生物技术在大白菜育种中的应用

生物技术在大白菜育种中的应用研究进展 摘要:本文综述了生物技术在大白菜育种上的应用,即以单倍体培养和组织培养为核心的细胞工程技术、转基因和DNA分子标记技术在培育抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂、改良品质等的大白菜品种上的研究进展。关键词:生物技术;大白菜;育种;研究进展 Research progress of Biotechnology in Chinese cabbage Breeding Abstract: This is a review of applications of biotechnology in Chinese cabbage Breeding,which is the research on the progress of cells engineering, transgenic, and DNA molecular markers that in the core of haploid culture and tissue culture in fostering disease resistance, insect resistance, stress tolerance, herbicide , improving the quality of Chinese cabbage. Keywords: biotechnology; Chinese cabbage; breeding; Research progress 大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)是十字花科(Crociferae)芸苔属(Brassica)中最重要的蔬菜作物之一,原产于我国。上世纪70年代以来,杂优利用在大白菜新品种选育中占据主导地位,并取得了丰硕的成果[1]。随着植物组织培养技术和DNA重组技术的建立和不断完善,现代生物技术在大白菜种质创新和新品种选育中日益得到广泛应用,大白菜育种技术也随之进入一个新的发展阶段。 1 转基因技术在大白菜育种上的应用 转基因技术已被应用在大白菜抗病性、丰产性、生态适应性、品质等多方面的育种中,目前已育成一批品种[20] [21]。作为植物基因转化的受体,单倍体材料因不存在杂合和分离问题,要优越于二倍体材料。小孢子就是非常合适的单倍体受体材料,目前小孢子受体应用和研究逐渐活跃,1998年刘凡等[10]利用大白菜小孢子胚状体获得抗除草剂转基因植株。 由于大白菜遗传转化所使用的受体还是以二倍体材料为主(主要用无菌苗的子叶或子叶柄,还有用花茎、原生质体、下胚轴、真叶等),这些材料转化后的高频再生就是一个关键问题,人们对此作了大量的研究工作[11-14]。 目前使用最多且最有效的转化载体仍是根癌农杆菌的Ti质粒,另一个应用前景比较广阔的载体是花椰菜花叶病毒(Caulimoviruses,CaMV)。2001年成细华等[15]采用农杆菌共培养法,把外源基因C58/pV11导入结球白菜,获得转基因植株;其中抗性植株的抗草丁膦试验、转基因植株DNA的PCR及PCR-Southern斑点杂交鉴定结果明,50%的抗性植株的基因组中 有外源基因的整合。朱常香等[30]将芜菁花叶病毒的病毒外壳蛋白基因(TuMV-CP)导入大白菜中,获得转化植株。抗病性测定结果显示,转基因植株有明显的抗芜菁花叶病毒侵染能力。 软腐病是大白菜的三大病害之一,而抗菌肽对软腐病菌有很强的杀伤作用。王关林等[16]建立了根癌土壤杆菌EHA105(pMOG410)工程菌的高频转化载体系统,将抗菌肽基因导入目前推广种植的大白菜AB-81自交系,获得了转基因植株。转基因植株提取液的体外抑菌试验、试管苗及盆栽转基因植株的病原菌接种抗病测试结果表明:转基因植株具有明显的抗病特性,并且能稳定遗传,R5的转基因植株保持抗Km和抗病特性,可望以其为亲本选育出大白菜抗软腐病的新品种。 杨广东等[17]大白菜转修饰豇豆胰蛋白酶抑制剂基因获得抗蚜虫植株。之后杨广东等[18]通过农杆菌介导法将雪花莲外源凝集素基因(gna)导入了大白菜自交系“282”。转基因植株较非转化对照植株有一定的抗蚜虫能力,抗虫性好的植株可以检测到较强的gna基因转录产物。 Bhattacharya等[19] 通过下胚轴外植体的植物肥大病菌属介导的转化,将合成甘氨酸内铵盐的细菌betA基因转移到大白菜中,得到的转基因大白菜具有对高NaCl浓度的较高的耐受性,在盐浓度不断升高的情况下能够保持较好的生长状态。 2 细胞工程技术在大白菜育种上的应用 大白菜的离体培养技术研究开始很早,1958年西贞夫等培养大白菜与甘蓝杂交的幼胚,育成远缘杂种“白蓝”。