【doc】兔红细胞的荧光标记及寿命检测法

【doc】兔红细胞的荧光标记及寿命检测法 兔红细胞的荧光标记及寿命检测法 410 兔红细胞的荧光标记及寿命检测法 任素萍,马恩普,刘秀珍,韩颖,刘安,靳鹏,董波 (1北京输血医学研究所,2.北京放射医学研究所,北京100850) 摘要目的:建立一种简单有效的兔红细胞标记及寿命检测法,并对GMA保养液4?保存的红细胞质量进行评价. 方法:日本大耳白兔动脉取血,红细胞用异硫氰酸荧光素(FITC)标记后自体回输,定期检测荧光标记的红细胞数所 占百分比.应用SAS软件对所得数据进行回归,根据方程计算兔体内标记红细胞的24h回收率和半寿期. 结果:正常兔红细胞的24h回收率是93.76%?5.40%,半寿期为(22.50?4.37)d,与有关文献相符.GMA液4? 保存21d的红细胞24h回收率为89.13%?7.10%,半寿期为(11.41?1.63)d,符合输注条件.结论:与其他红细 胞体内标记方法相比,FITC标记法简便实用,价格便宜,不具有放射性危害,可用于输注红细胞的质量评价和体内 生物学特性分析. 关键词:红细胞;细胞标记;寿命;保存;异硫氰酸荧光素 中图分类号:R331.1文献标识码:A文章编号:1000—6834(2003)04—0410—03 整体回输后红细胞的24h回收率和半寿期是 评价血液质量最关键的指标.多年来人们尝试建立 起多种细胞标记方法,从经典的同位素Cr标记示 踪法,到H3.胸嘧啶核苷标记法,以及近期发展的荧 光亲脂探针如PKH标记法等l1_2J.这些方法较好 地解决了活细胞标记问题,但也各自存在一定的局 限性,如操作繁琐,放射性废物处理困难;不能标记 非分裂期细胞;价格昂贵等.为建立一种简便,安 全,可靠又可在实验室普及的细胞标记方法,本文采 用家兔模型,以异硫氰酸荧光素(FITC)作为探针直 接标记红细胞,并对GMA保养液保存21d的兔红 细胞质量进行评价,得到了满意的实验结果. 1材料与方法 1.1实验动物与分组 l2只日本大耳白兔购自军事医学科学院动物 中心,分为两组.实验组家兔的全血在GMA液4~C 保存21d,用FITC标记后自体回输;正常对照组的 红细胞不经保存,标记后直接回输. FITC购自美国SIGMA公司.FACSlIbur流 式细胞仪由美国BectinDickin~n公司生产. 1.2标记,检测与回输 日本大耳白兔耳动脉取血10,15ml(约为总 血量的5,10%),用PBS(pH7.4)洗涤细胞2次. 红细胞标记的条件为:红细胞2.5×100/ml,FITC 70ffg/ml,37?共孵20min.用PBS洗涤细胞2次, 以洗掉未标记的游离FITC.重悬红细胞至原体积. 红细胞标记质量的检测:取细胞悬液5l,收集 于加lmlPB.S的试管中.利用FACSCalibur流式 细胞仪CELlQuest分析软件计数50000个红细 胞,检测荧光标记细胞的百分比以及荧光标记强度. 将标记好的细胞悬液自兔耳缘静脉自体回输. 1.3红细胞24h回收率的计算 FITC标记的兔红细胞自体回输1,2h后,自 耳缘静脉取血5l,收集于加1mlPBS(含抗凝剂) 的试管中.FACS仪检测荧光标记的红细胞数所占 百分比,记作.24h后同上操作,记作Al. 计算:荧光标记的红细胞24h回收率(%)= Al/Ao×100. 1.4红细胞半寿期的计算 每3,5d取血一次,直至Ax小于1/2.第 Xd荧光标记的红细胞的存活率(%)=Ax/Ao× 100.以红细胞的存活率为纵坐标,以时间(d)为横 坐标,作出红细胞的存活曲线.应用SAS软件对所 得数据进行回归分析,建立回归方程并进行拟合效 果的检验,存活率为50%所对应的天数即标记红细 胞的半寿期l引. 2结果 2.1红细胞标记质量 应用FACSCalibur流式细胞仪及其CELINbamt 软件分析FITC标记红细胞的阳性率和荧光强度. 选取红细胞群R1(图1A),以荧光强度?10定为阳 性,荧光标记红细胞的百分率均在99%以上,每个细 胞的平均荧光强度均在10以上(图1B). 基金项目:伞军医药卫生科研指令性课题资助项目(9605006) 收稿日期:2002.08—29;修回日期:2003—0630 作者简介:任素萍(1972一),女,l』J东人,助理研究员.博士在读. 