细胞膜蛋白提取方法

细胞膜蛋白提取 两种提取红细胞膜蛋白方法的比较 在制备抗血型抗原单克隆抗体时，为了提高红细胞血型抗原的免疫效果，获得更多的阳性克隆，我们比较了两种提取红细胞膜蛋白的方法。 1 材料和方法 1.1 低渗溶血法粗提红细胞膜蛋白 1.1.1 方法一 略有改良 取25 ml A(或B ) 型抗凝混合血加0.01 mol/L PBS ( pH7.4)，离心3000 r/min，20 min，弃上清和上清下的白细胞、血小板层。用相当于红细胞压积3倍的预冷PBS(pH7.4)洗涤3次(4? 5 000 r/min,15 min)。加预冷的0.01 mol/L Tric-HCl(pH7.4)与红细胞(V?V=40?1)混合，4?放置2 h。再以9 000 r/min 离心20 min，弃上清(重复3~5次)至无肉眼可见的红细胞为止。沉淀物加0.01 mol/L PBS(pH7.4)置-20?保存。 1.1.2 方法二 略有改进 4 ml A(或B)型血加40 ml NS,离心2 000 r/min,20 min,洗3次。沉淀物加入40 ml预冷蒸馏水，离心5 000 r/min,10 min，洗4次。因沉淀物中仍有少量红细胞，故加40 ml 0.01 N冰醋酸，置4? 2 h后离心9 000 r/min，15 min。沉淀物加4 ml NS混匀后，再加0.2 ml 0.1 N NaOH，室温30 min,离心转速同上，弃上清后 加4 ml NS,用0.1 N HCl(约0.1 ml)调pH至7.4。紫外分光光度计测蛋白含量。 1.2 红细胞膜抗原的活性测定 1.2.1 血凝抑制试验 将提取的A(或B)型红细胞膜蛋白倍比稀释，分别加相应抗体(原液~1?128倍比稀释)，震摇后置室温1 h，再加入2%A或B型红细胞，水平振荡20 min,室温静置1 h观察结果。另用A或B型红细胞代替A或B型红细胞膜蛋白作为对照。能使加入的2%红细胞不出现凝集所需膜抗原的量作为膜抗原的血凝抑制效价。 601.2.2 Co照射对膜蛋白抗原活性的影响 将提取的红细胞膜蛋白用15 000 rad照射后，倍比稀释成不同浓度，用1?8 [3]的A或B型血型抗体做血凝抑制试验。 1.2.3 膜蛋白抗原免疫效果观察 将分别以10%红细胞和A、B型膜蛋白抗原免疫BALB/c小鼠(4次)所获血清，分别与2%A(或B)红细胞作血凝试验测定血型抗体效价。 2 结果和讨论 2.1 红细胞膜蛋白量的测定 用两种方法提取的红细胞膜蛋白中镜下观察均无完整红细胞。所获蛋白量以100 ml容积 的细胞计算，方法一和方法二提取的A型膜蛋白量分别为120~160 mg和50 mg,B型膜蛋白量分别为260 mg和68 mg。 2.2 膜蛋白抗原的活性测定 以能完全抑制相应抗体(原液)与红细胞产生凝集反应所需膜蛋白量来判定。方法一提取的膜蛋白A型为7.5~15 mg/ml，B型为13.6 mg/ml;方法二提取的膜蛋白A型为7.5~15 mg/ml,B型为11.6 mg/ml。 602.3 Co照射后对膜蛋白抗原活性的影响 将所提膜蛋白抗原于照射前后做血凝抑制试验，结果是:方法一提取的膜蛋白抗原，A型照射前后分别为0.26 mg/ml和0.13~0.26 mg/ml;B 型分别为0.11 mg/ml和0.26 mg/ml;方法二提取的膜蛋白抗原，A型照射前后分别为0.24 mg/ml和0.47 mg/ml;B型分别为0.1 mg/ml和0.34 mg/ml。 2.4 完整红细胞与膜蛋白抗原的免疫效果 以10%红细胞免疫BALB/c小鼠产生的抗体效价A型为1?80~1?512,B型1?80~1?512。A型膜蛋白抗原免疫BALB/c小鼠产生的抗体效价为1?512~1?1024,B型为1?256~1?1024。