不同生理状态下原生动物草丛土毛虫大核DNA的多态性比较

不同生理状态下原生动物草丛土毛虫大核DNA的多态性比较 不同生理状态下原生动物草丛土毛虫大核 DNA的多态性比较 第39卷第1期 2010年2月 上海师范大学(自然科学版) JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) Vo1.39,No.1 Feb.,2010 不同生理状态下原生动物草丛 土毛虫大核DNA的多态性比较 赵晗,章骏,盛春 (上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234) 摘要:对草丛土毛虫(Territrichastramenticola)营养细胞大核DNA和休眠包囊大核DNA 进行了RAPD比较分析.在所选用的32条随机引物中,2条没有扩增带,其余30条引物一共 扩增出134条片段,以营养细胞大核DNA为扩增出54条片段,以休眠包囊大核DNA为 模板扩增出80条片段,两者有20条共享片段,共享度为30%.结果表明:草丛土毛虫在形成 包囊的过程中,大核DNA的结构可能发生了较大的变化,这些变化可能与其在包囊形成过程 中的形态结构和代谢活动的改变以及休眠状态下生理活动的改变密切相关. 关键词:草丛土毛虫;大核DNA;营养细胞;休眠包囊;RAPD 中图分类号:Q952文献标识码:A文章编号:1000-5137(2010)01-0078-06 0引言 土壤原生动物是土壤生物群落中较小的一个类群,直到20世纪初才有学者开始对 其进行研 究_1I2].由于土壤环境本身的特殊性,土壤原生动物常见为一些小型种类,大型的纤毛虫十分少见.据目 前所知,大多数纤毛虫在一定环境条件下都可以形成包囊,期间细胞的大核凝缩或融合成圆球,大核染 色质及其在核内的定位也发生连续的改变,DNA含量明显减少,而在细胞脱包囊时大核又恢复为正常 的状态_3I4j.比较之下,土壤纤毛虫随着土壤干湿度的变化频繁地发生形成包囊及脱包囊的过程,这也 可以说是土壤原生动物抵御恶劣环境的一种手段,而一般水生种类其形成包囊可能是适应栖息环境变 化的手段之一J.目前,对土壤纤毛虫大核随细胞在不同生理状态下发生的变化,尚未进行过深入的探 讨,对细胞形成包囊过程中DNA的变化动态也不甚清楚.本文作者应用RAPD技术,对腹毛目纤毛虫草 丛土毛虫(Territrichastramenticola)营养细胞与休眠包囊的大核DNA作了比较分析,以期为揭示细胞 结构的分化与细胞遗传物质的作用关系提供基础. 1材料和方法 1.1材料 本实验所用草丛土毛虫采自于2007年6月浙江温州青龙湖景区一池塘淤泥中.将纤毛虫接种至培 养皿中,以池塘过滤水中加入麦粒后形成的麦粒发酵液进行培养,每4,6d更换一次培养液,使细胞处 于良好的生长状态.当纤毛虫达到较高密度后不再更换培养液时,部分细胞便会形成包囊,取营养细胞 收稿日期:2009—10-09 基金项目:上海市教委科技发展基金(06DZ020). 作者简介:赵晗(1983一),女,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生;盛春 (1965一),男,上海师范大 学生命环境科学学院副教授. 通讯作者 第1期赵晗,章骏,盛春:不同生理状态下原生动物草丛土毛虫大核DNA的多态性比较 和包囊备用. 1.2方法 1.2.1大核DNA的制备 营养细胞与休眠包囊大核DNA用捷瑞公司生产的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型) 提取. 1.2.2DNA浓度及纯度的测定 利用紫外分光光度计测定吸光度A值,通过A猢/A?的比值判断样品DNA纯度.此比值均大于 1.80. 1.2.3RAPD多态性条带的扩增及产物的分离 以大核DNA和线粒体DNA为模板,选用32个引物(产品购自上海Sangon公司),进行扩增分析, 所选引物序列见表1. 表1大核DNA扩增所用随机引物及序列 随机引物序列随机引物序列 S15,G'ITI'CGCTCC3,$2175,CCA~CGTCGT3, S55,TGCGCCCTrC3,$2455,TI"GGCGC~CT3, S125,CC'Iq'GACGCA3,$3435,TCTCCGCTYG3, S185,CCACAGCAGT3,$4555,TGGCGTCCTI3, $205,GGACCC'I3"AC3,$4575,GGCTTATGCC3, $235,AGTCAGCCAC3,$4675,GTCCATGCCA3, $275,GAAACGGGTG3,S5205,ACGGCAAGGA3, $305,GTGATCGCAG3,S10105,GGGATGACCA3, $345,TCTGTGCTGG3,S10185,GGGCTAGTCA3, $395,CAAACGTCGG3,S12635,ACGAAACGGG3, $525,CACCGTATCC3,S13995,TGAGGCGTGT3, $795,GrITGCCAGCC3,S15075,CACAGACCTG3, S1755,TCATCCGAGG3,$20065,GGACGACCGT3, S1875,TCCGATGCTG3,$20245,ACCAGGTCAC3, S1905,ACCGTTCCAG3,$21175,CAAGCTCGTG3, S2005,TCTGGACGGA3,$21505,GTGTGCCTGG3, 