science who studys the thousands of protein in cells and tissue at the same timeproteins are the end products of genes and hence dictate the phenotype of cells and tissues Therefore proteomics can provide key information for the elucidation of physiological and pathophysiological mechanisms by identifying the protein profile from cells and tissuesThe application and development of proteomics were summarized in this article Key wordsproteom protemics two-dimensional electrophoresis mass spectroscopy biomarkers 1 蛋白质组学研究技术 目前对蛋白质的研究主要依赖双向凝胶电脉质谱和生物信息学的应用双向 凝胶电泳是一种有效分离蛋白质的手段由OFarrell[1]以及Klose和Scheele等 发明其第一向基于蛋白质的等电点分离第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分 离把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开现在双向凝胶电泳的一块胶 板 16cm×20cm 可分出3000-4000个甚至10000个可检测的蛋白斑点每个分离的 蛋白斑点可有微克数量的蛋白完全有希望被检测出但当前的2-D PAGE技术还不 足以检出拷贝数低于1000的蛋白质且极酸或极碱蛋白的分离极大 大于200kD 或极小 ,10KD 蛋白的分离及难溶蛋白的检测存在难度 质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快也最具活力和潜力的技术其基本原理是样品分子离子化后根据不同离子间的质荷比 mz 的差异来分离并确定分子量它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳一质谱技术即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定对于蛋白质鉴定而言高通量高灵敏度和高精度是三个关键指标[2]一般的质谱技术难以将三者合一而最近发展的质谱技术可以同时达到以上三个要求从而实现对蛋白质准确和大规模的鉴定另外对于蛋白质和多肽质谱发展还有一个重要功能是肽的测序这是采用串联质谱 ms-ms 即在第一级质谱得到肽的分子离子选取目标肽的离子作为母离子与惰性气体碰撞使肽链中的肽键断裂形成一系列离子将这些碎片离子系列综合分析可得出肽段的氨基酸序列质谱法还能用于翻译后修饰的分析糖基化磷酰化等但是它也有局限譬如Leu和Ile和Gln不能区别有些肽的固有序列不能用质谱法测定 另外生物信息学为蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件所建立的蛋白质数据库更成为蛋白质组研究水平的标志和基础为双向电泳图象的分析和比较以及蛋白质的鉴定方面提供了方便快捷的帮助和大量的信息数据库和分析软件是蛋白质组研究不可缺少的信息学手段比较知名的有SWISS2PROT 数据库还有NCBI 核昔酸数据库收集生物大分子 蛋白质核酸和糖 结构的PDB 数据库Melauie3PDQuest61Delta2D等不同类型的蛋白质数据库分析软件有蛋白质2D2PAGE图谱分析软件和蛋白质鉴定软件蛋白质结构和功能预测软件[3] 2 蛋白质组学在疾病上的应用 21癌症 恶性肿瘤的发生发展是一个涉及多因素多基因多阶段的病理过程尽管人类基因组包含了机体的所有遗传信息但其只是指导蛋白质合成而构成细胞并发挥各种功能作用则是由蛋白质来完成蛋白质还是机体多种不同类型细胞之间差异的决定因素同样肿瘤细胞和正常细胞的差异在很大程度上也是由功能基因 组 及其指导合成的蛋白质 组 的不同来决定的因此蛋白质组学直接从生物功能的执行者蛋白质入手有助于从根本上对肿瘤的发生发展产生一个直观的认识直接指导着疾病的诊断和治疗 