小鼠牙胚裸鼠体内移植的形态学观察

小鼠牙胚裸鼠体内移植的形态学观察 小鼠牙胚裸鼠体内移植的形态学观察 ? 378? 上海口腔医学2006年8月第15卷第4期 Shangh~JournalofStomatologyVo1.15No.4August,2006 [文章编号]1006—7248(2006)04—0378—05 小鼠牙胚裸鼠体内移植的形态学观察 谢瑞阅,杨丕山,李纾 (山东大学口腔医学院牙周病科,山东济南250012) ? 基础研究? BasicScientificStudy 【摘要】目的:观察小鼠牙胚裸鼠体内移植后的形态学变化.方法:将出生后5天的小鼠的下颌第一磨牙牙胚异位移 植到成年裸鼠背部肌层中,在移植后第7天和第14天分别取出植入的牙胚,常规制片,HE染色,显微镜下观察.另 取出生后12天和19天的小鼠各1只,常规制片,HE染色,作移植后不同时间的对照.结果:肉眼观察发现,移植后 牙胚生长于肌浅层,组织相容性好,面有丰富的毛细血管;组织学观察表明:移植后的牙胚可继续发育,但比正常 发育的牙胚速度减慢.牙本质层较薄.移植后形成大量牙本质小管,排列不规则的牙本质.虽然上皮根鞘位置变化不 明显,但牙根可继续根向延伸.髓室底形成,髓腔缩小,根部钙化程度明显增强.移植后第7天,牙胚内外均有炎细胞 浸润;但移植后第14天的牙胚,均未见明显的炎症现象.结论:小鼠牙胚裸鼠肌浅层移植后有一定的发育趋势,可以 短期用于牙根发育的研究. 【关键词】小鼠;牙胚;裸鼠;移植;发育 【中图分类号】R780.2【文献标识码】A AhistologicalinnovativestudyofBalb/cmousetoothgermtransplantedtonudemouseinvivoXIERui-yue. YANGPi— shan,LIShu.(DepartmentofPeriodontology,SchoolofStomatology,ShandongUniversity.Jinan250012, ShandongProvince,China) 【Abstract】 PURPOSE:Toobservedthechangesofthedevelopedmouse'Sdentalgermsaftertransplantingintonude mouseandfindsometheoreticalfoundationforestablishinganinnovativeexperimentalmode1.METHODS:Eighttooth germsfromfour5daypostnatalBalb/cmiceweretransplantedtothebackmusclesoftheadultnudemice.Atseventh andfourteenthdayaftergrafting,thegermswerecollected,fixed,demineralized,dehydrated,andembeddedinwax.Serial sectionsof5txmthickweremadefollowingtheroutinemethods,stainedwithhaematoxylin—eosindyingsolution,and observedunderalightmicroscope.Themandibularfirstmolarsweretakenoutfromthe12and19daypostnatalmouse. Serialsectionsof5txmthickweremadefollowingtheroutinemethods,thencomparedwiththegermsaftergraft. RESULTS:Allimplantationswerelocatedinthesuperficialmuscleswithabundantcapillaryvessels.Thedentalgerms couldfurtherdevelopedaftergraftingunderthemicroscope,butslowerthandentalgermsself-development.Thelayerof dentinwasthin,plentyofdentinwithdisorganizeddentintubuleformedaftergrafting.AlthoughthelocationofHertwig'S epithelialrootsheathhardlymoved,therootsdevelopedfurther.Thefloorofpulpchamberco uldformandthepulp— chamberswereshrinking.Thedegreeofcalcificationintheareaofrootincreasedveryclearly.Theinflammatoryreactldn