舟山沿海有抗菌活性菌株的筛选及鉴定

舟山沿海有抗菌活性菌株的筛选及鉴定 () 文章编号 :100326482 20090220119205 舟山沿海有抗菌活性菌株的筛选及鉴定 31 ,2 2 1 李 鹏,王健鑫,裘娟萍 (1 . 浙江工业大学 生物与环境工程学院 ,浙江 杭州 310014 ; )2 . 浙江海洋学院 海洋科学学院 ,浙江 舟山 316000 摘要 :为了筛选开发新的活性物质 ,从舟山海域附近的海水 、海泥 、鲻鱼 、斜带髭鲷的肠道中分 离到 120 株菌株 ,以金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌 、苏云金芽胞杆菌 、黑曲霉 、白假丝酵母为指示 菌 ,采用双层琼脂法筛选到具有抗菌活性的菌株 8 株 ,其中菌株 N F19 现出较好抗菌活性 , 对其进行 16 S rDN A 序列分析 ,结果显示 N F19 是唾液乳杆菌 。 关键词 :双层琼脂法 ;抗菌活性 ;16 S rDN A 中图分类号 :Q932331 文献标识码 :A 引言 海洋占地球面积的 70 %以上 ,具有丰富的生物资源 ,其中微生物占海洋生物数量的 90 % , 控制着所有保持地球生态系统帄衡的重要生物和生化循环 ,而目前有 95 %以上的海洋微生物 未被认识 。自 1929 年弗来明发现青霉素至今 ,已经发现了超过 10000 种具有生物活性的微生 物天然产物 ,并广泛的应用于食品 、医药 、卫生 、制造等工业 。海洋微生物由于其生存环境的特 () 殊性 如高渗 、高盐 、低温 、高压 、低氧等,发展出独特的代谢方式 ,并使其成为海洋生物活性物 [ 1 ] 质的重要来源 ,也使其成为新抗生素的重要来源,近年来从海洋微生物中不断发现具有生理 [ 2 ] 意义的新的次级代谢产物 ,这类物质通常具备陆地微生物所没有的新的独特结构,在抗病 菌 、抗肿瘤 、抗病毒等方面具有良好表现 。 [ 3 ] γ王莹等通过对东海海洋微生物的筛选鉴定发现具有抑菌活性的2变形菌亚门的菌株 , [ 4 ] 这在以前比较少见 。Iva no va从海洋无脊椎动物体表分离到 491 株海洋细菌 ,发现其中的 [ 5 ] 26 %对海洋细菌 、陆源细菌和真菌的生长有抑制作用 。J a r ucho kt aweechai等从泰国 Sicha ng 岛周围海泥中分离出具抑菌活性的 Bacill u s sp . 细菌 Sc026 ,并从其产生的活性物质中分离到[ 6 ] 2 个新的化合物 。刘全永等从海洋细菌 L UB02 中分离得到广谱抗真菌活性物质 ,对人体病 ( ) 原真菌白色念珠菌 Ca n d i d a al bi c a ns 有较强的抑菌作用 。海洋微生物所产生的活性物质已 成为目前研究海洋微生物方面的热点 。本文通过对舟山海域附近海水海泥以及鱼类肠道菌中 的具抗菌活性菌株的筛选及鉴定 ,希望找到具有一定研究开发价值的菌株 ,为活性物质的进一 步开发利用打下基础 。 1 材料与方法 ( ) ( ) 3 基金项目 : 浙江省教育厅计划项目 20061133;舟山市科技局计划项目 06226资助 ( ) 第一作者简介 : 李鹏 19802, 男 , 浙江舟山 , 从事海洋微生物方向的研究 , 实验师 , 在读研究生 Email : lp qp 624512 @ 163 . co m 3 通讯作者 : 浙江工业大学教授 Email : qi ujpi ng @net ea se . co m 收稿日期 : 2008209226 1 . 1 样品采集 分别从舟山的富翅岛 、册子岛 、墩头附近海域采集泥样以及海水 ,采集鲻鱼 、斜带髭鲷的肠 道并尽快处理样品或放入 4 ?冰箱短期保存 1,2 d 。 1 . 2 菌种分离 样品处理后用 Zo bell 2216 E 海水培养基进行分离培养 ,先采用涂布法将各个稀释度的样 品进行涂布 ,每种样品涂布 9,12 个帄板 ,然后 28,30 ?培养 3,5d ,观察帄板中菌落的不同 颜色 、形态等进行划线分离纯化 ,挑取单菌落重复划线 2,3 次以得到纯菌株 。 1 . 3 具有抗菌活性的菌株筛选 [ 7 ] 采用双层琼脂帄板扩散法,以金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌 、苏云金芽胞杆菌 、黑曲霉 、白 假丝酵母为指示菌 ,根据抑菌圈直径与待筛选菌株菌落直径比值大小 ,来确定抗菌活性 。 1 . 