根据文献[4]报道肿瘤细胞或肿瘤亚细胞的蛋白质组与正常细胞存在明显差异而且不同阶段或不同分化程度的肿瘤细胞蛋白质组也会随之发生改变由此表明蛋白质组的异常变化参与肿瘤的发生发展过程调控肿瘤细胞的恶性生物学特征Qattan等人[5]用定量蛋白质组学方法研究了乳腺癌MCF-7细胞系中2184种蛋白在细胞溶质质膜内质网和线粒体等多种细胞器的分布情况发现481种蛋白质有唯一的亚细胞定位454种蛋白亚细胞定位没有差别1249种蛋白亚细胞定位表达量出现倍数变化提示这些蛋白的亚细胞器定位时空分布与乳腺癌的发生有关 另外肿瘤发生发展的多阶段过程中肿瘤演进的每一步都直接或间接地涉及蛋白质组的改变吴晓英等人[6]对32例人支气管正常上皮鳞状上皮化生不典型增生和上皮浸润癌组织进行比较蛋白质组学研究成功鉴定了113个差异蛋白支气管正常上皮鳞状化生不典型增生及上皮浸润癌组织之间分别有3342和38个差异表达蛋白通过影响细胞生长细胞周期调控信号传导及细胞功能特化等诸多功能来调控肺鳞癌癌变的不同阶段 2神经系统疾病 神经系统结构极其复杂主要表现在细胞种类和突触数量方面必需有关蛋白质网络的亚细胞组织的研究技术细胞内的蛋白质网络在神经元和神经胶质中发挥重要作用 脆性x染色体综合症是一种常见的智力发育迟缓的症状表现为机体运动协调功能差机能亢进认识障碍等研究员[7]用DIGE萤光染蛋白质分析技术测定果蝇野生株和脆性x染色体组大约1500种蛋白质只有24种存在表达差异其中由苯丙氨酸羟化酶和GTP环水解酶编码的Henna和Punch蛋白质调节重要神经调质多巴胺和5羟色胺等单胺的合成萤光染色差异法显示条带上的这两种蛋白含量增加这差异暗示蛋白质翻译后经过修饰进一步研究显示是经磷酸化活化这些蛋白酶中增加的磷酸纤维素也证明这两种神经调节物质在患有该疾病时激活有此可得出这些差异蛋白质与该疾病的机制有关 帕金森病 PD 是神经系统较为常见的变性疾病常发生于锥体外系统张艳梅等人[8]首次运用蛋白质组学技术对MPP干预PC12细胞的PD模型进行研究结果共发现32个差异蛋白点其中17个蛋白表达上调15个蛋白表达下调并且发现线粒体功能相关的蛋白线粒体加工肽酶 MPPs 蛋白在MPP诱导的PC12细胞PD模型中表达显著上升提示该蛋白可能在PD的发病机制中扮演一定的角色 神经管畸形 NTD 是一种严重的中枢神经系统发育畸形疾病胚胎在4周内受遗传和环境因素的影响可导致神经管闭合异常形成神经管畸形我国是神经管畸形高发区因此寻找一种快速安全准确易行的早期诊断胎儿神经管畸形方法尤为重要任亚丽[9]等人通过二维凝胶电泳分离神经管畸形新生儿及正常新生儿血清筛选出35个表达差异的蛋白质点其中有8个蛋白质点表达上调27个蛋白 质点表达下调选取4个蛋白质点进行鉴定其中结合珠蛋白前体表达升高HP蛋白血清载脂蛋白A-1前体及免疫球蛋白重链恒定区-1蛋白表达均降低由此可知神经管畸形可以导致血清中多种蛋白的的异常表达 23 糖尿病 糖尿病存在两种类型一种是胰岛素绝对不足另外一种是胰岛素受体减少从而胰岛素相对不足这两种都引起血浆血糖含量增加糖尿病发病率的增加亦使心脏病肾脏疾病神经病变和眼科疾病等并发症的发病率升高Dihazi等[10]运用离子交换反相分离凝胶电泳和SELDI-TOF 法和 SAX2 蛋白阵序列分离和鉴别了糖尿病肾病尿蛋白糖尿病肾病非尿蛋白非糖尿病肾病尿蛋白和正常尿结果发现糖尿病肾病的病人会释放出大量 UbA52UbA52可以作为诊断标记 24 蛋白质组学在骨科中的应用 骨科是主要研究骨骼肌肉系统的解剖生理与病理运用药物手术及物理方法保持和发展这一系统的正常形态与功能随着时代和社会的变更骨科伤病变化无常亟须骨科与时俱进将蛋白质组学技术应用到医学骨科领域中为发现疾病生物标记鉴定和评价药物靶蛋白等发挥了巨大的作用王海彬等[11]建立去卵巢大鼠骨质疏松症模型行蛋白质组学分析鉴定了3个差异蛋白分别为硫氧还蛋白过氧化酶1阻凝蛋白轻链肽2泛素化酶E2217KD初步认为这三种蛋白质在绝经后骨质疏松症的发病及中药治疗过程中发挥着重要调控作用 25 其他 近年来科学家们已开始将蛋白质组学技术应用于营养研究领域但应用刚刚起步报道很少蛋白质组学在营养支持研究中的典型例子是对过氧化物酶体增生物激活受体的研究[12]再如药物成瘾[13]涉及脑内多种蛋白含量结构及功能的 复杂改变其生物学机制尚未被阐明采用蛋白质组学技术可高通量高效率地获得成瘾药物作用的分子靶点综合探讨其在分子水平的作用机制 