石蜡切片免疫组化染色步骤

石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理: 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体如下: 1.1 APES:现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 HistogripTM:将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine:将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化: 2.1 胰蛋白酶:一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37?、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如:2.2 胃蛋白酶:一般使用浓度为0.4%，消化时间为37? Laminin(层粘蛋白)，Collagen IV(IV型胶原)等。 2.3 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。,皂素(Saponin):一般使用浓度为2~10 3、抗原热修复: 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 ,枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后，3,H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92?~98?之间并持续10~15分钟(注意:无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。取出容器，室温冷却10~20分钟(注意:不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法:切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液(工作液)注 入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5~6分钟后)，计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92?~98?起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤: (以美国ZYMED公司SP试剂盒为例) 石蜡切片脱蜡至水。 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。 5~10,正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37?孵育1~2小时或4?过夜。 PBS冲洗，5分钟×3次。 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释)，37?孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37?或室温孵育10~30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37?孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37?或室温孵育10~30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 显色剂显色(DAB或AEC)。 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色步骤 m，室温放置30分钟后，入4?丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3,过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。,冰冻切片4~8 下接免疫组化染色操作步骤。