用实验所得最佳反应体系进行RAPD扩增,反应总体积为25L.包括:Tris—HC10.O1mol/L,KC1 0.05mol/L,MgCl20.002mol/L,4种dNTP共2x10一mol/L,随机引物15ng,大核DNA15,20ng,Taq DNA聚合酶2.5单位.混匀,加盖石蜡油.RAPD反应过程:预变性94~C3min,变性94qc1min,退火 38~C1min,延伸72?1min,共循环35次,完成最后一次循环后72?延伸4min. 1.2.4电泳及分析 扩增产物经1%琼脂糖凝胶(EB终浓度为0.51a,g/mL)在1×TAE缓冲液中,100V电压电泳30rain 分离,在凝胶成像仪中观察,,拍照. 根据Nei和Li公式:F=2NxY/(N+N)计算样品的共享度.其中,F为共享度.N表示两个样品 共有片段数;N,N分别表示x样品,Y样品扩增片段总数. 2结果 草丛土毛虫大核DNA的RAPD结果如图1所示,在所选用的32条随机引物中,除了$217和S1018 80上海师范大学(自然科学版)2010年 没有扩增带外,其余30条引物皆扩增出明显条带,且重复性良好.片段大小大部分集中在250bp, .32条引物一共扩增出134条片段,以营养细胞大核DNA为模板扩增1800bp之间 出54条片段,以休眠 包囊大核DNA为模板扩增出80条片段,两者之问有20条共享片段,按照Nei和Li公式的计算,得出其 共享度为30%. 如图1所示,$217和$1018没有扩增产物.当以SI,$34,$79,$187,$200,$457,$467,$520,S1399, $2006,$2150作为引物,营养细胞大核DNA和休眠包囊大核DNA扩增出的片段不尽相同.它们的共享 度在29%,86%之间变化(如以$200为引物,营养细胞大核DNA扩增出3条片段,而休眠包囊大核 DNA除了扩增出相同的3条片段外还扩增出1条自己的特有片段,共享度为86%).余下的19条引物 分别以营养细胞大核DNA和休眠包囊大核DNA为模板扩增出来的片段完全不同.其中,以$20,S190, $245为引物时,营养细胞大核DNA扩增出条带,而休眠包囊大核DNA则没有扩增出条带(如$20);以 s5,$12,S18,$27,$39,$52,S175,$343,S1010,S1263,$2117为引物时,休眠包囊大核DNA扩增出了条 带,营养细胞大核DNA则未扩增出条带(如$39).其余的5条引物,营养细胞大核DNA和休眠包囊大 核DNA扩增出片段则完全不同(如$30,营养细胞大核DNA扩增出2条条带,休眠包囊大核DNA扩增 出5条,但是它们却没有共享片段).由结果所示,营养细胞大核DNA和休眠包囊大核DNA的扩增结果 共享程度偏低,差异程度显着;营养细胞与休眠包囊的共享片段的强弱也有所不同,这表明即使是共有 的DNA片段,在营养状态与休眠状态下的含量也是不一样的. MS20$39S5$27S34S1507S12S457S19oS467s20o YBYBYBYBYBYBYBYBYBYBYB MS175S343S187s217S1018S455$52S245S1399S1010$79 YBYBYBYBYBYBYBYBYBYBYB MS2D24$18S1263$2117S23S2006S1S52oS3oS215o YBYBYBYBYBYBYBYBYBYB M:Marker;S1,s5,S12…:随机引物;Y:营养细胞;B:休眠包囊 图1草丛土毛虫营养细胞与休眠包囊大核DNA随机扩增产物电泳图谱 第1期赵晗,章骏,盛春:不同生理状态下原生动物草丛土毛虫大核DNA的多态性比较81 上海师范大学(自然科学版) 3讨论 土壤纤毛虫周期性地发生形成包囊与脱包囊的过程,这可能是它们长期在土壤特殊环境下适应和 演化的结果,而淡水纤毛虫则不可能频繁地形成包囊'.纤毛虫在包囊形成与解脱的过程中,大核的 形态,数目,DNA含量等都会发生明显的变化.在大核分化期问,DNA复制过程中发生剪接,剪切,重排 和消除【8的情况,目前对于纤毛虫形成休眠包囊过程中其大核DNA结构的变化报道很少.PALACIOS 等,膨大肾形虫(Colpodainflate)在形成包囊过程中涉及特异DNA去甲基化现象J.KARAJAN等 报告,双环栉毛虫(Didiniumnasutum)形成包囊期间,大核核仁体积急剧减少,核仁结构急剧变化'''.