富含二硫键的小分子肽合成研究进展

『『I ／3) 妒一22 有机化学 YOUJI HUAXUE，1999，19，214—223 综述与进展 f’》 ? ：7 F 富含二硫键 的小分子肽合成研 究进展 I e 蒋辉 钟明鼐 陈冀胜 (北京药物化学研究所 北京 102205) 遭 (北京大学化学与分子工程学院 北京 100871) 摘要 综述了 目前多肽合成领域构建 2—3个二硫键的策略和对二硫键排列方式给予定位的。 关键词 多肽合成 ，二硫键形成，氧化折叠 ，酶解 ，二硫键定位 — — ～ ～ — — ～ 、 — — ～ — ～ 多肽分子内的二硫键对其活性有着重要的影响，但同时又给合成带来一定难度 ，特别是在高活 性小分子肽的分子内含有多个二硫键时给合成研究带来 的困难更大 所以，目前不少多肽化学家 相继开展了这一领域的研究。 二硫键(disulfide bond)在蛋白质和多肽分子中对保持其生物活性和构象稳定有着举足轻重的 作用。通常含有二硫键的小分子肽无论用溶液法或固相法合成时，大都是将脱保护的线性肽链中 的两个半胱氨酸残基(Cys)的琉基氧化成二硫键。但含多对 Cys残基时，其氧化成二硫键受许多因 素影响，往往会生成多种异构体，使产物的产率降低，且给分离纯化带来许多麻烦 。为此，在合 成路线时必须考虑以下影响因素：(1)半胱氨酸残基侧链巯基保护基的选择；(2)氧化体系的选择； (3)氧化方式的选择。 本文就富含二硫键的小分子肽合成研究给予概述。 l 半胱氨酸残基上巯基保护基的选择-1’51 在多肽合成中，半胱氨酸琉基的保护基选择受多种因素制约，其中主要有：合成策略、氧化体系 及在线性肽合成和切割过程中巯基保护基对保护试剂、中和试剂以及裂解试剂的稳定性，以及巯基 脱保护试剂对其它氨基残基有无影响等。 1．1 苄基类保护基 苄基(hem y1)是半胱氨酸侧链巯基常用的保护基。苄基对酸稳定，需用液态 HF脱保护 ，但费 时较长，有时还脱不完全，原因是 s—c键很稳定。此外 ，也可用钠和液氨脱苄基．但此法往往对肽 链有危害，会造成 Lys—Pro肽键断裂，故不常用。 为了降低 s—c键的稳定性 ，使保护基易脱掉．从而衍生出以下新的苄基类保护基 对甲氧基 苄基(Mob)，对 TFA有一定敏感性 ，适用于合成短链肽 ，可用液态 HF在较缓和条件下脱去。对甲 基苄基(Mbz1)，既可用液态 HF在 anisol存在下于 0'E，6Omln内脱 除，又可用三氟甲磺酸于 m— cresol和 TFA存在下脱去。另外还有 2，4，6一三甲基苄基，3，4一二甲基苄基(Dmb)可用同样方法 脱除。通常 Mbzl、Dmb用于长链肽的台成中。 1997—08一l8收稿 ，1998—04—02修回。 ， ， ，l＼、 ● -． r． ， ， 镢 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 3期 蒋 辉等 ：富含二硫键的小分 子肤合成研究进展 215 1．2 三苯甲基(trity1) 对皂化和肼解稳定，对酸敏感 ，可以用 HCI在有机溶剂如氯仿中脱除，也可用 Ag+或 H 试剂 脱掉。常用碘在甲醇中脱去，并直接形成二硫键，由于这个特点常用于固相合成。也可在乙硫醇存 在下用 TFA脱除，是一个可逆反应。 1．3 乙胺甲酰基(ECl 对 TFA和 HBr／AcOH等强酸相当稳定，对碱不稳定(pH>8)，可用强碱，液氨，或肼脱去 ，更好 的方法是用银盐或二价汞盐脱除。 1．4 乙酰胺甲基(Aon) 目前 最 常用 的 巯基 保 护 基之 一 ，用 碘 在 甲酵 或 乙 酸 中直 接 脱 除并 形 成 二 硫键 。用 TI·(OOCF3)3，Hg(OOCF3)2能够脱掉 ，但 T1“，H 盐有毒，操作繁琐。它不能用醋酸银脱除 ，可用 醋酸汞脱除，最近有人尝试用三氟甲磺酸银给予脱除 。它对 TFA稳定，对液态 HF相对稳定。 1．5 叔丁基 (卜-Bu) 对酸、Na／NH (1)及其催化氢化都完全稳定，用液态 HF于 20℃处理 60 min才开始脱去 ，故一 度未被采用。