3 国内外对蛋白质组研究的重视 国内从1997年开始开展蛋白质组研究国家自然科学基金委员会于1999年支持了蛋白质组重大项目经过4年的发展在国内已形成一支蛋白质组研究队伍并拥有主要的研究技术和装备目前已建立起基本蛋白质组平台技术的有中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研究中心和军事医学科学院2001年我国的蛋白质组研究又进入了一个迅速发展的新阶段其主要标志是国家科技部将蛋白质组研究确立为973和863的项目 此外蛋白质组学刚更是得到国际生物学主流的重视美国国立卫生研究院NIH所属的国立肿瘤研究所NCI投入了大量经费支持蛋白质组研究其中最大的一项资助是投入一千万美金用蛋白质组的方法对肺癌肝癌乳腺癌和子宫癌进行数据采集以补充基因组和转录组的结果进一步的目标是构建一个包含双向电泳的蛋白质组数据库同时NCI和美国食品与药物管理局FDA联合开发可用于临床的蛋白质组技术FDA特别感兴趣的是测试药物的疗效和毒性 4 蛋白质组学发展方向 蛋白质组学历经近10年的发展己取得了卓越成效目前蛋白质组学工作分为结构蛋白质组学和功能蛋白质组学两部分分别从不同的角度对蛋白质进行确凿的诠释尤其是功能蛋白质组学的提出在保证研究工作的同时极大地节省了人力物力具有光明的发展前景国内文宗曜教授和美国圣地亚哥shu chien等建立了新型的同步化红细胞模型研究正常生理条件下及基因调控异常情况下在整个红细胞生命周期中蛋白质的改变所引起的微观流变学变化以阐明红细胞衰老的机制 他们运用多学科交叉技术体现了蛋白质的动态过程 5 结束语 蛋白质组学研究的兴起使生命科学领域发生了革命性的变化为理解细胞机体在生理与病理状态下的分子基础提供了非常有用的技术手段目前应用蛋白质组学技术发现鉴定相关蛋白在骨科尚处于起步阶段而真正涉及蛋白质功能或者蛋白间的相互影响作用的研究几乎还是一片空白相信随着蛋白质组学技术的成熟发展将给临床明确疾病的发生机制诊断及治疗带来新的希望 6 参考文献 [1]祁维平刘师莲 蛋白质组学及其在疾病研究中的应用[J] 山东大学学报医学版200254 2 55-56 [2]俞利荣曾嵘夏其昌 蛋白质组研究技术及其进展[J] 中国科学院院刊200217 3 166-169 [3]张昌明伊力亚尔?夏合丁张建龙蛋白质组学技术及其在食管癌中的研究进展新疆医科大学学报201033 2 213-214 [4]曾益新吕有勇朱明华等肿瘤学 北京人民卫生出版社2003 [5] 李国庆肖哲锋刘健平等 一种蛋白质组学疾病 肿瘤中国科学2010409788 – 794 [6]吴晓英李萃肖志强等 支气管上皮组织癌变各阶段2-DE图谱及差异分析 癌症4 3 522530 [7]colas Bouset Anthony O Gramolini Thomas Kislinger et alProteomics-based investigations of animal models of diseaseProteomics Clin[J] 2008 2 20 638–653 [8]张艳梅李润今帕金森病发病机制的研究 内蒙古医学院学报2010 32 2 205-207 [9]任亚丽宿宝贵新生儿神经管畸形的血清蛋白组学研究广东医学201031 5 561-563 [10]雷培培丛维涛金利泰蛋白质组学及其在糖尿病相关疾病中的应用 中国医药生物技术20094 3 227-229 [11]王海彬刘建仁樊粤光等 中药治疗大鼠去卵巢骨质疏松症的蛋白质组学分析[J] 四川中医2006 24 8 9 - 13 12]杜瑞平卢德勋钟彩霞组学技术及其在营养学中的应用内蒙古农牧业科学院百年院庆论文集畜牧特刊201031 6 458-461 [13]周晚玲朱永平药物成瘾的蛋白质组学研究 生物物理学报 本科毕业论文 设计 外文翻译 学 院 专 业 药学 姓 名 学 号 指导老师 职 称 合作老师 职 称 外文题目原文 Plasma proteome analysis in diet-induced obesity-prone and obesity-resistant rats 译文 饮食诱导肥胖倾或抑制大鼠的血浆蛋白质组分析 Plasma proteome analysis in diet-induced obesity-prone and obesity-resistant rats 