4 16 S rDN A 序列分析法 [ 8 ] [ 9 ] 用酸碱冻融法提取细菌 DN A ,以总 DN A 为进行 PCR 扩增, PCR 产物经过 1 % 琼脂糖凝胶电泳分析 , PCR 产物纯化试剂盒回收 1 ,500 bp 的 PCR 产物 ,产物以 Seq Fo r2 () wa r d 、Seq Rever se 、Seq Int er nal 为引物进行 16 S rDN A 测序 ,测序工作由宝生物工程 大连有 限公司完成 。 1 . 5 系统发育树的构建 () 1登陆 N CB I ,利用 BL A S T 等相关软件在 Ge nBa n k 中进行相似性的搜索 。 () 2再用 cl u st al x1 . 8 软件对所有的序列进行序列比对 。 () 3比对后的序列用分子进化遗传分析软件 M E GA 4 . 0 进行分析 。 () 4采用邻接法 ,利用 p hyloDraw V8 . 0 等软件绘制系统进化树 。 2 结果与分析 2 . 1 具有抗菌活性菌株的筛选 从采集到的样品中根据菌落的形态 、颜色等方面的不同共分离到 120 株海洋细菌 ,采用双层琼脂扩散法 ,得到 8 株具有抗菌活性的菌株 ,总抑菌率为 6 . 7 % ,筛选结果见图 1 、图 2 ,表 1 。 表 1 双层琼脂扩散法得到的抗菌活性物质生产菌的抗菌谱 Ta ble 1 A ntimicro bial sp ect r ums of t he screened a ntibio tics p ro ducing bact eria Indicato r st rai n s 指示菌 Bect eria st rains E. col i S . a u re us B . t h u ri n g i ens is C. al bic ans A . ni ge r 菌株编号 大肠杆菌金黄色葡萄球菌苏云金芽孢杆菌白假丝酵母黑曲霉 zy10 + + + + - - - zy12 l - - - + + - y19 - - - + - wc48 - - - + + - + + - - + - zd62 nc99 + + - - - - nc101 + + - - - - N F19 + + + - + + + - - 注 : + —抑菌圈直径与指示菌直径比 < 2 ; + + —抑菌圈直径与指示菌直径比在 2,3 之间 ; + + + —抑菌圈直径与指示菌直 径比 > 3 ;zy ,l y ,zd —从各种海洋鱼类中分离得到 ; wc —来源于海水 ; N F ,nc —来源于海泥 No t e : + - i nhi bitio n zo ne/ st ai n zo ne < 2cm/ cm ; + + - i nhi bitio n zo ne/ st ai n zo ne wa s 2 ,3cm/ cm ; + + + - i n hi bitio n zo ne/ st ai n zo ne > 3cm/ cm ; zy , l y , zd2f ro m va rio u s ki nds of mari ne fi sh ; wc2f ro m seawat er ; N F , nc2f ro m ma ri ne sedi ment 图 1 N F19 对 E. col i 抑制作用 图 2 N F19 对 B . t h u ri n g i ens is 的抑制作用 Fig. 1 N F19’s i nhibitio n of E. col i Fig. 2 N F19’s inhi bitio n of B . t h u ri n g ie ns is 性 ,抑菌率为 3 . 3 % ,对 E. coli 表现出抗性的菌株 5 株 ,抑菌率为 4 . 2 % , N F19 菌株表现出较 强的抗性 ,且范围相对比较广 ,具有很好研究价值 。 2 . 2 16 S rDN A 序列测定 () 测序工作由宝生物工程 大连有限公司完成 ,以 Seq Fo rwa r d 、Seq Rever se 、Seq Int er nal 为引物进行 DN A 测序 ,得到长度为 1476 bp 的核苷酸序列 ,登陆 N CB I 提交该序列得到 Ge n2 ( ) Ba n k 登录号 Ge nBa nk acce ssio n为 FJ 405036 。 2 . 