畜牧兽医学报� 2009, 40( 9) : 1350-1357
Acta Veterinaria et Zootechnica S inica
猪脑心肌炎病毒分离株 BJC3全长感染性克隆的
构建与拯救病毒鉴定
张国庆,朱�
,盖新娜, 郭�鑫,陈艳红,查振林,杨汉春*
(中国农业大学动物医学院 农业部人畜共患病重点开放
, 北京 100193)
摘� 要: 本研究旨在建立猪脑心肌炎病毒( EM CV)的感染性克隆技术。利用 RT-PCR 分 3段扩增出脑心肌炎病毒
BJC3 株的全基因组 cDNA , 依次克隆至低拷贝质粒 pWSK29,构建出全长质粒 pWSKBJC3/ w, 经体外转录和转染
BHK-21 细胞拯救病毒。结果表明,构建的全长 cDNA 克隆具有感染性, 在 BHK-21细胞上可拯救出病毒。拯救病
毒(命名为 rVBJC3W)在 BHK-21 细胞上的生长特性与其亲本病毒 BJC3 一致, 并保持了对小鼠的致病性。本研究
成功构建了中国第 1 株猪脑心肌炎病毒的感染性克隆,为深入研究其分子致病机制提供了必要的工具。
关键词: 脑心肌炎病毒; 感染性克隆;病毒拯救; 生长特性;致病性
中图分类号: S852. 659. 6� � � � 文献标识码: A � � � � 文章编号: 0366-6964( 2009) 09-1350-08
收稿日期: 2009-02-24
基金项目:国家自然科学基金重点项目( 30530550)
作者简介:张国庆( 1976- ) ,男,黑龙江密山人,博士,主要从事动物分子病毒学与免疫学研究
* 通讯作者:杨汉春, E-mail: yangh anchun1@ cau. edu. cn
Construction of Ful-l length Infectious Clone for Encephalomyocarditis Virus
BJC3 and Identification of Rescued Virus
ZHANG Guo-qing , ZHU Shu, GE Xin-na, GU O Xin, CHEN Yan-hong,
ZHA Zhen-lin, YANG Han-chun
*
( K ey L aborator y of Zoonosi s of M inist ry of A gr icul tur e, Col lege of Veterinary Medicine,
China A gr icul tur al Univ ersi ty , Bei j ing 100193, China)
Abstract: The object ive of this study w as to const ruct infect ious clone of encephalomyocardit is v-i
r us ( EMCV) . T he genomic cDNA of EMCV BJC3 w as amplif ied by thr ee overlapped segments
using RT- PCR, and cloned into low-copy plasmid pWSK29 to const ruct ful-l length cDNA clone
pWSKBJC3/ w . The pWSKBJC3/ w w as in vi tr o tr anscribed and transfected into BHK-21 cells to
rescue the virus. T he results show ed that the ful-l leng th cDNA clone w as infectious and the v irus
could be rescued on BHK-21 cells. T he r escued virus designated rVBJC3W was ident ified by RT-
PCR and indirect immunof luorescence assay ( IFA) . T he rescued v ir us had similar g row th char ac-
terist ics w ith it s par ental virus BJC3 and r emained the pathogenicity for mice. Our r esults indica-
ted that the f ir st infect ious cDNA clone of EMCV in China w as successfully established and pro-
v ided an essent ial tool for invest igat ing the mo lecular basis o f pathogenicity of EMCV.