wasfoundat7daywhilehardlynotedat14dayaftergrafting.CONCLUSIONS:Itsuggeststhatlatedevelopmentof mousetoothgermscouldfurtherdevelopafterheterotopictransplantationwithinthesuperficialmusclesofthenudemouse. Thismodelisusefulforstudyoftoothrootdevelopmentinshorttime.SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationof China(GrantNo.3037153)andAwardFundforExcellentYoungandMiddle-AgedScientistsofShandongProvince(Grant No.02BS096). 【Keywords】Mouse;Toothgerm;Nudemouse;Transplant;Development ShanghaiJStomatol,2006,15(4):378?382.【收稿日期】2005—12—12;【修回日期]2006—04—28 【基金项目】国家自然科学基金(30371537);山东省优秀中青年科学家奖 励基金(02BS096) 【作者简介】谢瑞阅(1979一).女,河南人,硕士研究生, E—mail:xieryO07@163.com 【通讯作者】杨丕山,Td:053l一88382368,E—mail:yangps@sdu.edu.ca ~2oo6年版权归《上海口腔医学》编辑部所有 谢瑞阅.等.小鼠牙胚裸鼠体内移植的形态学观察 XIERui— yue,eta1.Ahistol0calinnovativestudyofBalb/cm0usetoothgermtransplantedt0nudemouseinviv0'379? 目前研究牙发育常用的手段或方法主要有野生 型和突变型鼠体内直接取材,利用体外人工培 养基进行器官培养[I]以及体内牙胚移植等[2].由于这 些方法均存在着一定的不足,都只能用于牙胚发育 早期的研究.牙发育的全过程包括牙冠的发育及牙 根的发育,无论在基础研究中还是在临床治疗上,牙 根及牙周支持组织的形成越来越受到重视,但其形 成机制目前尚不明确,此前的实验模型并不能满足 这种研究的需要.本实验,选用有免疫功能缺陷的裸 鼠作为受体鼠,出生后5天的小鼠作为供体鼠,对移 植后不同时间的牙胚进行系列观察,研究其发育情 况,为寻找研究牙发育后期的实验模型奠定基础. 胚,缝合,局涂红霉素软膏,于层流架中饲养. 1.3实验牙胚的形态学观察 移植后第7和14天,分别取2只裸鼠,相同麻 醉条件下取出植入的牙胚,以PBS(pH7.4)配制的 4%多聚甲醛4cI=固定过夜.根据不同的培养时间,分 别脱钙1,2周,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包 埋,5txm连续切片,HE染色,形态学观察并照相记 录. 1.4供体鼠牙胚的形态学观察 分别取出生后5,12,19天的Balb/c小鼠(各1 只)的下颌第一磨牙牙胚,常规包埋.5txm连续切 片,HE染色.作移植后不同时间的对照. 1材料与方法2结果 1.1主要实验材料与仪器设备 1.1.1实验动物及试剂出生后第5天的SPF级 Balb/c小鼠5只,出生后第12天和19天的SPF级 Balb/c小鼠各1只(均由山东大学实验动物中心提 供);成年Balb/c裸鼠4只(北京协和医院动物中 心);戊巴比妥钠(Sigma,USA);Hank液;胎牛血清 (Gibco,USA);DMEM培养液(Gibco,USA);甲酸(天 津市科密欧化学试剂开发中心),甲酸钠(天津市广 成化学试剂有限公司),复合甲酸脱钙液(300ml甲酸 中加34g甲酸钠). 1.1.2仪器与设备万能研究级光学显微镜及成 像系统(Olympus,BX51),体视显微镜及成像系统 (Olympus,SZX9),超净工作台(苏州净化设备公司), 层流架(吴县市净化技术研究所),组织切片机 (LeicaRM2135,German). 1.2操作过程 1.2.1供体鼠牙胚的获取将4只Balb/c乳鼠引 颈处死,齐双耳后缘取其头部,以双侧下颌支为标 志,游离下颌骨,去除舌体,即可见双侧下颌骨耠面 有一白色部位即第一磨牙牙胚所在处,尽量去净周 围软组织,放人含500U青霉素和链霉素的Hank液 中.无菌环境中,20倍体视显微镜下在DMEM中去 除双侧下颌骨骨板,即可见第一磨牙牙胚,取出牙 胚,放人含15%FCS的DMEM中,4cI=备用. 1.2.2移植过程将每只裸鼠用1.25%戊巴比妥钠 30mg/kg腹腔注射麻醉,辅以2%盐酸利多卡因皮下 注射麻醉.沿背部双侧作2条纵行切口:切开皮肤, 分离筋膜,钝分离肌浅层,每一切口各植入1个牙 2.1移植前牙胚的发育状态 HE染色表明.