后来发现可用 Hg(OOCF3)2／HOAc或 Hg(OOCH3)2于pH=4，25~C处理数小时定量脱 去。可用邻硝基氯化硫酚和 2一巯基乙酵，两步方法脱保护 也可用 CH SiCl3在二苯亚砜 中脱除 并直接形成二硫键【 ， 。 1．6 对硝基苄基 该保护基对酸稳定 以前采用先催化氢化后用 Hg2 脱去 ，后来在 CH3SiCI 一PhS(O)Ph系统 中可直接脱去并同时生成二硫键。 1．7 三甲基乙酰胺甲基[Taon，(CI-I3)3CCONHCH2] 这是新近使用的Cys巯基保护基 ，在强酸强碱条件下比 Acm稳定[ ，其脱保护方式 另外，还有许多保护基 曾一度用于保护琉基，如 一苄硫甲基(S—Btm)，S一烷硫基等。 1．8 2一吡啶硫基 (SPy)【7-B·m】 常用于赋链 间二硫键 的形成。由2，2 一连硫二吡啶和肽链 中 Cys巯基发生取代 1人 ，再和另 一 条含 自由巯 基的 肽链 发 生取代形 成 肽链 间 的二 硫键。它 的衍 生 物 Npys(3一nitro一2一 pyridysulfeny1)-I1 作为 Cys的保护／活化基团也已得到应用。 选择保护基的原则就是要使之在线性肽台成过程中保持稳定 ，脱保护时易脱干净且互不干扰。 2 氯化体系的选择 不论分子内或分子间形成二硫键时，选择性和有效性是两个基本。常用的氧化剂有空气 ， 谷胱甘肽 ，K3Fe(CN)6，I2，DMSOl 16 2．1 空气氯化体系 空气氧化是在水溶液中完成 ，要求在碱性或中性条件下，在很稀的浓度(<0．5mg／mL)中经过 长时间的氧化(约数十个小时)才能完成，反应终点可用 Elhnan试剂 DTNB[5，5 一D iobis(2一 nitrobenzoic acid)]检测[”】。它的最大优点是副产物为水 ，缺点是花费时间长。该体系有时要加入 少量氧 化／还原 型谷胱甘肽加速反应 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 216 有 机 化 学 1999正 2．2 谷胱甘肽氯化体系 利用氧化／还原型的谷胱甘肽同反应底物发生二硫键的交换来完成 ，这种方法在碱性条件下是 行之有效的，还原型谷胱甘肽催化二硫键的重排，使得氧化产物 比较单一 ，是对空气氧化体系的很 好补充。用氧化型 DTI"(二硫代苏糖醇)同样有效【”，t6,tg~驯 。 2．3 碘(I2)氧化体 系[ 】 I2作为氧化剂可以在甲醇或乙酸溶液中于较短时间内脱去 Cys侧链 一sH 的 Acm，Tacm，Trt 等保护，同时形成二硫键。基于这一优点，所 以在含有二硫键 的多肽合成 中经常使用。但它对 Tyr，Trp，His等氨基酸残基会有敏感作用。 Tam J P认为用谷胱甘肽氧化或空气氧化都是慢过程 ，它们会在不同的异构体之间产生平衡 ， 产生热力学控制的产物。相 反，强氧化剂 Fe(CN) ，I：则产生动力学控制的产物，这类氧化剂常 在酸性条件下使用，但副产物较多。几个亲核性氨基酸残基如 Met，Tyr，1 和 His对这种类强氧化 剂在一定程度上具有敏感性。 一 般而言，用空气或谷胱甘肽氧化的方法对大多数合成是适合的，对部分酸性肽或蛋白质也是 适用的，然而对于碱性或疏水性肽往往在折叠过程中，在 pH值接近碱性或中性等电点时会聚结或 沉淀出来。这时用上述氧化系统就不合适了，用 DMSO氧化则可克服这个缺陷。 2．4 DMSO氧化体~[6,12,22】 DMSO氧化系统适合很宽的 pH值 ，同传统的空气氧化相 比有许多优越性。首先是 DMSO能 同水混溶，可以使用高浓度的 DMSO以加快氧化反应进程；对于疏水肽而言，这是个好选择，另外 ， 裂解的粗肽经 HPLC分离后可直接进人 DMs0氧化介质．氧化后又可以直接进人 HPLG分离 ，操作 简便。但是，对于进样量有限的 HPLC而言，工作量是大大增加了。可采用透析或凝胶色谱将盐和 DMSO脱掉，浓缩后再用 HPLC分离。 其次是氧化缓和，DMSO本身被还原为硫醚，无害。