从}实验m液学和病理生理学研究 中国应用生理学杂志2003;19(4 旦 _^ 0.1010:1010 FSC—H Fig.1FlowcytometryanalysisofrabbitRBCslabeledwith70 ~tg/mlFITC A:Imageofwholebloodofrabbit.RectangleR1indicatesRBC group:B:PositiverateandfluorescenceintensityofFITC—labeled RBCs 411 2.2红细胞24h回收率及半寿期 图2示正常对照组其中一只家兔红细胞自体回 输后1h(A),24h(B)和18d(C)检测到的循环血 中标记红细胞所占的百分比. 两组家兔(各6只)的红细胞24h回收率与半 寿期列于1. 正常对照组的24h回收率(?S)是93.76% ?5.40%,GMA组是89.13%?7.10%.正常对照 组数据不满足正态性,采用SAS软件非参数检验 (Wilcoxon秩和检验),U=一0.720577,P= 0.4712.两组没有显着性差别,而且GMA组的红 细胞24h回收率?70%,说明GMA液4?保存21d 仍符合输注条件. 应用SAS软件对所得数据进行线回归分析,建 立回归方程并进行拟合效果的检验,通过方程计算 标记红细胞的半寿期.正常对照组红细胞的半寿期 (?S)是(22.50?4.37)d,GMA组红细胞的半寿 期为(11.41?1.63)d.与有关文献相符【,. 0.10.1010l0 RBC-F[TC Fig.2FlowcytometryanalysisonRBCsofthecontrolrabbital1hour(A),24hours(B)and18d ays(C)afterauto—transfusion respectively Tab.124hourrecoveryandthehalf-lifespanof6rabbitsinthecontrolandtheGMAgroupsresp ectively 3讨论 细胞标记是体内示踪的关键技术,最经典的是 同位素标记法,包括'Cr,59Fe99mTc,…In以及 DF3P等.该方法实验条件苛刻,而且放射性废物 处理困难llJ.而}{3一胸嘧啶核苷标记法则不能标记 非分裂期细胞.近期有人用荧光亲脂探针如PKH 标记细胞,PKH能够嵌人到膜脂双层中,不改变细 胞的生物活性,但价格昂贵l2J.荧光素是另外一种 常用的细胞标记探针,不具有放射性污染,价格便 宜,主要用于白细胞和组织细胞的标记.为了建立 一 种简便,安全,可靠又可在实验室普及的细胞标记 方法,我们探索使用以70/,g/mlFITC直接标记家 兔红细胞并进行存活检测,操作简便,重复性好,标 记率可达99%以上.对小鼠和狗的红细胞进行标 记,也取得了满意结果(本文未给出).FITC是具 有2个亲水基团羟基的荧光素,生理条件下有两种 电离态,带负电荷.FITC能够与赖氨酸的e一氨基氮 共价结合,因而可以稳定地标记到大部分蛋白质上. Butcher等人用FITC标记淋巴细胞,证明标记的 4l2 FITC不会脱落或者转移到其他细胞5.在我们的 示踪实验中,阳性细胞的荧光强度基本保持不变,也 证明了标记的FITC性质稳定,在体内代谢率极低. 这些特性是FITC作为细胞标记探针的基础. 我们进一步以日本大耳白兔为实验模型,以 FITC作为探针对红细胞标记后自体回输,进行示 踪观察,计算出回输红细胞的半寿期为(22.50? 4.37)d.与G.N.Smith等人用同位素Cr和 DF3P双标记法得到的结果(21.3?1.96)d近似, 而高于Marvin和Lucy(1957年),Heimpel(1964 年),Miescher(1956年)以及Gardener(1961年)报 告的数值(分别是19d,17d,16,17d和12d)E4J. 据此可以认为,FITC标记技术能够用于红细胞体 内存活的检测. 细胞体内示踪技术在血液学领域的一个重要应 用是对输注血的质量进行评价.兔红细胞的寿命 (60d)是人红细胞寿命的一半,GMA液保存21d 的兔红细胞24h回收率和半寿期,即可间接反映保 存42d的人红细胞质量.结果表明,正常组和 GMA组红细胞的24h回收率无显着性差别;半寿 ChinJApplPhysiol2003:19(4 期与有关文献相符2,41.说明GMA液412保存21 d的兔红细胞仍符合输注条件.