Key words: encephalomyocardit is virus ( EMCV ) ; infect ious cDNA clone; virus rescue; grow th
character ist ics; pathogenicity
� � 脑心肌炎病毒 ( Encephalomyocardit is virus,
EMCV)是微 RNA 病毒科( Picornav ir idae)心病毒
属( Cardiovirus) 的成员之一。EMCV 的宿主谱很
广,主要感染啮齿类、猪、灵长类等动物,鼠类是其天
然贮藏宿主[ 1] 。自 1958年在巴拿马首次从患心肌
炎的病猪中分离到 EMCV 以来[ 2] , 由 EMCV 感染
� 9期 张国庆等:猪脑心肌炎病毒分离株 BJC3 全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定
引起养猪业的经济损失在许多国家均有报道 [ 3]。
EMCV 感染可致仔猪的急性致死性心肌炎、断奶仔
猪的突然死亡以及母猪的繁殖障碍 [ 4-8]。
中国规模化猪场 EMCV 的感染已从病原学与
血清学角度得到证实[ 9-11] , 对养猪生产的潜在危害
值得重视。已有的研究揭示了 EMCV 分离毒株在
致病性上存在差异[ 7] 。因此,揭示 EMCV 分离毒株
致病性差异的分子机制具有重要的理论和实践意
义。本研究拟以我国 EMCV分离毒株为
,建立
该病毒的感染性克隆技术, 以期为深入
其分子
致病机制提供必要的技术平台。
1�材料与方法
1. 1�材料
BHK-21细胞由作者实验室保存, 用 DMEM 培
养基培养。EMCV BJC3 由作者实验室分离并保
存[ 9]。克隆载体 pBluescript � II SK+ , 购自 Strata-
gene公司;大肠杆菌 DH5�购自北京全式金技术有
限公司。低拷贝载体 pWSK29由军事医学科学院
范宝昌博士惠赠。EMCV V P1单克隆抗体 C11 由
作者实验室制备。
1. 2�载体的改造
根据 pSWK29 全序列和 QuikChange� multi
site-directed mutagenesis kit ( Str atagene, Aarhus,
Denmark)使用
, 设计 2 对回文引物突变掉
3 536位的 S p e �位点及5 124位的B ssH �位点(表
1)。改造后的载体去掉了原有的多克隆位点,只含
有感染性克隆全长构建所需要的 Cla �、EcoR �和
S ph �位点,将其命名为 pWSK29m/ �。
1. 3�BJC3 全长 cDNA 及感染性克隆全长质粒的
构建
� �利用 QIA amp� Viral RNA M ini Kit ( Qiagen)
提取 BJC3的 RNA, 具体步骤参照试剂盒说明书。
获得的 RNA 以 20 �L RNase- free w ater ( Ambion
Inc. , T exas, USA)溶解,置于- 70 �冻存。根据
EMCV BJC3 全 基 因 组 序 列 ( GenBank No:
DQ464062) ,设计覆盖病毒全基因组的 3对重叠引
物,引物由上海英骏生物技术有限公司合成,用无核
酸酶的水配至使用浓度。在全长扩增的上游引物
T 7- SegA-F 中加入 T7 RNA 聚合酶启动子核心序
列。在引物 SegB-F 和 SegB-R中引入点突变,扩增
后将基因组第 6 262位的 T 突变为 A, 突变后密码
子 CGA与突变前密码子 CGT 均编码同一氨基酸
( R) ,为同义突变; 获得的序列 GAA TT C 为限制性
内切酶 E coR �的识别序列,作为感染性克隆的遗传
标记。引物序列见表 1。
1351
畜� 牧� 兽� 医� 学� 报 40 卷�
� �以病毒总 RNA 为模板, 应用反转录酶 Super-
scriptTM � ( Invitrogen life technologies, CA, USA)得
到高丰度的 cDNA。参照产品说明书构建 20 �L 反应
体系,在其中分别加入用以扩增 3个片段的下游引物
SegA-R、SegB-R和 SegC-R( 50 �mol �L-1 ) 1 �L。将
反应体系置于 65 �水浴5 min, 迅速冰浴 2 min。瞬
时离心混匀后于 30 �水浴 10 min, SegA-R、SegB-R
为特异性引物, 反转录温度为 55 � ; 而 SegC-R 为
Oligo( dT) 18 ,反转录温度为 50 �。反转录 2 h后置