3 系统发育树的构建 表 2 构建系统进化树的同源性菌株的 GenBa nk 号 Ta ble 2 St rai ns fo r buil di ng evol utio na r y t ree f ro m Ge nBa nk Ge nBa nk 登录号 Ge nBa nk 登录号 菌株 St rai n s 菌株 St rai ns Ge nBa n k N O . Ge nBa n k N O . 唾液乳杆菌 RA2115 唾液乳杆菌 J CM1044 A Y389803 . 1 A Y137585 . 1 L . s al i v a ri us RA2115 L . s al i v a ri us J CM1044 唾液乳杆菌 16 S r RN A 基因 唾液乳杆菌 J CM1042 DQ444477 . 1 A Y137584 . 1 L . s al i v a ri us 16 S ribo so mal RN A gene L . s al i v a ri us J CM1042 唾液乳杆菌 J CM1230 唾液乳杆菌 16 S r RN A 基因 A Y137589 . 1 A F420311 . 1 L . s al i v a ri us J CM1230 L . s al i v a ri us 16 S ribo so mal RNA gene 唾液乳杆菌 J CM1047 唾液乳杆菌属 L . s al i v a ri us J CM1047 L . s al i v a ri us subsp . 唾A Y137588 . 1 A F335475 . 1 乳酸菌 A ut r uche 5 液乳杆菌 ZD Y162a L . L acto balill us sp . A ut r uche 5 s al i v a ri us ZD Y162a 唾DQ418553 . 1 EU559602 . 1 唾液乳杆菌 A T CC11741 液乳杆菌 ZD Y159a L . s al i v a ri us A T CC 11741 L . s al i v a ri us ZD Y159a A F089108 . 2 EU559600 . 1 唾液乳杆菌 NB RC 102160 唾液乳杆菌 J CM1046 L . s al i v a ri us subsp . NB RC 102160 L . s al i v a ri us subsp . J CM1046 AB326353 . 1 A Y137587 . 1 唾液乳杆菌 J CM1231 唾液乳杆菌 J CM1045 L . s al i v a ri us J CM1231 L . s al i v a ri us subsp . J CM1045 AB370881 . 1 A Y137586 . 1 唾液乳杆菌 RA2116 A Y389802 . 1 L . s a l i v a ri us RA2116 通过对菌株 N F19 的 16 S rDN A 基因测序 ,登陆 N CB I 利用 Bla st 软件 ,从 Ge nBa n k 数据 库 中 查 找 同 源 性 较 高 的 菌 株 , 利 用 其 16 S rDN A 作为比较对象 , 来构建系统进化树 , 同 源性较高的相关菌株的 Ge nBa nk 号见表 2 。 菌株 N F19 的 16 S rDN A 和 Ge nBa n k 中 筛选的同源性较高的菌株的 16 S rDN A 序列 通过 cl u st al x1 . 8 软件进行排序比较后用遗传 分析软件 M E GA 4 . 0 进行 分析 , 再 用 p hylo2 Draw V8 . 0 软件采用邻接法进行进化树的绘 制 ,进化树显示菌株 N F19 与唾液乳杆菌属的 几种菌的同源性较好 ,尤其是菌株 RA2115 和 菌株 A TCC11741 的 同 源 性 更 好 , 相 似 性 为图 3 根据 16 S rDN A 序列构建的菌株 N F19 以及 相关种 、属的的系统进化树 99 . 9 % 。系统发育进化树见图 3 。 Fig. 3 NJ evol utio nar y t ree ba sed o n co mpleted 4 讨论 sequence of 16 S rDN A 海洋环境由于受到洋流影响比较大 ,因此 在不同季节中分离到的海洋细菌可能会具有不同的抗菌活性 ,在分离到的 120 株海洋细菌中 , 并未发现有对黑曲霉产生抗性的菌株 ,对白假丝酵母有抗性的菌株也很少 ,或是抗性较低无研 究利用价值 ,这说明在舟山海域附近对真菌产生抗性的菌株较少 ,这可能与舟山海域总体环境 有关 。 