而且对 Met，T ，His，1 等敏感残基无副 作用。 Tam J P用该系统成功地合成了含 3个二硫键的human defensin，产率高达 10～14％；用空气 氧化的产率 <1％，且产生沉淀。后来在此基础上 日本学者发展了两个新的体系，将脱保护和成键 同时或分步完成。 2．4．1 三氯甲基硅烷一二苯亚砜体 系【 ， 该体系能将半胱氨酸残基的不同巯基保护基在 4℃，10～30rain内脱除，并同时形成二硫键 ，并 成功地应用于合成芋螺毒素 a—MI和日一人心房肽以及人胰岛素。其可能的机理如下： s_—一 S — Cys— Cys一 。 f Hr c6 —s(0)—c6 l l — 一 一 一 Cy8— — Cys + C6H5— 6H5 + R R=Acm，Tacm，Barn ， 一Bu，i—Pr，MeoBzl，MeBzl，NO2Bzl Barn =benzcam~do methy1．NO2Bzl=4一nitrobenzyl R． C — R ● 0 ● 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 3期 蒋 辉等 ：富含二硫键的小分子肽合成研究进展 217 2．4．2 三氟甲磺酸银[Ag0Tf—DMSO／HCI(aq)]体系[ Acm AgOTf TFA sAg + AgC1 Y 1tool几 Hcl DMS0 三氟甲磺酸银(A异0Tf)，对 Cys的 Acm保护基可以定量的脱除，Trp不受任何影响 该系统和 其它氧化系统相配合成功地合成了含三对二硫键的 tachyplesin和 endothehn。肽链 中同时形成多 个二硫键时常用空气，K3Ve(CN)6或谷胱甘肽氧化体系进行环合，其它几个氧化体系多用于单个二 硫键的环合 2．5 氧化体系优化与溶剂的选择 常见的溶剂有 H2O，MeOH，CHCI3，AcOH，Dioxane，CH2CI2，CC14以及混合溶剂等。溶剂的物 理性质，如极性会影响肽的溶解度，诱导出不同的二级结构 ，从而影响反应速度。表 1，表 2分别列 出了溶剂对反应速度和氨基残基的影响程度。 采用不同的氧化剂和溶剂，结果也不一样。实验中采取何种氧化体系要从合成策略出发，根据 保护基特点和线形肽的溶解性，用实验摸索。 3 含三个二硫键的单链小肽氧化策咯 通常将肽链内半胱氨酸巯基保护基脱除，在合适的氧化环境 中形成二硫键。近年来有人研究 了在固相载体上直接环化生成二硫键的方法，即不需肽链从树脂上切割下来，先氧化成桥，再行切 割 23～矧。其优点在于使肽分子在衡脂上呈现假稀释状态(pseudo—dilution)，难以进行分子间反 应。对含有一个二硫键的短链小肽用假稀释策略合成效果颇佳。但尚不适用于含有两对以上二硫 键的小分子肽的氧化【 ，产率较低 ，需做进一步方法改进 ，如减小树脂取代值，寻找合适的溶剂和 氧化剂。含两对二硫键小分子肽的合成 ，通常有一步法和二步法。一步法随机氧化理论 能生成 4 个异构体 ，二步法可以实现选择性氧化 ，只有一种产物，后者需要两种在不同条件下脱除的保护基。 对于只含两对二硫键小分子肽的合成，二步法无疑是适合的。含三个二硫键肽氧化策略通常也有 一 步法和序步法(the sinsle step approach，the sequential step approach)之分。一步法依赖肽链本身 折叠成 自然状态的能力，随机氧化得到目标肽。含有 6十 Cys残基的肽链氧化形成三个二硫键时， 理论上应有 l5种异构体。随机氧化，得到的产品成分复杂，分离困难，产率不高。其局限性在于并 非所有的肽都能折叠出自然状态的构象。序步法需要三种能在不同条件下脱除的保护基，而且在 脱除巯基保护和氧化成键时对已形成桥的二硫键不能构成危害。 维普资讯 http://www.cqvip.com 2l8 有 机 化 学 1999年 表 l 以碘脱除巯基保护基 Trt与Acm半衰期之比较 · Tab．