于70 �水浴中 10 min终止反应,获得A、B、C 3个片
段的 cDNA。
以 cDNA 为模板,分别以 SegA-F、SegA-R, SegB-
F、SegB-R, SegC-F、SegC-R 为引物, 使用高保真酶
Pf uUl tra
TM
II Fusion HS DNA Polymerase ( Strata-
gene, Aarhus, Denmark)对 3个片段进行 PCR扩增。
按照产品说明书构建 50 �L 反应体系, 3个片段的扩
增条件分别为片段 A: 95 � 20 s, 61 � 20 s, 72 �
90 s;片段 B: 95 � 20 s, 58 � 20 s, 72 � 2 min;
片段 C: 95 � 20 s, 50 � 20 s, 72 � 45 s。PCR扩增
产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检查后进行回收、纯化。
将pBluescript � II SK+ 克隆载体分别用 Cla�/ Sp e �、
Cla �/ EcoR �进行双酶切,并将回收纯化后的 SegA、
SegB以相应的酶消化后分别克隆至载体, 获得的质
粒命名为 pBLSegA 和 pBLSegB。将 SegC 以 EcoR �
和S ph�双酶切后克隆至载体 pWSK29m/ �,将中间
质粒命名为 pWSKBJC3SegC。以 Cla �/ EcoR �双酶
切质粒 pBLSegB, 将酶切回收后的 B片段与 Cla �/
EcoR�双酶切后的pWSKBJC3SegC载体相连接,构建
中间质粒 pWSKBJC3SegBC;最后以相同的方法把片
段A 连接到 pWSKBJC3SegBC 上, 完成 BJC3 cDNA
全长质粒 pWSKBJC3/ w 的构建。所有中间质粒和全
长质粒的提取均使用 Wizard� Plus Midipreps DNA
Purifation System( Promega) ,获得的重组质粒经 PCR
和酶切鉴定后用紫外分光光度计测定浓度,置于- 20
�保存。全长质粒 pWSKBJC3/ w 的测序由上海英骏
生物技术有限公司完成。pWSKBJC3/ w 全长质粒的
构建策略如图1所示。
1. 4�全长 cDNA克隆的体外转录与转染
将 10 �g pWSKBJC3/ w 全长质粒用 BamH �线
性化, 并采用 T7 MEGAscript � Kit ( Ambion Inc. ,
Texas , USA)进行体外转录。根据产品说明书构建
20 �L反应体系,其中包括 10 �Reaction buffer 2 �L,
ATP、CTP、GTP、UTP solut ion 各2 �L, 线性化质粒
1 �g, Enzyme mix 2 �L, 用 RNase- free w ater 补至
20 �L。37 �水浴 3 h, 加入 1 �L TURBO DNase�,
37 �孵育 15 min 消化模板质粒 DNA。将获得的
mRNA 用紫外分光光度计测定浓度后立即用于转染
或置于- 70 �保存。
待 6孔细胞板( GIBCO, NY, USA)中的 BHK-
21细胞形成 80%左右的细胞单层后小心吸出上清,
每孔加入2 mL 平衡至室温的 Opt-i MEM � I Reduced
Serum M edium( Invitrogene Corporation, NY, USA)
洗涤 1~ 2次。将 1 mL Opt-i MEM � I Reduced Serum
Medium 与10 �L DMRIE-C脂质体( Invitrogene)涡旋
混匀,再加入 5 �g RNA,轻柔混匀后立即转入细胞单
层,同时设 Opt-i MEM � I Reduced Serum Medium 和
DMRIE-C脂质体对照。CO2 培养箱 37 �培养 4 h
后,小心吸出转染液,加入2 mL 2% DMEM 维持液继
续培养,每隔一段时间观察细胞病变( CPE)。
1. 5�拯救病毒 rVBJC3W遗传标记的酶切鉴定及全
基因组测序
� �将拯救病毒的细胞培养上清反复冻融 3次后提
取 RNA,以 EcoR -I F/ EcoR -I R 为引物(表 2)利用
RT-PCR方法扩增病毒基因组 5 924-7 062区域。取
20 �L PCR产物用 EcoR �进行酶切, 同时扩增 BJC3
野生毒基因组上的相同区域,也用 EcoR �酶切作为对
照;用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳对 PCR扩增产物及酶切