用A型红细胞和A型膜蛋白抗原免疫BALB/c小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，所获杂交瘤细胞的阳性率分别是0.7%和11.5%。 本文采用两种低渗溶血法提取的红细胞膜蛋白抗原量有所不同，方法一高于方法二。但两种方法所获膜蛋白抗原都具有血凝抑制活性。因免疫动物所需抗原必须无菌，故对提取 60的膜蛋白抗原进行了Co照射。照射后对A型膜蛋白抗原活性的影响不大，但可使B型膜蛋白抗原的活性下降2~3倍。更为重要的是，以照射后的膜蛋白抗原作为免疫原可使融合阳性率较完整红细胞作免疫原提高15倍。因此认为本文提取的红细胞膜蛋白抗原不仅简便易行，而且有实际应用价值，尤其是方法一。 分离膜蛋白的方法有两种:1先分离膜，然后提取;2用特殊的去污剂选择性的分离。第二 种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。 原理:4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相 和去污相;此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。 1)放射性标记受试细胞 2)将标记的细胞放在冰上 3)去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次 4)加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min 5)刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心 6)溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min 7)收集水相留作分析 8)用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心 9)按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积 10)用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验 试剂: 1)2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl(pH7。5)、蛋白酶抑制剂 2)缓冲液A(含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer) 3)buffer C 10mmol/L Tris HCl(pH7.5) 150mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA(PH7.5) 红细胞膜的制备及其成份分析(磷脂、胆固醇) 一、红细胞膜的制备 (一)原理 随着生物膜研究的迅速发展，在膜的结构及功能的研究中分离和鉴定生物膜常常是必要的。为进行膜结构的生物化学分析，必须首先分离出纯净的细胞膜。 哺乳动物的红细胞膜在分离状态下。一般称为”血影”，其没有通常真核生物细胞内所含有的任何细胞器，经过制备，容易得到纯粹的细胞膜，并且在取材方面来源方便，因此哺乳动物的红细胞膜是研究细胞膜的好材料。 从哺乳动物红细胞中分离细胞质膜，第一步，将血液取放在加有抗凝剂的容器内，用低速离心的方法从血液中分离出红细胞，然后用等渗缓冲液重复洗涤多次，去除血浆。第二步，将洗净的红细胞从等渗缓冲液转移到低渗缓冲液中，由于渗透压力作用于细胞质膜，使红细胞膨胀而溶血。