在肥胖领域的重要内容在于为什么同等高卡路里饮食的条件下一部分人肥胖而另外一部人却对肥胖有抵制力在龋齿类动物模型实验中肥胖倾向老鼠op和肥胖抵制老鼠or中尽管拥有同等的基因背景肥胖倾向老鼠和抑制老鼠在每日同等高脂肪饮食诱导条件下却表现不同的现象现代科学的研究旨在通过对op和or 老鼠的蛋白质研究分析发现与肥胖相关的至肥胖敏感或抵制的新型生物标记在一段时间的高脂肪饮食饲养后肥胖倾向性老鼠比肥胖抵制性老鼠多增加了大约25的体重实验通过运用二维脉冲联合MALDI-TOF-MS来分析其蛋白质我们通过分析表征体重功能的平均斑点密度和六只老鼠的个别斑点密度将已鉴别的蛋白质分成三组结果分类 1 的内部抑制h4重链因子 ITIH4 胎球蛋白B前体这两种蛋白可用来作为肥胖危险的新型血浆标记物分类2与3的九种蛋白也可能是肥胖的潜在的血浆标记肥胖蛋白质的研究与以前的研究区别在于这是一个鉴别op和or老鼠跨越性的进步 1 引言 肥胖是一种受基因和环境影响的多因素疾病易引起心血管风险内皮功能异常血脂障碍高血压二型糖尿病等一系列并发症对于肥胖症的研究重点在于研究为什么一部分人肥胖的同时另一部分人却没有这一方面的担忧由于临床研究困难很多研究者便在动物模型上研究以期发现这两种类型的区别机制 人类在高脂肪饮食条件下改变正常趋向从而变胖老鼠也是同样情况但是一部分老鼠对肥胖敏感的同时另外些老鼠却对此免疫这其中的影响因素仍然未知饮食引导肥胖已经作为一种轮流动物模型来研究基因背景下环境的影响只有每日缓慢的高脂肪高热量摄入下饮食引导才至肥胖这和人类的各种类型肥胖及每日高脂肪热量摄入诱发肥胖并持续肥胖类似另外很少有报告显示肥胖病人在治疗药物来普汀和来普汀基因受体变异等方面可以解释肥胖因此饮食诱导肥胖比基因遗传模型更能解释肥胖 根据对龋齿类动物的研究表明高脂肪饮食诱导的不同反应来自压力一些老鼠体重增加的同时另外那些被称为肥胖抵制的老鼠确没有在对肥胖研究的 多种龋齿类动物中SD大鼠是一种有特别控制能量稳定能力的动物适度的高脂肪饮食喂养下大约一半大鼠发展为饮食诱导肥胖 DIO 剩下的则表现对饮食抵抗 有丰富的信息显示在op和or鼠之间其表型大有不同Levin及他的同事研究显示在高脂肪饮食的饮食诱导条件下杂交SD大鼠中的op和or鼠不同特性归因于不同的遗传多基因成分热量摄入的控制抑肽酶胰脏的交感神经张力以及血浆胰岛素水平快速增长的体重证明这三种的差别会改变大鼠在饮食成分和能量的利用比如b-oxidation的比率和脂肪酸的合成 几个动物组织已经展开研究标记的研究这对揭示肥胖敏感的根本机制有重要作用的对op和or鼠的多种的血液蛋白的研究备受争议这是因为来自不同组织的分泌蛋白通过血液循环分布到其他的身体组织Chang等人研究表明在脂肪组织中or大鼠比op大鼠有相对更多的氧化作用及相对较少的碳水化合物低速率脂肪氧化速率以及高水平的甘油三酯循环和游离脂肪酸这些表型都影响导致饮食过量以及高脂肪饮食诱导的肥胖血浆中高3羟丁酸浓度低胰岛素素含量和皮甾酮也是重要的涉及肥胖危险的暗示标志这是因为他们会形成反馈信号使大脑反应从而限制饮食摄入另外增加的ghrelin信号不是引起饮食诱导肥胖的直接原因减弱的来普汀敏感性则是一个原因之一 近来血液中生物标记的发现已经形成一种蛋白质研究的学科蛋白质研究是一种致力于通过在细胞或体液水平上分析蛋白质的结构和功能来研究所有蛋白质组的科学领域血浆蛋白质组的探索承诺这将是众多生物和临床研究的一大重要突破蛋白的分离鉴定和特征识别以及各种其他蛋白质的相互影响是蛋白质组研究的重心二维脉冲2-DE联合质谱MS能高效分离成千上万的血浆蛋白这种技术使正常和疾病样品表达蛋白质的比较成为可能血浆蛋白中与肥胖相关的成 分对新陈代谢紊乱研究至关重要然而肥胖血浆蛋白质组的研究还未得到广泛的完成 近些年的研究显示对op和or大鼠多样的血浆蛋白的研究将有助于揭露引起肥胖的原因因此通过取自于op和or鼠血浆蛋白的蛋白质组的分析评估血浆蛋白如何介入肥胖敏感或限制又或是其他新型因素对此的影响对我们的研究有力的是迄今为止还没有关于蛋白质组的研究报告对高脂肪饮食条件诱导下op和or大鼠的血浆蛋白进行详细解释 2 材料准备和实验方法 21 动物选择及喂养条件 从日本SLC公司购买5周大的雄性SD大鼠饲养在Deagu大学生物技术部的动物房为了使大鼠适应环境在实验进行前一周给所有大鼠提供水和标准食物大鼠分别饲养在不同的笼子中以排除各种大鼠间的相互影响随机的将大鼠分成两组一组有8只大鼠喂养以低脂肪饮食 12热量来自脂肪对照组另外一组37只大鼠则是高脂肪饮食45热量分自脂肪喂养大鼠的食物从Feed Korea实验室购得LFD和HFD的食物成分见表格1大鼠在56里交替称重根据最高最低体重增加量将大鼠重新分组为opn 6和orn 6鼠这个实验经Daegu 大学的Laboratory Animal Care and use批准许可所有实验程序均在实验经国际健康组织公布的动物关注和运用原则的前提下进行 22 血浆蛋白样品的准备 将大鼠麻醉切除其尾巴取得血样品收集储存在EDTA管中3000转10分钟离心分离血浆后80?