产物进行分析。
利用 RT-PCR分段扩增拯救病毒的全长 cDNA,
拼接获得拯救病毒 rVBJC3W的全基因组序列。测序
工作由上海英骏生物技术有限公司完成。
1. 6�拯救病毒的间接免疫荧光( IFA)检测
待 96孔细胞培养板( GIBCO, NY, U SA)中的细
胞长成良好的细胞单层后,每孔接种第 4代拯救病毒
100 �L,同时设阴性对照,于 37 �吸附 1 h后, 加入
100 �L 含 2%新生小牛血清的 1� DMEM 营养液继
续培养。接种 10 h后轻轻甩去上层液体,用� 20 �
预冷的丙酮室温固定15 min, PBS洗涤3次。每孔加
入 100 �L 1: 100 稀释的 EMCV VP1 单克隆抗体
C11, 37 �湿盒作用 1 h; PBS 漂洗 3次,每次 5 min;
每孔加入50 �L 1: 100 稀释的含 0. 01%伊文斯蓝的
荧光标记( FITC)羊抗鼠 IgG, 37 �恒温箱中避光作
用 45 min; PBS漂洗 3次,每次 5 min; 自然晾干后加
PBS缓冲甘油( 0. 01 mol � L-1 pH7. 4 PBS: 甘油=
1: 9)封片,于荧光显微镜下观察结果并照相。
1. 7�拯救病毒的生长特性分析
待 96孔细胞培养板中的细胞长成良好的细胞单
层后,将拯救病毒以维持液进行 10 倍梯度稀释,取
1352
� 9期 张国庆等:猪脑心肌炎病毒分离株 BJC3 全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定
10
-4
~ 10
-8稀释度的病毒液进行接种;每个稀释度平行
接种4孔,每孔 100�L。37 �吸附1 h后小心吸弃上
清,加入 100 �L 维持液继续培养。20 h 后观察 CPE
并记录各个梯度出现 CPE的孔数,根据Reed-M�ench
法计算 TCID50。
第4 代拯救病毒 rVBJC3W 和第 8 代亲本毒
BJC3均以100 TCID50的病毒量接种 BHK-21单层细
胞,接种后每间隔 4 h吸取细胞上清, 直至接种后 36
h。按照上述方法测定每个时间点所取细胞上清的病
毒滴度, 绘制病毒在 BHK-21 细胞上的一步增殖
曲线。
1. 8�拯救病毒对小鼠的致病性试验
取 30只 6周龄的雄性BALB/ c小鼠,随机分为 3
组,每组 10只。其中2组作为攻毒组,分别注射BJC3
野生毒和拯救病毒 rVBJC3W,每只小鼠腹腔注射 0. 2
mL 病毒液,攻毒剂量为 2� 106TCID50 �mL-1。另外
一组作为对照,腹腔注射 0. 2 mL 细胞维持液。攻毒
后观察 14 d,并绘制存活曲线。
图 1� pWSKBJC3/ w全长质粒的构建策略
Fig� 1� The construction strategy of pWSKBJC3/ w
1353
畜� 牧� 兽� 医� 学� 报 40 卷�
2�结果与分析
2. 1 �覆盖 EMCV BJC3 全基因组的重叠片段的
RT-PCR扩增
� �用设计的 3对引物, RT-PCR 扩增获得 EM-
CVBJC3覆盖全基因组的重叠片段 A、B 和 C, 预期
扩增片段大小为2 957、4 005和1 497 bp。用0. 8%
琼脂糖凝胶电泳进行分析, 扩增条带大小与预期相
符,结果见图 2。
2. 2�全长质粒 pWSKBJC3/ w的酶切鉴定与测序分析
构建的全长质粒 pWSKBJC3/ w 用 Cla � 和
Sph �进行双酶切鉴定,酶切产物经 0. 8%琼脂糖凝
胶电泳分析证实获得 BJC3全长 cDNA 克隆, 大小
约为 7. 8 kb。对全长质粒进行测序分析,结果显示
获得的 BJC3 cDNA 克隆全长为 7 736 nt�不含 poly
( A) �, 5�非翻译区( 5�U TR)的 Poly ( C)可读长度为
15 nt , 基因组 3�末端的 Po ly ( A) 为 79 个腺嘌呤。
与 EMCV BJC3 登陆 GenBank 序列相比, 全长
� � � � �
cDNA克隆除 E coR �遗传标记外, 共有 3个随机分
布的点突变,其中 1个位于 5�非翻译区, 另外 2个位
于编码区。
M. DL2000 P lus Marker; 1. Segment A; 2. Segment B;
3. Segment C
图 2 � EMCV BJC3 cDNA 的 RT-PCR扩增
Fig� 2 � Amplification of BJC3 cDNA by RT-PCR