本 实验结果显示,草丛土毛虫营养细胞与休眠包囊两者大核DNA扩增片段存在着差异,表明纤毛虫在形 成包囊的过程中,大核DNA结构可能发生了变化.推测这些DNA差异片段的产生可能与大核DNA的 重组,缺失和修饰有关.当草丛土毛虫的代谢活动由相对活跃的状态向相对静止的状态转化进而产生休 眠的生理生化特征时,其大核DNA结构可能随之发生了相应的变化.因此,当外界环境条件的变化(温 度的变化,湿度的改变,食物缺乏等)使得纤毛虫运动停止,胞器功能活动(尤其是胞 口的摄食,食物泡 的消化及其他胞器的功能活动)减弱,最终形成休眠包囊,这些细胞生命活动的明显变化与细胞大核基 因组的变化可能互为影响,互为因果.由于营养细胞大核DNA和休眠包囊大核DNA的扩增结果差异十 分显着,共有DNA片段在营养状态与休眠状态下的含量也不同,表明草丛土毛虫在营养细胞形成包囊 的过程中,大核DNA的结构可能发生了较大的变化,这些变化可能发生与包囊形成过程中的形态结构 和代谢活动的改变以及休眠状态下的理化性质的改变密切相关.纤毛虫的营养细胞和休眠包囊是两种 不同生理状态的生命体,但同种纤毛虫在不同理化状态下其细胞大核DNA结构的变化与细胞生命活动 的关系是值得进一步探索的. 目前对纤毛虫形成休眠包囊过程中其大核DNA结构的变化知之甚少,加之采集大量纤毛虫比较困 难,难以提取其DNA,对其与休眠有关的特定基因还未展开深入研究,作者采用RAPD技术分析比较土 壤纤毛虫营养状态与休眠状态下大核DNA的差异,初步进行了纤毛虫从营养状态向休眠包囊转化的研 究,所得结果可望为深入研究提供基础资料. 参考文献: [1]SONGW.MorphologieundmorphogenesedesbodenciliatenPeriholostichawilbe~inov spec(Ciliophora:Hypotrichida) [Jj.ArchProtistenkd,1990,138:221—231. 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PolymorphiccomparisonofmacronuclearDNAinprotozoan Terr/tr/chastramenticolaunderdifferentphysiologicalsmtus ZHAOHan,ZHANGJun,SHENGChun (CollegeofLifeandEnvironmentSciences,ShanghaiNormalUniversity,Shanghai200234,China) Abstract:ThemaeronuelearDNAfromvegetativeandrestingcellsofTerritrichastramenticolawascomparativelyanalyzedbyu— singRAPDtechniqueinthepaper.Theresultsshowedthatnofragmentsproducedusing2randomprimers,134fragmentswere amplifiedfrommacronuclearDNAsofthevegetativeandtherestingcellsusing30randomprimers,ofwhich54specificfragments belongedtovegetativecelland80fragmentswerespecifictotherestingcel1.Therewere20fragmentsappearringinboththeveg— etativeandrestingcells.Thesimilarityvaluewas30%.ThedataindicatedthatthestructuresofthemacronuclearDNAsin Territrichastramenticolahadperhapsmajorchangesintheprocessofcystformation,whichwerecloselyrelatedtothechangein structuralfeaturesandmetabolicactivitiesandtothephysiologicalandbiochemicalchangesintherestingstate. Keywords:Territrichastramenticola;macronuclearDNA;vegetativecell;restingcell;RAPD (责任编辑:郁慧)