最后一步，将溶血的红细胞经过充分反复洗涤(高速离心，去除血红蛋白和其他细胞内含物。这样制备所获得的最终产品几乎全是红细胞膜。 (二)仪器、试验材料和试剂 仪器 冷冻离心机、冰箱、自动移液管、相差显微镜、冷冻干燥机等。 原料 哺乳动物的血液 试剂 1. pH7.4等渗磷酸盐缓冲液(含有0.15mol/L 氯化钠的5mL，pH7.4磷酸盐缓冲液): 贮液A:称取0.7808磷酸二氢钠溶于水，定容至1000mL; 贮液B:称取3.5828磷酸氢二钠溶于水，定容至2000mL; 取380mL 贮液A 加1620mL 贮液B，用少量浓盐酸调PH 至7.4(再称取17.5g 氯化钠加入其中。 2. pH7.4低渗tris 缓冲液(10mmol/LpH 7.4Tris-盐酸缓冲液): 贮液A:称取2.42gTis，溶于水，稀释至500mL; 贮液B:取0.84mL36,一38,盐酸，稀释至100mL; 取500mL 贮液A 加414mL 贮液B，用水稀释至近于2000mL，用6mol/L 盐酸调pH7.4，再定容到2000mL。 3. 肝素,PH7.4等渗磷酸盐缓冲液: 将肝素溶于PH7.4低渗Tris 缓冲液中，使每毫升含肝素500单位。 (三)操作步骤 1.血液的收集及洗涤 将血液收集在含有抗凝剂的容器中，每30mL 血液加约5mL 肝素,pH7.4等渗磷酸盐缓冲溶液。 为避免膜上含有的或膜上吸附的蛋白酶使膜蛋白发生变化，以下操作应在,4?低温下进行。取30mL血液，于冷冻离心机(4?)中3000r/min 离心20min，使红细胞沉淀，用吸管吸尽血浆及沉淀的红细胞表层的绒毛状沉淀层，以避免其他类型细胞的混入。 将红细胞置于3倍量预冷的pH7.4等渗磷酸盐缓冲液中，用玻璃棒缓慢地搅拌悬浮，4?5000r/min离心15min，除去上清液及沉淀表层，重复洗涤3次。 2.溶血和红细胞膜的洗涤 在洗净的红细胞中，按照1:40的比例加入预冷的10mmol/LpH7.4低渗Tris(三羟甲基氨基甲烷),HCl 缓冲液，边加边缓慢搅拌，置于4?冰箱中1,2h，使之完成溶血。然后于4?9000r/min 离心15min，使红细胞膜沉淀。重复洗涤、离心3,5次，最后获得白色的红细胞膜样品。 注意:?溶血时低渗缓冲液的用量越大，红细胞膜中血红蛋白的残留量越少，但体积大，离心费时间。因此，红细胞与缓冲液的容量比例，以1:40为宜。?膜的重量很轻，在溶血后离心倾倒上清液时容易流走，因此要特别小心，尽可能防止膜的损失。?在制备过程中，若pH 值降低，残留的血 红蛋白会迅速增加。当pH 保持在7.4时，红细胞膜中的血红蛋白含量仅占总蛋白量的3~5,，相当于血液中总血红蛋白的0.1,。但pH 值降低至7.0时，血红蛋白增加至20,。?上述方法适用于大白鼠和人红细胞膜的分离。牛、猪等红细胞膜的制备，若反复进行低渗处理，将造成膜外表面包含具有乙酰胆碱酯酶活性的酯蛋白脱落，使膜容易破碎，得不到较完整的膜样品。若在低渗缓冲液中加入1mmoL氯化钙，即可完全防止这种膜的不稳定性。 将最后一次离心所得到的红细胞膜悬浮在2,4mLpH7.4等渗磷酸盐缓冲液中。悬浮液的总体积。注意，有时在膜的下面有少许未解体的红细胞残留物，不要将这部分残留物悬浮在缓冲液中。 3.细胞膜的镜检 取少量膜样品悬液，在相差显微镜下进行观察，确定膜制品是否纯净。在视野中纯净的膜为扁圆形，白色，膜表面赂有皱纹。在视野中应不含有完整的红细胞或污染的细菌。 4.膜的冷冻干燥 样品放在一个称好重量的(在分析天平上准确称量)小称量瓶中，冷冻干燥至样品全干(冰冻干燥可以过夜，冷冻干燥的样品更易溶于SDS 溶液中)，称量带有冷冻干燥制品的小称量瓶，记录膜的产量。 将冷冻干燥的膜制品，置于干燥器中保存，以备膜结构成分 的分析。 