开发具有新颖结构的抗生素是近年来热门的研究课题 ,已报道海洋细菌产生的抗生素有 α 溴化吡 咯 、2n2p e nt yl qui noli nd 、ma gne si di n s 、i st a myci n s 、ap la smo myci n s 、alt er mici di n 、macro2lacti n s 、di ketopip erazi ne s 、32氨基232脱 氧2D2葡 萄糖 、o nco r hyncoli de 、ma durali de 、sali na mi de s 、 靛红 、对羟苯基乙醇 、醌 、t hio ma ri nds B C 、t ri si ndoli ne 、p yrol nit ri m 等 ,其中有些种类在陆生菌 [ 10 ] 中从未见过。海洋细菌是海洋微生物抗肿瘤活性物质的一个重要来源 。抗肿瘤活性物质 ( ) ( ) ( ) 的生产菌主要集中在假单胞属 Pse u d om on as、弧菌属 V i bri o、微球菌属 M i c rococc us、芽 [ 11 ] ( ) ( ) ( ) 孢杆菌属 B aci l l us、肠杆菌属 E nte robacte ri u m和别单胞菌属 A l te rom on as, 黄耀坚等 从厦门海区潮间带的动植物体及底泥分离到高产胞外多糖的菌株 , 研究表明其归属于土壤杆 ( ) 菌属 A g robacte ri u m s p . ,所产的胞外多糖对小鼠 S180 肉瘤具有较强的抑制作用 。对海洋 [ 12 ] 共附生微生物的研究现在也很热门 ,A ma gat a从海绵中分离到 1 株真菌 Gymna scella da n k2 alie n si s ,从其发酵液中得到 2 个罕见的具有细胞毒活 性的 甾 醇衍 生物 gymna st ero ne s A 和 gymna st e ro ne s B 。 本研究发现的菌株 N F19 来源于海水中 ,是乳杆菌属的 1 种 ,根据现有报告 ,唾液乳杆菌 为 1 种益生菌 ,在治疗炎症性肠病或过敏性肠综合症中很有用 ,也具有很多其他特殊功能 ,因 ( ) 此具有较大研究价值 ,本研究也为下一步研究 如活性物质分离鉴定 ,发酵条件等提供了参 考 。 参考文献 [ 1 ] Pa nlilio A L . Met hicillin2re si stant St ap hyl2ococcus aureus in U . S. ho spital s , 1975 , 1991 [ J ] . Inf ect Co nt rol Ho sp Epidemiol , 1992 , 13 : 5822586 . () Ca rte B K. Bio medical po tential of mari ne nat ural p ro duct s [J ] . Bio science , 1996 , 46 4: 2712286 . [ 2 ] () 王莹 ,吴根福 ,东海海洋有抗菌活性细菌的筛选及系统发育分析 [J ] . 农机化研究 ,2007 , 5:34238 . [ 3 ] Ivano va E P , Nicolau D V , Yumo to N , et al . Impact of co nditio ns of cultivatio n a nd adso rp tio n o n a nti2 [ 4 ] () micro bial activit y of marine bact eria [J ] . Mar . Biol . , 1998 , 130 3: 5452551 . J a r ucho ktaweechai C , Suwa nbo rir ux K , Ta na supawat t S , et al . New macrolactins f ro m a ma rine Bacill us [ 5 ] () sp . Sc026 [J ] . J Nat Pro d , 2000 , 63 7: 9842986 . () 刘全永 ,胡江春 ,薛德林 ,等 . 海洋微生物生物活性物质研究 [J ] . 应用生态学报 ,2002 ,13 7:9012905 . [ 6 ] 沈萍 ,范秀容 ,李广武 ,等 . 微生物学实验 [ M ] . 