实验六:血清谷丙转氨酶活力测定
200906034010 唐丹 200906034021 郭力
血清谷丙转氨酶活力测定
实验
1、学习测定谷丙转氨酶活性的原理。2、掌握分光光度法定量测定技术。
实验
转氨酶又叫氨基转氨酶,它催化转氨基反应。转氨酶在氨基酸的分解、合成及三大物质的相互联系、相互转化上起很重要的作用。转氨酶种类很多,在动物的心、脑、肾、肝细胞中含量很高,在植物和微生物中分布也很广,其中以谷丙转氨酶,GPT,和谷草转氨酶,GOT,活力最强,GPT在肝细胞中含量最丰富,它催化a-酮戊二酸和L-丙氨酸反应生成L-谷氨酸和丙氨酸。正常人的血清GPT含量很少,活性很低,但当肝细胞受损时,如肝炎等病变,,酶从肝细胞释放到血液中,使血清中的GPT活性显著增高。测定GPT是临床上检查肝功能是否正常的重要指标之一。
GPT作用于L-丙氨酸和a-酮戊二酸后生成的一种产物——丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙。2,4-二硝基苯腙在碱性条件下呈棕红色,其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比,可用分光光度法进行丙酮酸定量测定。因此在一定的条件下,可进行GPT活力的测定并计算出血清中GPT的活力单位数。
实验试剂
1
试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、坐标纸、新鲜人血清或兔血清。
2、试剂
(1)0.1mol/L磷酸缓冲液,pH7.4,
称取Na2HPO4.2H2O 2.8844g(或Na2HPO4.12H2O 5.8028g)和NaH2PO4.H2O 0.5244g(或NaH2PO4.2H2O 0.5930g),溶于200ml蒸馏水。
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(2)2μmol/L丙酮酸钠标准液
取酮酸钠22mg,溶于100ml 0.1mol/L磷酸缓冲液,pH7.4,中。
(3)GPT底物液
称取a-酮戊二酸29.2mg和L-丙氨酸0.891g(或D, L-丙氨酸1.782g),溶于适量的0.1mol/L磷酸缓冲液中,用1mol/LNaoH调至pH为7.4,再以0.1mol/L磷酸缓冲液,pH7.4,定溶至100ml,冰箱中保存。
(4)2,4–二硝基苯肼液
取2,4–二硝基苯肼19.8mg,加入到7 ml浓盐酸中不断摇动,待溶解后加蒸馏水定溶至100ml,棕色瓶保存。
(5)0.4mol/L NaOH溶液
操作步骤
1、标准曲线制作
(1).取试管6支,标号,进行操作。
试剂/试管0 1 2 3 4 5 编号
V(0.1mol/L0.10 0.10 O.10 0.10 0.10 0.10 磷酸缓冲
液)ml
V(GPT0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 底物液)/ml
V(丙酮0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 酸钠标准
液)/ml
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相当于丙酮0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 酸实际含量
/μmol
(2)混匀后,置37?水浴预温5分钟,再分别加入2,4–二硝基苯肼液0.5ml,混匀,保温20分钟,各加入0.4mol/L NaOH 5ml,混匀继续保温10分钟,取出,冷至室温。
(3)以0号管为对照,在520nm波长下用分光光度计测定各管的吸光度(A520)。
(4)以丙酮酸的实际含量(μmol)为横坐标,各管的吸光度(A520)为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线。
2.血清GPT活力的测定。
(1)取试管两支,标明测定管和空白管,各加入GPT基质液0.5ml,37?水浴保温5分钟。
(2)向测定管中加入血清0.1ml,混匀后立即计时,继续在37?水浴中保温30分钟。
(3)至30分钟后,向测定管和空白管各加入2,4–二硝基苯肼液0.5ml,混匀,向空白管补加0.1ml的血清。
(4)2支试管各加入0.4mol/L NaOH 5ml,混匀,保温10分钟后,取出,冷至室温
(5)以空白管为对照,读取520nm波长下测定的吸光值A520。
(6)在标准曲线上查出丙酮酸的μmol数,并换算出丙酮酸的μg数。
(7)血清GPT活力计算:本方法规定在37?,PH为7.4时,血清中的GPT与GPT底物液作用30分钟每生成2.5μg丙酮酸的酶量为1个酶活力单位(U)。据此计算每1ml血清中GPT的活力单位数。
要点提示
1、 制作标准曲线时,需加入一定量的GPT底物液(内含a-酮戊二酸),以抵消由
于a-酮戊二酸与2,4–二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙的消光影响。
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2、 当酶浓度较低时,测定值与空白值相差很小,准确性较差。 3、 为防止测定中造成的误差,少量液体的加入最好用准确度很高的可调移液器代
替移液吸管。
4、 实验用人血清的制取。
供血者早晨空腹,由专业医务人员抽取血液5-7ml,放在干燥洁净的试管中,于30-35?的恒温箱中自然血凝,3-5h即得血清。
5、一般正常人1ml血清中GPT的活力单位测定值小于40U。