二、膜磷脂的分析(薄层层析法) (一)原理 膜中脂类的主要组分是磷脂和胆固醇。本实验用甲醇—氯仿可将膜中的脂类组分提取出来，同时破坏疏水作用、使膜蛋白变性，再采用薄层层析法进行磷脂的定性分析及定量测定。 (二)仪器和试剂 仪器 具塞试管、普通离心机、15cm×15cm 玻璃板、薄层层析展层缸、定磷用的全套器材。 试剂 1. 硅胶H—碱式碳酸镁混合物:称取97g 硅胶H，3g 碱式碳酸镁，置研钵中研磨，并混合均匀。 硅胶H—碱性硅酸镁混合物:称取98g 硅胶H，2g 碱性硅酸镁，置研钵中研磨，并混合均匀。 2. 磷脂样品混合液:称取磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，神经鞘磷脂和卵磷脂等各5mg，溶于l0mL 氯仿:甲醇(1:1，V/V)中。 3. 氯仿 4. 甲醇 5. 乙酸 6. 氨水 7. 碘 8. 高氯酸 9. 定磷试剂 (三)操作步骤 1.膜脂的提取 将冰凉干燥的膜制品总重量的一半悬浮于0.8mL 等渗的磷酸盐缓冲液中(膜不会完全溶解)，加3mL 氯仿:甲醇(1:2，v/v)，盖上试管塞，剧烈振荡最少1min，另外再加1mL 氯仿振荡1min，最后加1mL 水振荡1min。用台式离心机低速离心5min，在离心管里分相，缓缓地吸去上相，用细滴管穿过两相界面处变性蛋白的薄层，吸出下相液(膜脂类在下相液中)，转移到一个小烧杯内，置真空干燥器内蒸发至干。 2.磷脂的分析 (1)硅胶板的规格及制作方法 准备几块15cm×15cm 的玻璃板，洗净，烘干或滴上几滴乙醇，用清洁的纱布擦干。 取3g 硅胶H—碱式碳酸镁混合物或硅胶H—碱性硅酸镁混 pH7.0羧甲基纤维素溶合物，置小研钵中。加14mL0.5, 液，研磨数分钟，将研磨好的浆液倒在一块备好的玻璃板上。用玻棒将其铺开，然后轻轻颠动玻璃板，使浆液均匀分布。 置于水平台面上，使其自然干燥，然后放在110?烘箱内活化30min，贮于真空干燥器内用。 (2)点样 用200mL 氯仿—甲醇(1:1，v/v)溶解2mg 干燥的脂类。取100μL 溶解的样品溶液，点在薄层板的一个角上距板的边缘约2mm 处，点样的面积直径不超过5mm，点样一次待样品干燥后再点，重复数次。 另取一块薄层板，依同样位置点上磷脂的标准样品混合液(内含每种标准磷脂各20~50μg). (3)展层 采用倾斜上行法展层。展层缸内用新配制的溶剂系统平衡，进行双相层析(即在第一相展层后，将薄层板取出，调转90度。，再进第二相展层)。 第一相溶剂系统:氯仿:甲醉;氨水(25,):水,90 : 54 : 5.5 : 5.5(体积比); 第二相溶剂系统 : 氯仿 : 甲酵 : 乙酸 : 水,9 : 40 : 12 : 2(体积比); 每相层析约需2h，当溶剂前沿距板的顶端2~3cm 时，取出薄层板，用铅笔画出溶剂前沿位置。第一相展层后，取出，在空气中干燥约15min，若空气湿度太大时，则须在放有浓硫酸的干燥器内干燥半小时。 玻璃板(20cm×20cm)涂上硅胶H.R 含有2w1%硫酸镁。 脂类的混合物点在右底角(距边缘3cm 处)。展层，第一相溶剂系统氯仿: 甲醇:氨水(25%):水(90:54:5.5:5.5，体积比)，第二相溶剂系统氯仿:甲醇:乙酸:水(90:40:12:2，体积比)。缩写CHOL=胆固醇，FFA=游离脂肪酸，CL=心磷脂，PA=磷脂酸，PE=磷脂酰乙醇胺，PI=磷脂酰肌醇，PS=磷脂酰丝氨酸，PC=卵磷脂，SPH=鞘磷脂，LPE=溶血磷脂酰乙醇胺，LPC=溶血卵磷脂，LPS=谱溶血磷脂酰丝氨酸，DPI=磷脂酰二磷酸肌醇。 (4)显色及定位 将干燥后的薄层板放入碘缸内，盖好。升华的碘遇磷脂后，发生加成反应，而使磷脂的斑点呈现黄色或棕黄色。 