1 Half—time(tH)f0r the iodine oxidation of R—S—Trt and 一S—Acm in various solvents ， *R=Boe—Cys(X)一Gly—Glu( —BuO)2；啦浓度为5x10一 mol·dm_’，12浓度为 15 x10一 mol·dm一 表 2 不同溶剂中碘氯化对氨基酸稳定性的影响 Tab ．2 Stab ility of various amino acids under the conditions of iondine in various solvents 人们 目前经常采用一个折衷的办法——两步法 。即将六分之四的半胱氨酸的残基首先氧化． 形成两个二硫键 ，第三个二硫键 在第二步中完成。第一步依赖 随机氧化，产生异构体理论数 目为 3，降低了分离难度，纯化后 ，在第二步中可以选择性地形成第三个二硫键。但究竟选择哪一个二硫 键在第二步中形成更好．这要根据肽链中二硫键的分布以实验决定。对于全交叉式二硫键分布的 情况来说 ，实验通常选择处于中间交叉位置的一个【 J，该策略已成功地应用于台成多种芋螺毒 素(CTX)。用一步法合成含三个二硫键肽的例子非常多。CTX m—SVIA[32]为一个 24肽+用 BOC— MBHA／TFA策略台成线性肽 ，Mbzl做 Cys巯基保护基．空气氧化，最高产率为 14％，堪称一步氧化 的典范。序步法合成也不乏成功之例，如 CTX m—MVIIA和 Human defensin 2的台成，在具保护的 线性肽台成过程中用到了片段台成法【33- 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 3期 蒋 辉等 ：富含二硫键 的小分子肽合成研究进展 2 L9 实践中一步法和序步法之优劣不能一概而论，这仅是两种合成策略，前者减少了氧化和分离次 数 ，从而减少了损失 ；后者减少了副产物的种类 ，方便了制备，对于没有样品的活性肽而言，则 免去 了对二硫键定位的麻烦。对于含四个以上二硫键肽的氧化都是一步进行。二步法合成 CTX — MVIID[ 9】和序步法合成 Human defensin 2[34]分别参见图 1和图 2。 c『s一 K-T-M-Y-N-cvs。c『 -s-c y n l TFA H20：Thioanisole：CsHsOH(10：0 5：0 25：0 75) Acm Acm Clys-Q-G-R-G-A-S-~ys-R-K-T-M-Y-N-Cv l Cy l 。_。_。 。 _Cy I 』air oxid (pH 7．5) room mp。 。 【垡 [!Ac二m ~c：mC C ：-C!C吉出 ⋯-c⋯-cc⋯-c⋯-c ⋯-c—cc—c一一 ．⋯c⋯。c ⋯。 ⋯’ l l L—— !l l 1 ．1 1 Iz 80％HOAc I 图 1 {∞一contox~n MVIID的合成{二步法) Fig．1 The s~ thesis of∞一contoxin MVIID by two step approach 序步合成人胰岛素体现了双链肽问的二硫键的构建策略的巧妙，参见图 3l8 J 影响产物的因 素，主要是在氧化条件下能否使肽链保持正确的折叠构象 ，这是 由于肽链本身和溶液环境因素所 致。在给定的环境条件(溶剂，温度，pH，离子强度以及其它成分)中，蛋 白质和多肽总是采取低 自 由能的构象状态 ，但未必是天然构象状态。在生物体内，当天然肽出 自核糖体时，会有异构酶和其 它分子伴侣的协助 ，能循序折叠，生成二硫键正确搭配的产物l35,36 J，这些因素在人工合成过程中是 不存在的，通常出现二硫键错配的异构体。Zhang和 Snyder等人研究 了影响选择性形成二硫键 的 因素【16,37,38]，认为两个半胱氨酸残基问的残基类型是一个因素，残基问作用力如氢键作用不可忽 视 ，它会增加链的刚性，残基数更显得十分重要，区问越大越难于折叠成键。另外，实验证明对于含 两个交叉二硫键的小肽，如果两个二硫键 区间的大小不一致 ，则使得分步合成时，氧化顺序不同，产 率也不同[36_。 