低温保存以备用其蛋白浓度由用蛋白测定燃料蛋白的Bradord方法来验证 23 来普汀和胰岛素测量 用大鼠胰岛素测定试剂盒来测量计算血浆胰岛素水平用大鼠来普汀试剂测定盒来测量来普汀水平根据制造商说明书这是夹心酶联免疫反应 24 二维脉冲分析 将各组的6只大鼠的血浆进行二维脉冲测定包括LDF对照组的6只大鼠op鼠和or鼠各6只根据制造商的推荐说明用PROTEIN IEF细胞PH4718厘米的IPG干胶条等电聚焦血浆样品顺着IPG胶条容器以350μ的再水和溶液水合26小时再水合液包括7m尿素2m硫脲4DE CHAPS1mM PMSF以及2的IPG缓冲液对包括25μ白蛋白在内的所有血清蛋白以进行胶条银染色 第一相等电聚焦包括以下操作250伏电压下电泳15分钟250---10000伏下3小时10000伏下6小时最后维持500伏下用于备用二维脉冲等点聚焦后将胶条保持在含有6M尿素2SDS1DTT30甘油以及50mM 的Tris-HCLH 68的溶液中20分钟然后以同样的溶液进一步进行培养但是不能用含有25的碘乙酰胺的DTT代替进行额外的20分钟培养然后固定的IPG胶条用电脉缓冲液清洗两次接着在二维脉冲中将胶条放置在20×20厘米的多聚酰胺胶条中以进行溶解在恒压每块胶条20毫安电泳10小时的SDS不连续系统中完成分离分段根据图形分析和PMF每组6胶条共18胶条上已经分离的蛋白用银染色剂显示可见将胶条放置在含50乙醇和5乙酸的固定液中30分钟然后在30的乙醇中10分钟最后用水洗三次每次5分钟将胶条放在002的硫代硫酸钠溶液中10分钟以激活胶条然后用水洗三次每次半分钟接着再用03的硝酸银纯度999Kojima ChemicalJapan孵育25分钟用水洗两次半分钟后蛋白质在含有3无水碳酸钠002硫代硫酸钠005福尔马林的展开剂中可见再以6的乙酸终止 25 图像采集和数据分析 运用U PowerLook 1120程序显现胶条在输出和数据分析之前将合成的16比特上网同乡转化成TIF格式在获得胶条图像之前运用强度契形梯级进行强度校准对比图像用改良的图像处理器2-DV495 Amersham Biosciences 软件完成对每一个实验参考胶条都是从正常组中随机选择的从其他胶条检测到的斑点与参考胶条上的配对通过计算相对光密度和相对体积来矫正胶条上不同的染色每个斑点的强度体积都进行本底消除处理和总斑点体积归一化最终的斑点体积百分比用来进行比较 26 肽指纹图谱 用肽指纹图谱鉴别蛋白则将蛋白斑点从胶条上切断分离下来以胰岛素混合50ACN01TFA溶解的CHCA浸渍分解再用MALDI-TOF质谱进行处理分析 27 免疫印迹分析 如下所述运用免疫印迹分析验证每组中典型大鼠的血浆中13种蛋白水平取70微克蛋白用样品缓冲液H68的Tris50mM10的甘油01的溴酚蓝5的b巯基乙醇稀释5倍在95摄氏度下加热10分钟再分别以的浓度十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳电泳结束后将其移到聚偏氟二烯薄膜上用TBS-T缓冲液阻断1小时将薄膜用五变的TBS-T缓冲液清洗然后用主要多克隆抗体溶液[包括抗维他命D结合蛋白VDBP 抗胎球蛋白B Ft B 抗GSH-Px抗锌阿发2糖配蛋白ZAG抗载脂蛋白 Apo A-I 抗脱辅基蛋白A-IV 抗脱辅基蛋白E抗血浆铜蓝蛋白Cp 抗运铁蛋白Tf 抗adiponectin抗抵抗素抗视黄醇结合蛋白4RBP4 或者是抗b肌动蛋白圣克鲁斯生物科学和包含1脱脂乳的TBS-T缓冲液以11000培养一小时然后清洗5次薄膜再用HRP结合抗羊免疫球蛋白G抗鼠免疫球蛋白Gzaza或者是抗兔免疫球蛋白G 次位抗体和含有1脱脂乳的TBS-T缓冲液以11000的溶液培养接着用增强化学发光试剂显像通过U PouwerLook 1120软件和图像分析软件扫描进行免疫印迹分析 2统计分析 