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24例多发性骨髓瘤患者T辅助细胞亚群
的检测及遗传学分析
曾美秀1 谢晓宝1 王志林1 邱国强1 曹祥山1 邹昭玲1
[摘要] 目的:分析多发性骨髓瘤(MM)患者外周血Thl、Th2细胞数量和比例及骨髓细胞分子遗传学变
化,探讨其相关关系及临床意义。
:流式细胞术(FCM)检测分析24例MM患者外周静脉血Thl、Th2细胞
的比例并采用荧光原化杂交技术(FISH)对其骨髓细胞13q14缺失、p53缺失、IgH易位重排进行检测。结果:①
Ⅲ期MM患者Thl细胞比例较对照组显著降低,Ⅱ、Ⅲ期MM患者Th2细胞比例较对照组及I期降低.Ⅲ期
MM患者Thl/Th2比值较对照组、I及Ⅱ期增高(P
标准¨’,其中男16例,女8例;
中位年龄62(37---76)岁。根据Durie-Salmon分期
工期5例,n期4例,Ⅲ期15例。外周血正常对照
20例,为健康志愿者,男14例,女6例,平均58(33
~80)岁,均无肿瘤、外伤、感染、传染病及自身免疫
性疾病史。骨髓上E常对照5例,为非血液系统恶性
疾病患者。
1.2方法
1.2.1 试剂及器材 鼠抗人单克隆抗体
CD3一FITC、CD8一PercP、IFN一7一PE、II。-4一PE及其相
应同型对照IgGl一PE、IgG2a—PE和FACSCalibur
流式细胞仪均为美国BectonDickinson(BD)公司
产品。低温冷冻离心机,CO。培养箱。超净工作台。
佛波酯(phorbol12一myristate-13-acetate,PMA)、
离子霉素(Ionomycin)及BFA(BrefeldinA)购自美
国Sigma公司。针对13q14的D13S319及RBl
DNA探针、针对14q32的IGHDNA探针、针对
17p13的P53DNA探针均购自北京金菩嘉医疗科
技有限公司。荧光显微镜为日本Olympus公司产
品。
1.2.2Thl/Th2的检测和分析无菌抽取每例患
者和正常对照者外周血2ml,肝素钠抗凝。取
400址l,平均分为刺激管及未刺激管。前者加入
PMA(1mg/L)、ionomycin(50rag/l。)以扩大原有
细胞因子的产量,同时加入BFA(o.5g/L)抑制高
尔基体对细胞因子的转运;后者仪加入BFA。混匀
后分孑L加入96孑L板巾,37℃、5%CO。培养箱中培
养5h。收集细胞各分对照管和试验管,分别加入
20/ACD3、CD8进行胞膜
面标记染色,避光孵育
15min,固定洗涤细胞进行破膜及胞内因子标记,
每管中加入100“l破膜剂及相应的细胞内因子单
抗IFN一7、IL一4和阴性对照各20”1,室温避光15
min。洗涤并用500肚lPBS重悬细胞,上机检测。
采用Cellquest获取分析细胞,每次均收集细胞10
000个。先以侧向散射角(SSC)及CD3确定CD3+
T淋巴细胞群,再以CD3和CD8单抗设门,用
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CD3+CD8细胞群中IFN一7和II。一4的阳性表达率
来分析Thl、Th2细胞的表达水平。
1.2.3间期FISH的操作及分析无菌抽取每例
患者和正常对照者新鲜骨髓5ml,肝素抗凝。参照
文献(23完成染色体制备,杂交前一天滴片,室温老
化过夜。随后按照探针试剂说明
进行DNA变性、
杂交、洗涤、复染,荧光显微镜观察结果。GPL
D13S319探针在正常问期细胞中表现为2个红色
信号(2R),只有1个红色信号时(1R)判断为陬j性。
GPLRBl探针及(;PLP53探针在正常间期细胞中
分别表现为2个绿色信号(2G),只有1个绿色信号
时(1G)判断为阳性。GPI。IGH断裂苇排探针在正
常问期细胞中表现为2个黄色融合信号(2F),出现
相互分离的红色信号、绿色信号和1个黄色融合信
号(1R1GIF)时判断为阳性(图l~4)。分析每例正
常对照标本的200个问期细胞,计算出阳性信号的
百分率及其均值(z)和标准差(s),以阳性细胞数>
;+35作为标准。分析每例MM患者标本的100
个问期细胞,计算阳性信号的百分率。超过标准者
判定为阳性。
1.3统计学处理
所有数据均由SPSSll.5forWindows统计软
件完成。T辅助细胞亚群分析采J1j独立t检验、一
元方差分析完成。Thl/Th2比值与132一MG栩关性
比较采』fjSpearm相关分析。del(13q14,、p53缺失
和lgH基因重排阿1性率与Durie-Salmon分期的相
关性用Fisher精确概率法统计。P<0.05为差异
有统计学意义。
2结果
2.1不同临床分期MM患者Th哑群的变化
Ⅲ期MM患者7Fhl细胞较对照组显著降低,
n、11l期MM患者Th2细胞比例较对照射l及l期
降低。ⅡI期MM患者Thl/Th2比值较对照组、I
及Ⅱ期增高(P<0.05或P<0.01)。见表1。
2.2 FISH检验结果及与临床分期的关系
24例MM患者均采川含I)13S319、RBl、IGH、
图1 探针GP!。RBI对13q14进行间期FISll检测图仅出现1个绿色信号时(1G)表示13ql4缺失;图2 探针GPI—IGH
对14q32进行间期FIStl检测图出现黄红绿3个信号表示发生了IGH基因重排;图3探针GPL!)13S319对13q14进行
间期FISH检测图仅出现1个红色信号时(1R)表示13q14缺失;图4探针GPLP53对17p13进行间期FISH检测图仅
出现1个绿色信号时(1G)表示17P13缺失
万方数据
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表1不同临床MM患者和对照组T辅助细胞亚群的
表达水平 ;士s
与对照组比较,1’P<0.05,2’P<0.01;与l期比较,
”P<0.05,”P<0.01;与Ⅱ期比较,”P<0.05
P53探针进行检测,结果检出9例13q14缺失,其
中5例D13S319阳性(20。83%),6例RBl阳性
(25.00%),8例IGH重排(33.33%),3例P53缺
失(12.50%)。其中有1例同时检出13、14、17号
染色体异常,1例同时检出13、17号染色体异常。
del(13q14)、14q32易位重排及del(17p13)阳性率
在DS分期之间无相关性(P>0.05)。见表2。
表2 DS分期与del(13q14)、del(17p13J及14q32易
位重排的关系 例
临床分期例数del(17p13)del(13q14)14q32易位重排
2.3FISH预后风险分组与Thl/Th2的关系
以是否存在del(13q14)和(或)del(17p13)把病
例组按预后风险分组为高危组和标危组2组∞3,分
析比较发现高危组MM患者Thl及Th2细胞均较
标危组明显降低,Thl/Th2比值较之升高(P<
0.05或P<0.01)。见表3。
表3 Thl/Th2在FISH预后风险分组的表达分析
Z工5
与标危组比较,”P