总之 ，在合成含多个二硫键 的肽时，氧化策略和氧化的条件(溶剂 ，温度，pH，离子强度以及其 它成分)是关键。 维普资讯 http://www.cqvip.com 有 机 化 学 1999l正 Tn cys—Y 。—R斗-P_^一c 一A_G_E_R'R_Y_G T-Cy—Y-Q_G_R七w．^_F部 —c如一,s I~$in Acm Mob A口rI ob 1 。 岬 ’ H cys一 s—R-I呻-^一叩十 A_G_E_R_R—Y_G_Tqs—Y—Q—G-R-L—W-A-F-Cys s Acm Mob A口n ob l 。蜘圳on 钟s—Y—cys_R 十 -^c!fs一卜A_G_E_R_R Y—G—T—唧s_Y_Q_G-R_L—w—A-F-C—I 口^rI ob ． , ys 。b lI2 AcO 80％ c s一 s—R__P—A—C'(s-I—A-G_E'R'R-Y_G—T-cys—Y_Q_G'R_t_w—A十cys一咄 L—一 Mob l ob A．G_E_R'R-Y—G—T-Cys—Y_Q_G_R_L-w_A_F c虹_Y I 1．． ————————————————————————．．．．】—————————————————．————__j - - - · - — - - - - - - - - - - - — - — — — ，． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． — ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． — — ． 图2 Human defensin 2的合成路线{三步) Fig．2 The synthesis of human defensin 2 by three step approach ⋯ ⋯ 0 l l r 0 ~fit'oofl- 1．So~l ⋯ -PhaseF 咿 eptid田 一 m ． 翻 — s — ss Y Y_qs·N l 1 s咖 e Pe Syathtsis l2lM肼m— Acm H F N．o L s．GsH ．E{ ¨ ，—G_聃 ．G F-~-T-P-K-T I3 s-s口 ， F-V-N．o Ld ．GsH ， Bl州删 § R6F．F．Y．T．P_K-T }^ f Bu} Bu ∞ BQ s _T ds Y． YqB_N _ ． ． qs d 阱丫qs_N 锄^ ／ — L+ I ／ F．V J {儿· s— 山V B Vlq l 阱 w K_T F-V-N-Odt-IA2ys L 删 孚w LK_T ／ 图 3 序步合成人胰岛素 Fig．3 The synthesis of human insulin by sequential step approach 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 3期 蒋 辉等：富含二硫链的小分子肽合成研究进展 221 4 多肽分子中的二硫键定位分析研究 确定二硫键的位置在多肽合成中是一个非常重要的环节。目前所用方法主要有：首先用酶法 ， 通常将肽键打断，保持二硫键联结，然后通过分析裂解片断进行确定。其次，用 x射线晶体图像测 其三维结构，确定肽分子中二硫键的位置。第三种方法是采用 NMR技术，通过解谱确定小蛋白中 的二硫键位置。 对于分子量只有几千的小分子肽而言，晶体培养不易，光谱解析分辨率要求高，样品用量大，解 谱复杂，仪器使用受限；酶法比较常用，包括部分还原测序，酶解序列分析和酶解质谱法。下面分别 予以简介。 4 1 部分还原测序法【 ，删 其一般程序是先将肽和一种还原剂如TCEP[三(2一羧乙基)膦]快速反应并迅速冻结，使其只 发生二硫键的部分还原。然后 HPLC分离 ，将分离出的各个组分用烷基化试剂如碘代乙酰胺分别 进行烷基化，再将每个组分用另一种试剂如 4一乙烯基毗啶还原和烷基化。最后用 Edman序列分． 析法测其序列，从而测出不同烷基化的半胱氨酸的位置，分析两个衍生物就足以确定二硫键的排列 情况 4．