1976年洛阳农科所等采用大白菜的花药培养,经愈伤组织获得单倍体植株。20世纪80年代以来,大白菜的离体培养技术发展非常迅速[2]。细胞工程技术在大白菜育种中的应用包括以下方面:一是利用离体培养物作为育种材料,可以大大加速育种繁育进程;二是直接利用离体培养物育种,如基于游离小孢子培养的双单倍体育种技术;三是利用离体培养物作为基因工程技术育种中的转基因受体,并在转化后再生植株。 2.1 游离小孢子培养 大白菜为二年生常异交作物,天然杂交率很高,自交提纯时又会导致退化严重,获得一个纯系需5~6年时间,获得一个新品种需8~10年时间,因而采用单倍体育种很有意义[46][47]。游离小孢子培养,是将发育至一定阶段的花粉接种到人工培养基上进行培养,以诱导其改变发育进程,形成花粉胚或愈伤组织,进而发育成单倍体植株的技术。其后再将单倍体植株加倍,获得纯合二倍体。这种染色体加倍产生的纯合二倍体在遗传上非常稳定,不发生性状分离,获得一个纯系只需2~3年时间,获得一个新品种只需3~5年时间,因此,游离小孢子培养育种能极早稳定分离后代、缩短育种年限5年左右。近年来,科学工作者在对大白菜游离小孢子培养进 行系统研究的基础上建立了一套完善的双单倍体育种体系。近几年,河南省农业科学院生物技术研究所应用小孢子培养双单倍体技术先后培育出了豫早1号,豫新3号等品种。 双单倍体育种体系的关键是诱导产生小孢子胚和由其再生植株,为此人们进行了大量的试验摸索。栗根义等[3]对不同基因型的大白菜进行培养时,有16个基因型的大白菜得到了小孢子胚,有些基因型的大白菜则无法通过小孢子培养的途径获得小孢子胚及再生植株,大白菜自身的基因型是影响组织培养的关键因素之一[3]。对小孢子胚胎发生的影响因素进一步研究发现,基因型对大白菜游离小孢子培养的影响很大,是影响小孢子胚胎发生启动与否的内在因素。邹金美[4]通过细胞学观察表明,当花蕾长为 2.0~3.0mm、花瓣与花药长度之比为1:2~4:5时,50%~70%的小孢子发育处于单核晚期,最适合进行花药和游离小孢子培养。 在小孢子培养基上,近年来多采用NLN培养基[2,3,5],大大提高了培养效果。在NLN培养基中加入6-BA (0.05mg·L-1)时小孢子胚诱导率最高[5],在不加任何激素时,加入蔗糖(130mg·L-1)效果较好[6];一般采用玻璃或塑料培养皿进行小孢子的液体培养,培养基密度大多调节至每毫升10万~20万个小孢子[2,5]。 栗根义等[3]在发现基因型影响的同时发现高温处理对胚诱导很重要,其可能通过改变小孢子的发育途径而阻止小孢子向成熟花粉粒方向发展[3]。在后来进一步的相关研究中,刘公社等[7]发现,若以高温诱导的小孢子分裂频率为评价指标,小孢子接受高温处理的敏感期在开始培养的12h内,但以胚胎发生频率为指标,敏感期在开始培养的24h内。 2.2 胚培养 十字花科作物的远缘杂交在育种工作中很重要,但是,由于远缘杂交的不亲和性和杂种不育性,很难采用常规的有性杂交方法获得成熟的种子。因此常使用培养杂种幼胚的胚培养技术来培育杂种,并使其成为双二倍体,以恢复杂种育性。但通常情况下,此种培养的成活率不高,有的甚至不能获得杂种苗。李明山等[8] 使用改良的液体培养进行了大白菜和萝卜杂种幼胚的培养,发现3个组合的改良液体培养成活率均显著高于固体培养的成活率。江面浩等[9]在利用组织培养选育抗软腐病大白菜的试验中,为了使作为父本的带有抗软腐病抗性基因的结球甘蓝与大白菜杂交后形成的胚能进一步发育,采取胚培养的方法。结果发现,胚培养育成的群体与种子育成的群体相比,形态上类似父本的个体比例大,软腐病的病情指数也低,表明对于结实率低的杂交组合,如果利用胚培养,不仅能有效地克服远缘杂交不育,育成杂种,而且能以很大的机率获得类似于父本的个体。 3 DNA分子标记技术在大白菜育种上的应用 分子标记能直接从DNA水平上反映各材料间的遗传差异,是研究生物遗传多样性的工 具。DNA分子标记技术在遗传图谱构建、基因定位与辅助选择育种等研究方面均已有很好的应用。它可用于转基因植株的检测,以确定外源基因是否在转基因植物中正常表达。朱常香等[22]建立和完善了大白菜的重要病害抗病基因的分子标记辅助选择技术体系,对一些重要的数量性状如抗病、抗虫、抗除草剂性状等,采用了分子标记辅助选择技术,并用以鉴定出目标基因已整合到大白菜基因组。王美等[24]以白菜高抗TuMV白心株系“91112”和高感TuMV桔红心株系T1291为亲本建立的小孢子DH系作为图谱构建群体,以AFLP标记来构建白菜连锁图谱。为进一步开展大白菜球色分子标记辅助育种打下了基础。刘秀村等[23]运用RAPD标记,在大白菜的小孢子培养DH系群体中采用BSA法进行了分子标记研究,找到了一个与桔红心球色基因连锁的分子标记OPB01 - 850,其遗传距离为3. 