所有的实验结果都与运用社会科学的数据软件包一维ANOVA程序结果比较数据都以平均值来表示如果005则认为存在差异当ANOVA显示明显的处理差异这种差异由实验技术的最小差异所决定实验用Minitab 16软件进行有效分析由皮尔森线性相关测试决定 3 结果 3高脂肪饮食诱导的op大鼠和or大鼠的表形 随意将老鼠分为2组对照组8只老鼠的以低脂肪饮食喂养另外组37只老鼠以高脂肪饮HFD食喂养根据增加的体重将HFD喂养的大鼠分成op和or它们呈现不同的分布最高和最低体重增加者在分别在常态分布的两端然而各组中的有些大鼠的体重增量交叉重叠进行op 和or大鼠分类的时候将这些重叠部分的大鼠排除在外将其他大鼠血浆用来做可靠的蛋白研究经过分析后我们确定了最少的实验动物数目最终确定每组6只实验大鼠实验期间各组中每只大鼠的体重增加量显示在图片中在实验开始初期大鼠的体重基本类似但是在实验进行4周后体重出现明显差异比如op大鼠在随后时间里一直处在第一的位置根据此图计算op大鼠的总体重大约比or大鼠重了近25 1B但是他们的食物总摄入没有差别1C在运用蛋白质组学方法考察差异蛋白之前分别将三组opor和正常大鼠的血中胰岛素和来普汀水品进行测量 1D 结果显示op大鼠的平均胰岛素水平明显比正常对照组高 005 op和or大鼠的平均来普汀水平显著的比正常对照组高p001另外尽管在统计学水平上是没有的意义我们仍可以发现op大鼠的胰岛素和来普汀水 平显然比or大鼠高这些结果的发现我们必须近一步研究其蛋白质组学 32 运用二维脉冲为基础的蛋白质分析实验来研究op和or大鼠所表达的不同血浆蛋白在H4-7条件下进行一相等点聚焦来分析血浆蛋白质组在二维度时则用12的SDS-PAGE我们可获得良好的分离体另外通过30kDa的薄膜滤过将低分子量蛋白质分离出来以进行二维脉冲实验为了发现低浓度的标记蛋白不去除血浆中的白蛋白结果在H4-7范围内观察到约300个6至240千道尔顿的分子量的特征斑点并且所获得的血浆蛋白记录呈现的成分与数据库中鼠血清蛋白研究组的成分类类似2在这300可视斑点中有30个斑点17种蛋白在组中和组件存在统计学上差别将其与15种主要蛋白一起进行PMF鉴别表格2所鉴定蛋白多肽的氨基酸系列以及OP和OR的相关质谱数据在补充数据表格1和表格信息图片1都可以找到 33在比较op和or大鼠的蛋白水平之前先比较以LFD喂养的大鼠和HFD喂养大鼠的蛋白水平每组中17种蛋白的表达水平存在差异其中7种在HFD条件下明显改变a-1-inhibitor III 前体和丝氨酸肽酶抑制因子分支A亚组件3N这两种蛋白增加而其他5中包括巨球蛋白载脂蛋白C反应性正五聚蛋白相关前体I分支b-16乙酰葡糖氨基转移酶族多聚肽2以及tuftelin相互影响蛋白 TFIP 11则减少它们上调下调或者没有变化的模型在表格二中以箭头表示34 op和or大鼠的血浆蛋白水平的改变 为了比较各组中表达蛋白的差异根据6只大鼠的平均斑点密度和各自斑点密度将鉴别出的蛋白分成三组其中各自蛋白密度作为体重的功能指标分类1符合两者分析方法分类2包括的蛋白质只符合6只大鼠的平均斑点密度分类3包含显示各自体重功能的6只大鼠的各自斑点密度结果显示分类1包括ITIH4胎球蛋 白前体及血浆GSP氧化前体Or大鼠的ITIH4水平含量比其他大鼠高而Ft B胎球蛋白前体和血浆GSP氧化前体比正常大鼠和or大鼠低这使我们猜想这些蛋白可作为预示肥胖的生物标记 分类2的蛋白质包括VDPA前体补体成分4碎片和ZAG由于在op和正常及or大鼠中的含量明显不同也可作为肥胖的标记蛋白4另外将其他6种归为第三类的蛋白作为肥胖风险生物标记是可靠的这是因为在op及正常大鼠和or大鼠中的不同趋势他们包括血清白蛋白TFIP11Ft A 丝氨酸蛋白酶抑制因子分类G成分1前体补体成分3以及ITIH5分类1和2 的p值经SPSS程序ANOVA测试得出并与平均斑点密度比较分类三括号中p值结果由皮尔森线性相关有SPSS程序得出呈现体重及6只大鼠各自斑点密度的线性相关同时我们也通过post-hoc Fischer分析技术分析蛋白质组数据结果在信息表格2中 35 尽管在正常及or大鼠和op大鼠中的蛋白质组数据暗示不同表达水平的蛋白质但是仍然不排除蛋白质组分析时存在的技术及人为错误通过13种主要蛋白的免疫印迹蛋白分析来解释这个问题结果数据符合我们的蛋白质组实验数据比较正常大鼠及or大鼠和op大鼠ITIH4和VDPB水平明显上调然而Ft BGSH-PX和ZAG则下调蛋白质成分脱辅基蛋白A -I