斑点显现后，参考磷脂标准样品的相对位置及Rf 值，鉴别红细胞膜中含有磷脂种类。 将磷脂的斑点分别从薄层板上刮下来(转移到试管中，每个样品加1mL70,高氯酸，在190?消化，然后测定磷含量(定磷方法)。在测光吸收之前，应离心除去硅胶。经测定后，从定磷的标准曲线计算出每个磷脂斑点中磷含量，可推算出每种磷脂在膜中含量。 三、膜胆固醇的测定 (一)原理 胆固醇(胆甾醇)与铁矾显色剂相互作用可生成紫色的胆固醇 —铁复合物，其颜色的生成在一定范围内符合Beer 定律，在波长560nm 处有最大光吸收。反应过程中，浓硫酸与冰乙酸相混合时产生的热可为颜色的生成提供合适的条件。 本实验中所选用的试剂也可用于测定血清总胆固醇的含量。其中乙酸铁—乙酸铀试剂不仅起蛋白质沉淀剂的作用，同时又可以克服色原(主要是脂类和胆红素)的干扰。 (二)仪器和试剂 仪器 721型分光光度计、台式离心机。 试剂 1.胆固醇标准溶液:精确称取200mg 胆固醇，溶于冰乙酸中，稀释到100mL，使浓度为2mg/mL。 2.铁矾显色剂 (1)储备液:溶解4.463g 硫酸铵铁(FeNH4SO4? 12H2O) 到100mL85,磷酸液内，贮存于干燥器内， 此溶液在室温下很稳定。 (2)常备液:吸取10mL 储备液，用98,的浓硫酸稀释到100mL，贮于干燥器内，以防吸水。此溶液至少可稳定2个月。 3.乙酸铁—乙酸铀试剂 称取0.5g 三氯化铁(FeCl2?6H2O)，置小烧杯中，加入3mL 浓氨水，搅拌均匀，产生红棕色氢氢化铁沉淀，过滤。 用蒸馏水洗至无氨味，取下沉淀，溶于冰乙酸中。再加入0.1g 乙酸铀[UO2(C2H3O2)2]，用冰乙酸稀释到100mL，振摇后避光放置过夜，次日再振摇，贮于棕色瓶内。 (三)操作步骤 1.胆固醇标准曲线的制定吸取2mg/mL 胆固醇常备液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL(相当于胆固醇的量为0、40、80、120、160、200μg)分别置于干燥的试管内，再分别加入0.1、0.08、0.06、0.04、0.02、0.00mL 冰乙酸(使每管中液体总体积达到0.10mL。每管内加入5mL 乙酸铁铀试剂，摇匀。然后从每管各吸取3mL 混合 液，分别移入另一套干燥试管中，沿管壁加入2mL 铁矾常备显色液(用手指弹动管的底部，使其彻底混匀，在15,90min 内，于560nm 波长处测定A 值。为得到准确的数据，应将标准曲线上的各点做2~3个重复。以胆固醇的含量为横坐标，A 值为纵坐标，绘出标准曲线。 2.膜脂类胆固醇含量的测定 称取2~5mg 干燥的膜脂类(尽可能精确的称量)，用冰乙酸充分溶解，制得0.5mg/mL 溶液。取1支试管，加50μL 样品溶液，再加入50μL 冰乙酸，及5mL 乙酸铁铀试剂，充分摇匀，如有沉淀，于2500r/min 离心15min。吸取3mL 试管，沿管壁加入2mL 铁矾常备显色液，上清液，移入另— 用手指弹动管的底部，使其彻底混匀，放置30min 后，于 560nm 波长处测A 值。在进行样品测定时，要同时做空白对照，即以50μL 冰乙酸代替样品溶液，其余操作同上。为得到准确的数据，测定样品时，须同时做二、三支重复测定管。 生物色谱中药活性筛选的新途径 生物色谱法(Biochromatography)是20世纪80年代中后期问世，由生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术。它利用药物产生效应(或毒性)一般是通过药物与靶点即生物大分子包括受体、通道、酶等结合的原理，应用于药物活性成分的筛选、药物作用机理的研究。