出凝血23.1血管性假性血友病因子抗原(VWFAg)含量测定(精)

出凝血23.1血管性假性血友病因子抗原(VWF:Ag)含量测定(ELISA 法)(第四版) 出凝血23.2原理: 采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理定量测定凝血因子VIII相关抗原(VWF:Ag)水平。包被抗人VWF:Ag抗体与待测血浆中VWF:Ag 结合,加入酶标抗体后形成复合物,后者与底物作用呈现颜色反应。490nm处测得的A值与待测血浆VWF:Ag含量成正相关。 出凝血23.3标本处理: 患者处于休息状态下,采空腹静脉血(急诊病人除外)。采血者应技术熟练,“一针见血”,以防止组织损伤,使外源性凝血因子进入标本。最好不与其它实验一起采集而使血液停留在针管的时间延长。采完血后,将血液沿管壁缓缓注入试管,避免产生气泡;然后迅速将血液和抗凝剂轻轻颠倒混匀,避免用力震荡。 全血要在1小时内分离血浆。分离乏血小板血浆时,要在室温下3000rpm离心10分钟,室温下可存放4小时。全部试验不能在4小时内完成,应将乏血小板血浆分装在0.5~1.0ml的小试管中快速冷冻,储存于-20℃冰箱中。-20℃可保存3个月。冷冻过的标本可再次冷冻,不影响本实验结果的准确性。冷冻血浆融化时,应将盛冷冻血浆的容器置于37℃水浴中,并轻轻摇动,使其迅速融化。 出凝血23.4试剂:购于上海太阳生物技术公司。内含可拆式包被反应条:8孔×12;酶标抗体1瓶;血浆6支;底物OPD片剂6 1 片; 10×稀释液1瓶;20×洗涤液1瓶;底物缓冲液1瓶;终止液:1瓶 出凝血23.5 仪器: BIOTEK EL312e型全自动酶标分析仪 LRH-150型生化培养箱 出凝血23.6 : 1)试剂重建:浓稀释液用前置于37℃水浴15分钟,然后用蒸馏 水作10倍稀释;浓洗涤液用前置于37℃水浴15分钟,然后用蒸馏水作20倍稀释;每支标准血浆用2ml稀释液准确复溶(稀释了20倍,设定此时VWF:Ag含量为200%),取200ul 用稀释液做5次倍比稀释,得到200%、100%、50%、25%、 12.5%、6.25%六个标准点;将待测血浆用稀释液作40倍稀释 (25ul待测血浆+975ul稀释液)。 2)加样:每孔加不同浓度标准血浆或待测稀释血浆100ul,空白 对照孔加稀释液100ul,37℃孵育75分钟。 3)洗涤:弃取反应孔内液体,用洗涤液注满各孔,静置3秒钟, 甩干,反复3次后拍干。 4)加酶标抗体:每孔加酶标抗体100ul,37℃孵育45分钟。 5)洗涤:弃取反应孔内液体,用洗涤液注满各孔,静置3秒钟, 甩干,反复3次后拍干。 6)显色:临用前每片OPD用5ml底物缓冲液溶解。每孔加底物液 100ul,37℃孵育10分钟。 7)终止:每孔加终止液50ul。 8)比色:在酶标仪上492nm处,以空白孔调零,测定各孔A值。出凝血13.7 操作:按仪器操作步骤执行标准操作。 打开计算机和酶标仪,选择“酶标仪操作”,选择VWF:AG操作程序,设置空白和样本位置,然后依次按联机、启动、出板、入板、读板、打印,完成比色程序。 出凝血23.8 计算: 仪器自动计算出吸光值。 制作标准曲线并计算r值(r>0.95)、a值、b值。 按方程f(x)=10(a+b*logx)计算待测标本VWF:Ag百分含量 出凝血23.9 参考值:0.5~2.0 出凝血23.10 临床意义 VWF:Ag含量增高见于心脑血管疾病,肾脏疾病和肺部疾病等。 VWF:Ag含量降低见于血管性假性血友病(vWD),是vWD诊断的重要指标。 出凝血23.11 参考文献: 1)主编王鸿利.止血与血栓检验技术.(第一版1992.6)上海科 学技术出版社. 2)主编李家增王鸿利韩忠朝.血液实验学.(第一版1997.10)上 海科学技术出版社. 3)主编邓家栋杨崇礼杨天楹.临床血液学.(第一版1985)上海 科学技术出版社. 4)主编邓家栋杨天楹杨崇礼.血液学实验诊断.(第一版1985) 天津出版社. 5)中华人民共和国卫生部医政司编.全国临床检验操作规程(第 一版 1991).东南大学出版社.