出生后5天的牙胚处于钟状晚 期,牙冠基本形成,有一薄层牙釉质,前期牙本质和 牙本质,牙本质小管排列规则.成釉细胞和成牙本质 细胞呈高柱状,排列整齐.细胞核远离基膜.未见牙 根形态(图1).自然状态下,出生后12天的牙胚:上 皮根鞘根向延伸,牙根形态出现并部分形成(图2). 出生后19天的牙胚,牙根已大部分形成.且发育良 好,上皮根鞘根向延伸f图3). 2.2移植后的发育情况 肉眼观:牙胚移植后不同时间内,伤口愈合良 好,分离取出的牙胚,可见牙胚生长于肌浅层,组织 相容性好,无明显炎症反应,表面有丰富的毛细血管 网(图4).镜下观:移植后的牙胚均比相同发育时段 正常发育的牙胚发育缓慢.牙本质层较薄,牙根发育 较少.移植后第7天的牙胚,牙冠形态基本正常,牙本质分为矿化程度明显不同的2层(图5A):外层染 色深,为成熟牙本质;内层染色较浅,为前期牙本质. 虽然上皮根鞘位置变化不明显,但明显弯曲.根分叉 初步形成,可观察到牙根的发育趋势.髓腔内外有大 量的炎细胞浸润(图5A).髓室底由分界明显的2层 牙本质和牙骨质构成:近髓腔侧为前期牙本质(图 5B—a),中间为牙本质(图5B—b),外层为薄层牙骨质 (图5B—c).移植后第14天,牙冠形态比较正常,上皮 根鞘位置变化仍不明显,转折方向不确定,部分向内 弯曲,部分向外弯曲(图6A).上皮转折处有大量矿化 物质沉积(图6C),牙根的发展方向比较明显.髓室底 增厚.矿化程度增加,髓腔缩小,上皮转折处有大量 8f】『12dtqH*Ij4 h;m1+h~Tl.u口【l?1"viJ?jNo4Ant…n 王肝蠢篙U,2.川x41Mnmt?Irthert)o(I…dlHI-x4I 目5#7A$$ 2-"自$.自自? -&【鹰.自目 "目(1lE.x4):n自$)$ fhJ一目目…fliex101 ?gu…DenL~l一these,enlhdaya~lurningAShape dmrcn?……d~orma[Theln【…dj?ddlnln'J la)r:IheIeJisdenlia.dIhelr…perdentinleiniti||I 1~4}1shape??ul几bee1'thel…Jn?Ilerlw…Hltshealh h.1~l1)|I10'州hulhent0l11iouslyI…wheadIl,…f l?ll…tn,~'ellsi]tfiltral(~lhl?hinandl川It)r【hpulpcaYit~ {HE.x4IBFL~mrrpulpchamber…q.?p|,sed0fdentin ldenlin{hI,andRIhi.1ayer?mc?}cHE1n) 矿化物拢豫,有细胞包J其f?,1日成娄目佯牙日质 牙髓细咆讣市均,牙髓内订扩怅的毛蜘l川莆出蟛 求明显帅髭细胞浸润{罔6A)牙本质屡叨上曾厚 圩3部分:蚺讣层与问层化程度较濠但仆层小 管摊刮规n!_】_6B—H).巾日I层_,管川刈素乱f图6B一 ,)内崖比群睦较浅(1剖6B)为前期牙乖匝 ?自【mm JF?ui—vuI【【ti~t,Ic~ica【i……vJ…IIVl?llalll^|l?u(oulh~enilII1l1【a?『1}1…】hIqlliiiv…I 目8I4}?A自勺 目#{J.?* 自,m?女l1 ?自jH"目$目m*1非 calm扫}舌Lchi前c'I…Ex10)C &f'目日?jc…×l?) I'igure6lnl||IHrm】Ilr,m~cenlhda)after~raP,ingA1he 10ca"…fI[e~wig'sroIlI~heulhhuldhm??vcfhuttheL1ldeIlcv I?them…?hervl【…?1PadIFh)t)r?pulpI…l1…? thickeningD…uIualci?~lJuIIi?1cJIsc(IFhepillP?…r welIdistributednddilat~(I"】I1…'v…?l'eredIn pulp…vity?ohvlou~lnI1?nl_n日'?rvcell~…Jh1.vdHrl?! layernrdemin……dofIhrccl…rIhcqlu[~r?a n'a'urdnI-wlqIirulr'le|'…III?hlIl…|ll,thenliddlcw maturdentintoowh{h!ithilrulrd~nlln—luhule~Ih】Ihe inner…predenlinIc】{ILE×【l?LolIminendizt,dn'HlriHb_ deposiledar…dIhel{l1wi…Hdshuulhi—tJhad)II匝xlI? 3讨论 床I.计1:蚺的生障录川芷修复 纠.还常将恨尚未嘭戚日一嘻矸移植到缺失可 部位以瞎复缺圩.然而船凼许多并发疗造成清疗失 I住升周病f_=『疗研究面.日前集中在引导牙州 组织再生术I~uidedII『Pre~eller.Il】I】l1,(歧牙嗍 组织上程挂术期促进牙周雏的冉.但IfI干牙 骨质的再生讯度所限疗敬井不f分理想日前. 