表 2� 全长 cDNA与 EMCV BJC3 基因组序列比较
Table 2 � Genomic comparison of ful-l length cDNA and parental EMCV BJC3
位置*
Location*
三联密码子
T riplet code
核苷酸改变
Nucleot ide change
突变类型
T ype of mutation
氨基酸改变
Amino acid change
所在蛋白
Predicted domain
628 - G� T Replacement - 5� UT R
2 958 TAT A� T Replacement Y� F VP1
4 368 GT C T � C Replacement V � A 2C
* 核苷酸位置指在 EMCV BJC3 序列中的位置 ( GenBank 收录号: DQ464062)
* Nucleo tide locations ar e numbered acco rding to BJC3 sequence ( GenBank accession number : DQ464062)
2. 3�病毒的拯救
以 BamH �线性化后的全长质粒为模板, 采用
T7 MEGA script � Kit ( Ambion Inc. , T exas,
USA)进行体外转录,获得大约40 �g mRNA。将约
5 �g mRNA 转染6孔板培养的 BH K-21细胞,转染
后 20 h可以观察到明显的 CPE, 与 EMCV BJC3病
毒感染所产生的 CPE一致(图 3) , 将拯救的病毒命
名为 rVBJC3W。取 1 mL 转染后产生的拯救病毒
的细胞上清接种细胞瓶中的 BHK-21细胞, 连续传
代扩大培养。
2. 4�拯救病毒的遗传标记鉴定与全基因组测序
同时提取拯救病毒与 BJC3 野生毒 RNA, 用
RT-PCR扩增病毒基因组 5 924-7 062 nt区域,同时
设 RNA 和水对照。各取 20 �L PCR 产物进行
EcoR �单酶切, 37 �水浴作用 1 h。用 0. 8%琼脂
糖凝胶电泳对 PCR扩增产物及酶切产物进行分析。
拯救病毒的 RT-PCR产物酶切后产生 338和 801 bp
2个片段,而 BJC3的扩增产物 EcoR�不能切开, 仅得
到唯一条带;对照均未有特异性条带出现(图 4)。
利用 RT-PCR 分段扩增拯救病毒的全长 cD-
NA,送至上海英骏生物技术有限公司进行测序, 拼
接获得拯救病毒 rVBJC3W 的全基因组序列。测序
结果证实拯救病毒的全基因组序列与构建的全长
cDNA 克隆序列一致。
2. 5�拯救病毒的间接免疫荧光( IFA)鉴定
用 EMCV VP1蛋白单克隆抗体 C11作 IFA鉴
定拯救病毒 rVBJC3W。结果显示, 第4代拯救病毒
rVBJC3W 接种 BHK-21 单层细胞 10 h后,感染细
胞胞质内呈现可见的特异性荧光, 细胞对照则未见
荧光(图 5)。
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� 9期 张国庆等:猪脑心肌炎病毒分离株 BJC3 全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定
A. BH K-21 cells; B. CPE o f rVBJC3W ; C. CPE o f BJC3
图 3� 拯救病毒 rVBJC3W在 BHK-21 细胞上产生的细胞病变( 200 � )
Fig� 3 � CPE of rescued virus rVBJC3W on BHK-21 cells ( 200 � )
M. DL2000 Plus marker; 1. rVBJC3W RT-PCR product;
2. BJC3 RT-PCR product; 3. rVBJC3W RT-PCR product
dig ested by EcoR I; 4. BJC3 RT-PCR product dig ested by
EcoR I; 5. rVBJC3 RNA RT-PCR control; 6. Water contro l
图 4� 拯救病毒 rVBJC3W遗传标记的酶切鉴定
Fig� 4� Genetic marker detection of rescued virus rVBJC3W
2. 6�拯救病毒的增殖特性
将第 4代拯救病毒以维持液进行 10倍梯度稀
释,取 10-4 ~ 10-8稀释度的病毒液接种 96孔细胞培
养板中的 BHK-21单层细胞, 37 �吸附 1 h 后换