Apo A-IV Apo E Cp和 Tf也与蛋白质组数据相符6B另外我们对不能被蛋白质组技术所观察到的符合新陈代谢综合症的主要血浆蛋白的水平包括乙二腈抑制剂和RBP4等也进行了研究发现己二腈及其抑制器的蛋白质水平在HFD条件下明显改变但在op和or大鼠中没有显著改变然而RBP4蛋白水平在op大鼠中增加而在op及正常大鼠中则没有 4近年的研究我们通过二维脉冲及MALDI-TOFMS完成HFD瘦小和HFD喂养条 件下的肥胖大鼠两者之间的血浆蛋白表达水品的比较旨在更加深入学习肥胖的病理揭示与肥胖敏感相关的血浆蛋白标记为了保证在疾病中运用可靠的标记蛋白必须提高警惕我们将12种不同的调整蛋白通过两种不同的分析方法根据控制成分分成三组一种方法是根据每组中6只大鼠的平均血浆蛋白浓缩物另外一种方法是代表体重功能的6只大鼠的各自血浆蛋白水平其中惊人的发现之一就是包括ITIH4Ft B前体GSP-PX前体这三种蛋白为了阻止饮食诱导型肥胖而高度表达根据这两种方法及免疫印记分析方法证明得出Ft B前体GSP-PX前体水平提高的同时ITIH4的血浆蛋白水平下降另外增加的9种在op和or及正常大鼠中的含量存在有效的差异然而由于这几种蛋白的图型与这两种分析方法不一致如果想要将这几种蛋白列入作为可能的肥胖生物标记还需要进一步的探索研究41 分类1蛋白不同的图型与两种6只大鼠的平均或各自水平都相符合 比较6只op和or及正常大鼠的平均或各自蛋白质水平发现ITIH4Ft B前体 GSP-px前体这三种血浆蛋白质水平显示出一致的水平趋势3与正常及or大鼠比较op大鼠的ITIH4的水平显著上调而Ft B前体GSH-PX前体则明显下调这三种蛋白的不同表达水平的结果有western证明所得 ITIH属于IaI组蛋白是一种血浆蛋白酶抑制因子他们功能很有特点比如作为多肽氨酸前体链接到成熟葡萄糖氨聚酶链上改变一定的功能形态也可以和多种分子形成葡萄糖胺聚糖键随着对这种分子的越来越多的研究出现了更多关于它的生理病理的问题的研究就目前所知至少有5中基因H1H5等涉及IaI组的合成但是他们的功能却大多数未知不过在过去的二十年里ITIH在涉及宏观生理和病理中的作用已经被解释Kashyap及其同事发现其在急性缺血患者血液中缺失因此认为可将ITIH作为急性缺血的新型生物标记除了抗炎症反应以外ITIH在实 体瘤中也是明显下调的标记但是迄今未知还没有证明显示它与肥胖有关纵然他的功能仍然有待解释中但是我们首次在op大鼠中发现ITIH血浆蛋白浓度比or及正常大鼠高相反同样比较op和or及正常大鼠IaI组中的另外一种蛋白ITIH3在体重功能上显示不同的表达水平5这暗示这种蛋白水平与体重呈现负相关 GSH-PX认为是血浆中的主要抗氧化剂活性物质肥胖受试者血浆中GSH-PX的下调伴随着脂肪组织的GSH-PX氧化失调从而导致炎症信号增加和应激压力升高等结果这也许也是全身氧化应激条件下的肥胖相关性上升和新陈代谢综合症有关Op肥胖发育趋向大鼠中的GSH-PX前体表达水平明显减少而在or和正常大鼠中却增加这就好像or和正常大鼠有个调控程序对抗细胞氧化应激总的来说过度表达的GSH-PX前体使or大鼠抵制氧化应激从而延缓肥胖发展然而其他氧化应激分子的蛋白水平例如补体和Tf前体在各组中则没有区别 胎球蛋白是一种胰岛素受体酪氨酸激酶内源性抑制因子因此循环的高含量水平Ft A与龋齿类动物和人类体内的胰岛素抑制剂有关当肝脏的脂肪累积时发现Ft A及它的血浆蛋白水平表达增大且新陈代谢综合症的的循环Ft A含量也相应增加如此看来Ft A增加鼠类胰岛素敏感度抑制在HFD条件诱导下生成脂肪研究显示在蛋白水平和体重间Ft A显示不同的相关性在op大鼠中的负性相关及or和正常大鼠的正性相关5另外一方面与FtA不同Ft B还没有建立与这种功能的相关性且还没有报告显示Ft B与肥胖有关Oliver等人发现与Ft A类似物一样在实验诱导的炎症急变期Ft B信使RNA水平增加在试验中我们明显发现通过血浆蛋白质组分析链唑霉素诱导糖尿病大鼠的血浆Ft B减少近年来的研究发现比较op大鼠和or大鼠及正常大鼠不管是平均还是各自Ft B数量op大鼠的Ft B前体数量明显比较低总结我们认为增加的Ft A和Ft B蛋白水平均与抑制HFD 诱导肥胖有一定相关性 42 分类蛋白2他们不同图型只与6只大鼠的平均水平相关 