8 cM,并将其转化为引物长20个碱基的SCAR 标记,命名为SCB01 - 845。将SCB01 - 845用于球色分子标记辅助育种中,与田间球色鉴定吻合率为90 %。Han等[25]以抗病自交系Brp0058和感病自交系Brp0181杂交后代的F2 分离群体为试材,采用BSA法筛选到2个与TuMV感病基因紧密连锁的AFLP标记,其遗传距离分别为7. 5和8. 4 cM 。孙日飞等以具有大白菜核显性雄性不育基因材料938A与自交不亲和系NB杂交后代建立的育性分离群体为试材,采用BSA方法和RAPD技术,筛选到与核显性雄性不育基因紧密连锁的标记S264300,并将其成功转化成SCAR标记SS264300。用该SCAR标记对试材所有单株进行扩增,该标记与雄性不育基因的遗传距离为2. 6 cM。 3.1白菜分子连锁图谱的构建 近年来我国在大白菜永久高密度分子连锁图谱的构建、重要农艺性状的QTL定位以及连锁分子标记研究方面进展迅速[32][33]。国家蔬菜工程技术研究中心利用重组自交系和通过小孢子培养构建的DH群体为材料,分别构建了大白菜永久高密度分子遗传图谱,为今后进行数量性状的基因定位、比较基因组学研究奠定了基础。 3.2白菜重要农艺性状的QTL定位 于拴仓等[26,27,28]应用352个标记位点的AFLP和RAPD图谱,用苗期热害指数进行耐热性表型鉴定,对白菜的耐热性进行了QTL定位研究。共检测到5个耐热性QTL位点,分布于3个连锁群上,ht- 1、ht- 3和ht- 5表现为增效加性效应, ht- 2和ht- 4表现为减性加性效应, ht - 2对大白菜耐热性的遗传贡献率最大,发现了与5个QTLs紧密连锁的侧链分子标记,其与QTL间的距离为0. 1~2. 4 cM。张立阳等[29]以大白菜高抗TuMV的株系91 - 112与高感TuMV的株系T12 - 19的杂交后代(F1 )进行游离小孢子培养建立的DH系为材料,构建了包含10个连锁群、376个标记位点的高密度分子连锁图谱,图谱总长度809. 1 cM,标记间的平均图距为2. 2 cM,连锁群数目和染色体数相等。对白菜TuMV抗性分别用人工苗期接种(C4株系)和田间自然条件下进行了评价。QTL定位发现:有2个QTLs(Tu1,Tu2)控制白菜苗期对TuMV - C4的抗性,分别解释总效应的58. 2 %和14. 7 %;另有2个QTLs(Tu3, Tu4)与田间(成株)抗性有关,分别解释总效应的48. 5 %和32. 0 %。于拴仓等[26,27,28]应用352个标记位点的AFLP和RAPD图谱和重组自交系群体对大白菜的9个形态性状和7个叶球相关性状进行了QTL定位研究,共检测到83个QTLs,并估算了单个QTL 的遗传贡献率和加性效应。张凤兰[23,24]等在2003~2004年对91 - 112和T12 - 19的双亲、F1 和DH群体的24个重要农艺性状根据进行了调查。利用复合区间作图法把控制大白菜24个重要农艺性状的QTLs定位到遗传连锁群上,并进行了遗传效应分析[42]-[44]。2003年, 24个性状共检测到255个QTL位点,2004年, 22个性状共检测到233个QTL 位点,并估算了单个QTL的遗传贡献率和加性效应,为今后进行标记辅助育种奠定了基础[34]-[41]。 4 展望 杂种优势利用在以往的大白菜新品种选育中占据主导地位,并取得了丰硕的成果[1]但随着植物组织培养技术和DNA重组技术的建立和不断完善,现代生物技术在许多作物的种质创新和新品种选育中日益得到广泛应用,大白菜育种技术也随之进入一个新的发展阶段。 以上各项现代生物技术在大白菜育种中的应用和作用是相互制约又相互促进的。以小孢子培养为代表的单倍体培养技术的发展,将极大地促进直接以单倍体为出发材料的育种和以单倍体材料为受体的育种,从而加速转基因育种技术进程;采用AFLP、RAPD和RFLP等技术绘制大白菜的遗传图谱,并获得一些与农艺性状有关且日趋成熟的分子标记技术,为大白菜今后的品种选育、基因克隆和分类研究提供了理论依据。而转基因技术的完善,反过来又有利于鉴定影响离体培养的遗传因素,并推动分子标记技术的发展。因此,预计以后大白菜育种技术研究的活跃领域有以下几个方面:一是大白菜小孢子培养以及以小孢子为受体的遗传转化技术;二是与大白菜抗病性、丰产性、生态适应性、品质等相关遗传基因的鉴定和分离、转移技术,这方面的研究已有很多报道[30,31],但还没有直接应用于育种;三是分子标记技术。所有这些研究,可望将大白菜育种推向新的发展阶段。 参考文献 [1] 刘宜生.中国大白菜[M].北京:中国农业出版社,1998. 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