2 酶解 一质谱法【4l’删 基本原理 ：将已知 AA序列的肽用专一性的酶将在某个特定位置解断 ，然后用 HPLC将各片段 分离纯化，作高分辨FAB—MS。根据各片段的分子离子峰值推测可能存在的片段，然后将各片段 组合 ，推断出原来 的结构。方法简单，但有时需要用 Edman测序来确证结果。 4．3 酶解 一测序法 ,46,4T] 基本原理：用专一性酶水解肽，再用 HPLC分离纯化各片段，将各片断用 Edman方法测出从 顺序。二硫键保持连结，这样就能确定胱氨酸在各片段中的位置，然后再将各片段组合．推断出原 来的结构。这个方法利用了这样一个事实．当降解掉一个 Cys时，它仍通过二硫键联在另一个 Cys 上，当序列降解到该 Cys时，一个胱氨酸才从肽链中解脱出来，这时才被检测到。当然也有可能两 个半脱氨酸被同时检测到．如果肽段以二硫键相联有两个 N端，两个 Cys离两个 N端的距离相等 的话。此法往往要几种酶的分别消化．测定的结果相互确认后才得出结论。 裹3 常用的专一性酶及其切点 Tab．3 The usual pro~inase and their deavage residue 酵 裂解部位 葡萄球菌酵(au舢 pretease V8) 胰置白酵(t~ sln) ■置白酵(peplin) 叠白内讶酵(endopzetelnMe) LⅧ一c G1u—c Alp—c · c 胰艇乳置酵(chyme． tin) 噜彝ll菌置白酵(thermo in) ,~ 111B e pn~ease 肽链在 Glu一后断开 I—Tyr— g— P】1e· 一Glu— u一为主 Lv|一 Glu· Asp— Ar县- Phe—br一 一 u一为主． Met—Asn·Gln—Thr一和 His．处也柏裂解 所有疏水残基(如Va1．L肌．Met，P1le)左彻 Arg— 维普资讯 http://www.cqvip.com 有 机 化 学 1999拒 ● 5 结柬语 目前人们对含多个二硫键的小分子肽的合成依然停留在产率较低水平上。对于天然序列的肽 而言 ，虽然存在一个分子生物学的中心原理：顺序规定构象，但人为的折叠环境往往不理想，从而出 现二硫键错配的多种异构体。现代光谱技术手段，如停流 cD，X—Ray，2D NMR能对蛋 白质及多肽 的折叠过程中间体构象的变化给予明确的，发现在蛋白质折叠过程中多个二硫键的形成不是 同时性的，而是存在一个先后次序和非天然中间体的且有热力学和动力学控制的步骤，为富含多个 二硫键的多肽合成提供了重要指针。 26 27 28 29 30 Bodam kyM．“Peptide ChemistryA Practical Text Book”，2rid，Revised FAn．1993，P．90 I~iskey R G．“ Pep~ides”，Gross E andMeienhofer J(Ed8)，Ⅷ ．3，Academic Plres~l，Orl~do，Florida，l98l，P．137 Stewart JM，Yoong J D “岛 PhasePeptide ”，2nd Edn，PierceChemicalCompany，Rockford，Ilinois，1984， P．26 Pen S Q．“Duota／Yaowu Huaxue”，Sciences Pre~s，Beijing，1993，P．76 Huang w D，Chen C Q．“Dural Hechen”，Sciences Press，I~eijing，1985，P．77 Fujii N，Otaka 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synthesis，disulfide bond formation，oxidative folding，enz~ olysis，disulfide mapping (Ed．ShenH) 撕 卯 弛 鲫 如 舵 们 “ 拍 们 维普资讯 http://www.cqvip.com