比较op和or正常大鼠的血浆平均蛋白含量发现VDBP前体补体成分4碎片和ZAG这三者蛋白显示不同的表达水平4op大鼠中VDBP前体和C4显著增高的同时ZAG确减少VDBP前体和C4的差异表达由免疫印迹分析得到证实6VDBP是一种连有维他命D及其代谢产物的多功能血浆蛋白因此将维他命D等运输分布于靶组织此外他参与葡萄糖和维他命D的代谢肌动蛋白清除游离脂肪酸转运及趋向运动并与一些疾病如糖尿病和肥胖相关特别指出的是近年的研究旨在探索肥胖与维他命D之间的关系Taes等人发现在成年比利时男性中VDBP浓缩物确实与体重指数脂肪量及来普汀谁水平相关在HFD喂养的雄性SD大鼠中也报告显示其维生素D结合蛋白的升高维生素D结合蛋白基因的多形态表达也与脂肪含量的百分比有着重要联系在这种联系下试验中显示op大鼠体内的该蛋白含量比正常及or大鼠高4指示血浆维生素D结合蛋白可能成为一种指示肥胖病理和敏感趋向的潜在生物标记 补体C4是一种多肽炎症介质可在血浆中产生过敏毒素补体系统旁路的所有因子都在脂肪组织中合成一些补体还可能结合体脂肪补体C4也在网膜脂肪组织中高度表达这种联系可能与最初体重调整身高追踪调查及生活方式等因素引起的体重增加有关这些数据暗示补体系统包括补体C4或许涉及肥胖发展同样的我们的试验显示补体C4的碎片含量在op大鼠中比正常及or大鼠表达多4这些数据表明补体C4可被认为是肥胖的重要暗示因子然而补体C3在op大鼠中则表现一种蛋白含量水平与体重增加的负相关2这肥胖中的两种补体表达的矛盾结果也许是因为存在多种补体活化系统从而成分分裂的多样碎片 SERPING 1是一种糖化血浆蛋白通过抑制活化的补体C第一成分r亚单位和s亚单位来调节补体激活系统补体系统的经典旁路中补体第一成分的r亚单位活化补体第一成分的s亚单位活化的s亚单位进一步活化补体第四成分近期研究显示在op大鼠中随着体重增加SERPING1蛋白水平含量减少这种结果显示如果SERPING1表达的蛋白含量减少则补体C4的激活含量增加从而导致op大鼠发生炎症反应 ZAG是于1961年首先从人体分离得到的可溶性蛋白可能在脂肪代谢中起着至关重要的作用众多实验数据证明增加的ZAG含量减少体重的增加这可能是它通过对脂质的分解作用减少身体脂肪另外ZAG较少的表达可能增加脂质在脂肪组织中的积累从而增加肥胖的风险关于ZAG在脂质中代谢的作用研究是来自近期对ZAG显著表达的转基因大鼠研究的结果以这种大鼠为实验模型是因为这是一种在高脂肪饮食诱导下对体重增长敏感的种类另外在ZAG高度表达的大鼠的脂肪组织中发现荷尔蒙敏感的脂肪分解酶信使RNA含量增加从而降低体重以及附睾的脂肪含量于早期的研究相符or大鼠中ZAG的蛋白水平明显比op大鼠高 4 因此向上调节ZAG可能是一种有效潜在治疗肥胖的方法同时血浆ZAG指标也可作为指示肥胖敏感的重要指标 43分类3于代表6只大鼠体重功能指示的个别水平相符合 与or及正常大鼠比较OP大鼠血浆中血清蛋白和TFIP1增加同时SERPING1前体胎球蛋白AITIH3和补体3却降低血浆中最丰富的血清白蛋白是多种疏水性类固醇激素的运输载体也可能是氯化高铁血红素和脂肪酸的运载体是一种急变期的蛋白在血清蛋白浓度和肥胖之间存在着矛盾比如Nishimura等人发表报告指出肥胖的儿童血清蛋白含量高然而Salas-Salvado等人则指出与正常对照组 相比肥胖儿童的血清蛋白含量还是低的并且和体重指数成负相关性 TFTP 11是一种从Cajal体发现的一种作用与剪接体上具有分解作用的核内蛋白Cajal是一种在增生细胞内发现的核内球形细胞器涉及RNA相关的代谢过程迄今为止还没有任何报告指出它和疾病存在关系我们的实验首次证明在op大鼠中血清蛋白水平和TFIP11与体重增加呈现相反的关系这在or及正常大鼠中则相反运用免疫印迹分析我们进一步研究三种主要脂肪移动的状况这是蛋白质组学所不能观察到的6C包括已二睛抵抗素和RBP4和or及正常大鼠比较op大鼠中的RBP4蛋白水平明显比较高相反尽管在HFD喂养下已二睛及抵抗素含量在op和or大鼠找中都有所增加但没有明显的区别6这可能暗示RBP4可能是导致op和or大鼠模型病理形态区别的原因7 总而言之对HFD饮食喂养引导肥胖的op和or大鼠的血浆蛋白质组进行分析其12种蛋白呈现不同的表现其中一些蛋白与肥胖存在联系实验中最大的发现在于首次鉴定ITIH4和胎球蛋白B这两种蛋白与肥胖敏感或抵抗的联系我们有理由相信这两种蛋白能在肥胖中影响诱导因素而对他们功能的研究我们将继续研究与以前的研究相比这次研究对鉴别op和or大鼠是一个重大突破而且为人类对肥胖的病理研究提供了极其有价值的依据 5 略 原文 23