液。20 h 后观察 CPE, 并记录各个梯度出现 CPE
的孔数,根据 Reed-M�ench 法计算 T CID 50 ,结果为
10-8mL-1 ,与亲本病毒的 TCID50没有明显差异。第
4代拯救病毒 rVBJC3W 和第 8 代亲本毒 BJC3均
以 100 TCID50的病毒量接种 BHK-21单层细胞,绘
制病毒在 BHK-21细胞上的一步增殖曲线(图 6)。
结果显示拯救病毒与亲本毒在 BHK-21 细胞上的
增殖动态相似, 各时间点的病毒滴度无统计学
差异。 � �
A. rBJC3W; B. BH K-21 cells
图 5 � 拯救病毒 rVBJC3W感染 BHK-21细胞的间接免疫荧光检测( 400� )
Fig� 5� Identification of rescued virus rVBJC3W by IFA ( 400� )
2. 7�拯救病毒的小鼠攻毒试验
用第 4代拯救病毒 rVBJC3W 和第 8代亲本毒
BJC3对 BALB/ c小鼠进行腹腔接种,攻毒总量均为
4� 105T CID 50。攻毒小鼠均在攻毒后 3~ 5 d 出现
明显的临床症状, 主要表现为被毛粗乱、精神沉郁、
反应迟钝、蜷缩、流泪、呼吸急促,并表现出明显的神
经症状,如震颤、后肢麻痹、转圈、侧颈和四肢呈划水
状等。拯救病毒与亲本毒的小鼠存活曲线(图 7)显
示,拯救病毒对小鼠的致病性和毒力与亲本毒一致,
接种小鼠全部死亡。对照小鼠全部健活。
1355
畜� 牧� 兽� 医� 学� 报 40 卷�
3�讨�论
EMCV 全基因组大小为 7. 8 kb 左右, 基因扩
增、连接全长 cDNA 相对容易。但是, 由于 EMCV
基因组结构的特殊性, 特别是 5�非翻译区的特殊结
构,在病毒复制翻译中起着举足轻重的作用, 是感染
性克隆能否成功构建的重要因素。EMCV 转录机
制独特,其 5�末端没有�帽�结构,由 20个氨基酸组
成的 VPg 充当病毒的�帽�;且 5�U TR区域较大, 包
括 1个特殊结构 ���内部核糖体进入位点( Internal
ribo somal ent ry site, IRES)。IRES 由大约 450 个
碱基组成,其作用是引导病毒基因组不经过正常的
5�末端�帽�结构而直接进行多聚蛋白的翻译 [ 12-14]。
IRES序列的扩增要求完整、准确, 才能有效启动
EMCV 的转录, 从而产生具有感染性的 RNA [ 15]。
本研究构建的感染性克隆在 628位发生的 G �T 碱
基置换正好位于 IRES内部, 但是与 EMCV 其它分
离株相同位置( HB1、EMCV-R、BEL-2887A/ 91)的
序列比对发现,其它分离株 5�U TR 该位置均为 T。
这至少说明此点突变在自然毒株中存在, 不会导致
病毒的致死性变化。
5�末端另外一个重要组成部分就是 Po ly( C)结
构域,其序列组成为 CmU CU C3UCn。连续 C的结
构一方面导致反转录酶在反转录过程中识别、校正
困难,以及高保真酶在 PCR扩增过程中连续扩增及
校正的难度增大; 另一方面, Poly ( C)的测序同样是
难点,普通测序很难准确地测定其长度。本研究构
建的 EMCV BJC3感染性克隆通过测序证实可读的
Poly ( C ) 较 短, 长 度 为 32 nt, 序 列 为
C15U CUC3U C10。获得的拯救病毒 rVBJC3W 能
够对 BHK-21产生明显的 CPE, 且体内试验表明拯
救病毒与亲本毒在鼠体上的毒力相似, 已有的研究
表明,较短的 Poly( C)并不一定影响 EMCV 毒株的
细胞适应性及致病性[ 16-17] 。
EMCV 3�U TR在病毒基因组的复制中也发挥
重要作用。3�末端为异源长度的 Poly ( A) , 构建的
EMCV 全长感染性克隆质粒测序结果显示, Poly
( A)为 79 nt; 亲本株 BJC3的 Po ly ( A )较短, 仅 15
nt。Po ly( A)的长度似乎对全长感染性 cDNA 克隆
的影响不大, 7个 A 的 Po ly ( A)即能使细胞发生明
显的 CPE,引起小鼠致病[ 18] ,本试验获得的拯救病
毒 rBJC3W 与亲本株病毒 BJC3的 T CID50、CPE、细
胞生长曲线都没有明显的差异。
本研究在国内首次成功构建 EMCV 全长感染
性 cDNA 克隆,为 EMCV 的分子致病机理、疫苗构
建、基因功能等病毒分子生物学研究提供了有力的
工具。
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