北京 :高等教育出版社 1999 . [ 7 ] Wu Gen2f u , Zho u Xue2ping. Cha racterizatio n ofp ho sp ho r us2relea sing bacteria in a small eut rop hic shal2 [ 8 ] lo w la ke , Ea ster n China [J ] . Water Resea rch , 2005 , 39 : 462324632 . 魏群 ,崔丽华 ,杨淑杰 ,等 . 分子生物学实验指导 [ M ] . 北京 :高等教育出版社 ,1999 . [ 9 ] () 刘志鸿 ,程力 ,牟海津 ,等 . 海洋微生物活性物质的研究概况 [J ] . 中国水产科学 ,1999 ,6 4:992103 . [ 10 ] ( ) [ 11 ] 黄耀坚 ,黄益丽 ,刘三震 ,等 . 具有免疫活性多糖海洋细菌菌株的筛选 [ J ] . 台湾海峡 , 2004 , 23 1: 382 42 . [ 12 ] A magata T , Mino ura K , N umata A . Gymna stero ne s , no vel cyto to xic meta bolite s p ro duced by a f ungal () st rain f ro m a spo nge [J ] . Tet rahedro n L et t , 1998 , 39 22: 377323774 . SCREENI NG A ND ID ENTIFICATIO N OF A NTIBIOTICS P ROD UCI NG BACTERIA FROM Z HO US HA N COASTAL 1 , 2 2 1L I Pe ng, WA N G J ia nxi n, Q IU J ua npi ng (1 . College of Biolo gical a nd Envi ro nme nt al Engi nee ri ng , Zhejia ng U nive r sit y of Tech nolo gy , Ha ngzho u 310014 , Chi na ; 2 . Ma ri ne Scie nce & Tec h nolo gy Colle ge , )Zhejia ng Ocea n U niver sit y , Zho u sha n 316000 , Chi na Abstract : To e xp lo re new a nti bio tic s , seawat e r , ma ri ne se di me nt a nd sto mach s of several ( ) ki nd s of ma ri ne fi sh Co mmo n mullet , Hap aolo ge nys nit e n swere collect ed f ro m Zho u sha n Sea a nd t he a dhe re nt bact e ria were scree ne d. To t al 120 ma ri ne bact e ria st rai n s we re i solat ed f ro m t he se sa mp le s , a nd 8 st rai n s sho wed a nti micro bial a bilitie s a gai n st t he i ndicato r st rai n s w hich we re S t a p h y l ococc us a u re us , Esc he ri c h i a col i , A s p e r g i l l us ni ge r , Ca ni d i a al bi c a ns a n d B aci l l us t h u ri n g i e ns is . B y do uble2a ga r diff u sio n met ho d , st rai n N F19 e xhi bit e d relative2 l y hi gh a nti micro bial a bilitie s. 16 S rDN A seque nce s a nal yse s sho wed t he st rai n belo ng to L act obaci l l us s a l i v a ri us . Key words : do uble2a ga r diff u sio n met ho d ; a nti micro bial activit y ; 16 S rDA N