它使效应成分的分离与筛选结合在一起，进而探讨药物的作用机理，是化学成分,效应,作用机理联动的一种药物研究方法，尤其适合于天然药物效应物质基础的研究，其独特的优点为其展示了光明的发展前景。 现代生命科学已阐明了细胞、细胞膜的结构组成，并逐步了解了酶、受体、抗体、传输蛋白、DNA、肝微粒体等在生命活动中所起的重要生理作用。若将这些活性生物大分子、活性细胞膜、甚至活细胞作为配体固着于色谱担体上，制成一种生物活性填料，用于现代色谱分析技术，形成一种能够模仿药物与生物大分子、靶体或细胞相互作用的色谱系统，这样药物与生物大分子、靶体间的相互作用就能用色谱 中的各种技术参数定量表征，我们就可以方便地研究药物与生物大分子、靶体或细胞间的特异性、立体选择性等相互作用，筛选活性成分，揭示药物的吸收、分布、活性、毒副作用、构效关系、生物转化、代谢等机理，探讨药物间的竞争、协同、拮抗等相互作用。 因此，建立中药生物色谱技术，可以模拟生理或病理状态下药物在体内进行生物活性表达的一些关键步骤，将中药或中药复方中的效应物质进行分离，能使效应成分的分离与筛选结合在一起，克服了以往先从中药中分离有效部位或单体，再分析其药效，从而使成分分离与效应筛选脱节的弊端;对已知结构的化合物进行中药效应成分及作用靶点分析，加强中药效应物质基础、作用机理的研究。由于该技术能较快的提供中药的效应物质基础，并通过制备型HPLC制备相当数量的纯品，就有可能针对性地提取工艺，以尽可能多地富集效应成分;了解了效应物质基础，就有可能针对效应物质制定质量标准，也就可能针对效应物质的理化特征，研究其制剂形式，以保证药品的安全、有效、可控、稳定、均匀，实现中药研究的现代化。 本研究首先采用红细胞膜材料包被硅胶载体作为固定相，然后将此固定相装柱，经过最适条件考核后在线检测当归水提液的乙酸乙酯部位、正丁醇部位和剩余水提液在红细胞膜包被的硅胶载体固定相色谱柱上的色谱行为，发现当归 水提液的乙酸乙酯部位在此色谱柱上有多组分保留，采用HPLC/MS联用技术鉴定被保留成分是分子量为190，192，194，206，224，226，242，278，380，382amu的10个化合物，是为红细胞膜包裹硅胶生物柱色谱法。这一方法同时存在的缺点是难以既考虑红细胞膜所需要的温度、压力、离子强度及溶液pH等要求，又顾及色谱分析所需要的压力、流动相及无机盐离子等条件，难以达到既使生物材料选择性结合中药效应成分又让色谱分离效应成分发挥最佳状态。 为了解决红细胞膜包裹硅胶生物柱色谱法的研究过程中存在的问题，第二阶段研究以红细胞直接与中药提取液孵育后，洗去未结合的成分，接着用低pH缓冲液使红细胞靶点失活，得到与靶点结合的效应成分，再对得到的效应成分进行色谱分析。此法获得初步成功;实验过程中也发现由于红细胞释放微量的细胞内容物，有一定的干扰作用。 第三阶段研究改用分离红细胞膜作为生物固相材料，建立红细胞膜固相色谱法。本方法主要工作分四步进行，第一步先对拟分析药材的指纹图谱进行研究，作为下一步红细胞膜固相色谱研究的基础。第二步是在模拟机体内环境的条件下，首先让红细胞膜与药材提取液中的有效成分进行特异性结合，然后用缓冲溶液洗去未被红细胞膜特异性结合的其它成分，红细胞膜保留的成分即是与红细胞膜靶点特异性结合的成分，这样就得到了对红细胞靶点有激活或抑制作用的成 分。接着用低pH缓冲溶液将与靶点特异性结合的成分从红细胞膜上洗脱下来，以HPLC进行色谱分析，得到特征性的谱图。第三步研究与红细胞膜靶点特异性结合成分的色谱特征，与药材提取液的指纹图谱对照，确定特征峰在指纹图谱中的位置，并以此特征图谱作为指征，利用制备型高效液相色谱仪制备出纯品，用HPLC-MS和NMR技术进行分子量与结构分析，最后确定与红细胞膜靶点特异性结合的成分。第四步进行药理活性分析。