牙根形成琏汗冉乍的饥_制还不i什湍楚 小鼠_才胚足研究牙发育通常选用的贸骑模型. 研究擞州.纽I开始形成前的圩.移值itJ【I 形成正常牙冠fi体外用人T培养肇培养竹牙旺 可继续发育.成釉细胞平?幢牛奉质细胞能够分化成 熟.井行前期汗啦质彤J,但求奇等蛙蚍.蒋止晚 Il_J的牙胚体外培椿到筘I2天+即可细_胞熊世行 Ht变,可能是丁才艟育再期牛K鞍限.中纯的几工 培养基已十能适应绯绒生长的苦口而且十此 时牙发育埘节信号概为复袭,体外培荐不能亢仝模 拟休内牛K环境.此f小虾堵养不能J订于牙发 的研究日前.体外培养景晚的从肛腑期第18兀 婧培荐移植法主磐足将完的或重纽q旺E移髓/, 同种芹怀鼠的眼前冉肾被膊应.悼脏圩 措窝以墁箕薛期的码等处培养段时M睛取 …牙肝.观祭分}斤续键育情等?苷 十无的wlL赶鼠的址r钢状期n上颌第 辟牙牙肛榷凡种件怍成年鼠}】(."耳出移植l 第7,J4天.发育止常.Il』后船蕾培荐肘 的延K.上纠胞侵八幔.丁_:婿产十凝症厦J,,破 H,世育旧牙纽织火骨样奉质溶解.骨样组织 彤幢移值后筇6怪个q肛包括部讣才周的 宿主织敲一日忡组织同块所取代 冠经岢完成时内釉f.应和讣龠HI应叠环 址,折井触台,川忸增牛T报诞伸J成上皮根 鞘牙根:蚺发育}:这一叫戳下H关基l的表 拄牙筻育的均可能发生改变某些在冠发 育叫表沾H:的堇J能击矗迅.'i根部发青芰 的基蝓丧.导敏J'I同根蛙育机制lj下 ' . 但屉人…对这}一眦J的姒尚鞭肤浅…十 泄柯行理想的宴骑模蜊.违方而的川究口前主 非『t十_牙发育昀早期对成卸I胞盟_十奉质细胞 的细胞仆化矸,面态的形成【瞌0之的州控 f研究 "小毹爿=忏移植列 奉实骑将|fl生后5天的 成牛B,^裸鼠背部皮下,J垃培养小同时的 态学观察.期璺观圩根的变化情从J|『试图灯将 束建研究圩根发肖?实验横堕定盐…生 5天的牙胜.:《发育率充.上皮根峭已经肜 啦牙根日lJ将计始发育实验结牡显小.裆植后第7 天牙胚形态木正常.圩根继续发育虽然与}?常 啦肯的牙肛扪比.1应根鞘根向延仲叫显旧I 内折.酏州上虚根靴继续仲只圯丁失圭了j 其向正常方向延仲的罔隶.导致』弯方向蹬 政变叫能是罔为佟前圩厨制组织q存在引导 上根悄根蜒伸的素.十移植失盘了这种 素.皮恨鞘弯山向不确定移柄后筚犬的牙 忏上I撤鞘可向各个打向弯俺在同牙肛的 同部位弯『}n的力向咀]能硐蜓能蜕叫遮问 移卡阿1舌销l灭的哥,上转折址有凡量的目 化物匝沉{寸L舡移植的2培幂时段.均观察 到牙根琳续疑育.iIE【月根发肯拜泄有停止J【I 垃旭,』I翌.皮根向l卜常方向延fl?矸恨将会册着 ? 382? 上海口腔医学2006年8月第15卷第4期 ShanghaiJoumMofStomatologyVo1.15No.4August,2006 上皮根鞘的方向生长.牙本质小管排列紊乱的牙本 质层明显增厚.说明成牙本质细胞排列紊乱,且仍 保持其旺盛的分泌功能.这与以前的研究结果一 致[21. 以前的实验曾经证实宿主的免疫因素是造成牙 胚发生骨化反应的重要原因之一51,本实验用裸鼠 作为受体鼠.因其具有免疫缺陷的特性,可在最大程 度上避免排异反应.实验中所有组的牙胚在移植后 第7天均观察到炎症反应,其原因可能是由于移植 过程中无菌操作不够严格,或者是因为移植作为一 种创伤因素.宿主对其作出的反应.通过牙胚自身的 修复作用,以及局部抗生素的应用,控制了炎症的发 展.使牙胚得以继续发育.到移植后第14天,所有组 的牙胚内均未发现炎症细胞,证明没有来自宿主的 排异反应.也没有观察到骨化反应,说明宿主的免疫 排斥反应可能是牙胚发生骨化反应的关键因素. 【参考文献】 【l】李锋,吴补领,余擎.,J,鼠牙胚体外发育过程中组织形态学变化 的观察【J】.中国临床康复,2004,8(14):2634-2635. 【2】MezadriTJ,Rivero-TamesD,BoabaidF,eta1.Developmentof toothgermheterotopicallygraftedwithintheearskin.An histologicalstudyintherat?.Med0ral,2004,9(3):243-252. 【31BanssO,EngelkeW,FenskeC,eta1.Autotransplant~ionof immaturethirdmolarsintoedentulousandatrophiedjawsections 【J】.IntJ0ralMaxillofacSurg,2004,33(6):558—563. 【4】Kolenc-Fus'eFJ.Toothagenesis:insearchofmutationsbehind faileddentaldevelopment.MedOralPatolOralCirBucal, 2004,9(5):385-395. 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