该方法简便实用, 可用于输注红细胞的质量评价和体内生物学特性分 析. 4参考文献 MoroffG,SohmerPR,ButtonLN,eta1.Proposed standardizationofmethodsfordeterminingthe24——hour survivalofstoredredcells【J】.Transfusion,1984,24: 109一ll4. SlezakSE,HoranPK.Fluorescentinvivotrackingof hematopoieticcells.PartI.technicalconsiderations【J】. Bbx~/,1989,74:2171—2177. 胡良平.WindowsSAS6.12&8.0实用统计分析教程 [M].北京:军事医学科学出版社,2001.183—196. SmithGN,MollisonPL.Normalredcellsurvivalinthe rabbit[J】.ScandJHaematol,1973,ll:188—194. ButcherEC.WeissmanII.Directfluorescentlabeling ofcellswithfluoresceinorrhodamineisothiocyanate.I. Technicalaspects【J】.JImmunolMethods,1980,37: 97一lO8. LABELINGANDSURVIVALSTUDIESoNRABBITRBC PENSu—ping,MAEn—pu,LIUXiu—zhen,HANYing,LIUAn,JINPeng,IX)NG13o2 (1.InstituteofTransfusionMedicine,2.InstituteofRadiationMedicine,Beijing100850,China) ABSlACT Ailn:ToestablishasimpleandeffectivemethodforRBCslabelingandsurvivalassays.andthequalitimofrabbitRBCspre— servedinGMAsolutionat4? wereverified.Methods:Theblooclsweretakenthroughtheeararteriesoftherabbits.TheRBwere labeledbyfluorescelnisothiocyanate(FITC),andwerereinjectedtothesainerabbitthroughearveins.ThepercentageofFITCla— bdedRBCswasassayedbyFACSataseriesoftimesafterinjection.TheSASsoftwarewaSemployedtoanalyzethedataandestablish theregressionequations.The24一hourrecoveryandthehalf-lifespanofthelabeledRB(二 Swerecalculatedaccordingtotheequations. Results:The24一 hourrecoveryandthehalf-lifespanofthelabeledRB(inthecontrolgroupwere93.76%? 5.40%and22.50%? 4.37daysrespectively,whichwasinagreementwiththepreviouspapers.The24一 hourrecoveryandthehalf-lifespanofthelabeled RBCSintheGMAgroupwere89.13%?7.10%andl1.4l%? 1.63daysrespectively.whichwascoincidentwiththeinfusioncon— dltions.Conclution:ComparedwithothermethodsofRBCslabelingin 训.FITClabelingwasthoughttobeeasierandcheaperto use,whichcouldfacilitatetheanalysisofthebiologicalcharacterofthelabeledcells.andcould beuse(】tOtracethefateoflabeled celIs. KEYWORDS:redbloodcell;cellmarker:survival:preservation;FITC 墓蕊『『 纠 ,I,Ir}