微生物资源开发与利用实验指导

微生物资源开发与利用实验指导 微生物资源开发与利用 实验指导 适用于森林资源保护与游憩专业 北京林业大学森林保护学科 二零零二年8月 1 实验一 培养基的配制及灭菌 培养基是人工配制的适于微生物生长、繁殖或保存的营养基质。培养基的种类繁多，但一般应具备以下几个条件:1.含有适宜的碳源、氮源、无机盐类、生长因素等营养成分;2.含有适量的水分;3.适宜的酸碱度。 根据培养基的成分来源不同可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基。环境微生物学中，常用废水或废水补加少量氮、磷等无机盐来培养微生物，可认为是天然培养基或半合成培养基。 根据培养基的物理性状可分为液体、固体和半固体培养基。液体培养基中加一定量的凝固剂(常加琼脂1.5—2%)。溶化冷凝后即成固体培养基。半固体培养基含琼脂0.2—0.5%。某些工农业生产废渣及生活废渣可视为天然的固体培养基。 根据培养基的特殊用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。选择培养基在环境微生物学中应用较广，它是根据待培养微生物的特殊营养要求或生物特征而设计的培养基，利用这种培养基可将所需要的微生物从环境混杂的微生物中分离出来。如以石油作碳源的培养基可以分离到降解石油的微生物;以纤维素为唯一碳源的培养基可以分离到纤维素分离菌。 本实验介绍培养基配制及灭菌的一般原则和方法步骤。 一、 培养基配制的方法和步骤 1.称量:先按计算培养基各成分的需要量，称量时用1/100粗天平即可。在烧杯或搪瓷杯中先放少量水，依次加入培养基各组分，溶解后补足至所需的总水量。对于肉膏之类粘、胶状物，可盛在小烧杯或表面皿内称量，以便用水移入培养基中。蛋白胨等极易吸潮物质，在盛取时应动作迅速。某些无机盐类如磷酸盐和镁盐相混合时易产生沉淀，必要时应分别灭菌后再混合。此外，生长因素及微量元素等成分因用量极少，可预先配成较浓的储备液，使用时按要求取一定量加入培养液中即可。 2.溶化:各成分必须溶解在培养液中。最好溶解一种组分后，再加第二种，有时需要加热使其溶解。如果配方中有淀粉，则应先将其用少量冷水调成糊状，再兑入其他已溶解的成分中，边加热边搅拌，至完全融化即溶液由混浊转为清亮后，补水至所需总量。 溶化琼脂时，应注意控制火力使不至溢出或烧焦，并要不断搅拌。因加热过程中水分损耗较多，最后应补足至原体积。 根据需要，有时需将溶化后的培养基用脱脂棉或纱布过滤，已使培养基清亮透明。 3.调pH值:以10% HCI或10% NaOH调节培养基至所需pH值。一般用广泛pH试纸矫正，必要时亦可用酸度计。调时需注意逐步滴加，勿使过酸或过碱而破坏培养基中某些组分。 2 4.分装:将矫正pH后的培养基按需要趁热分装于三角瓶或试管内，以免琼脂冷凝。分装时应注意勿使培养基粘附于管口与瓶口部位，以免沾染棉塞而滋生杂菌或影响接种操作。可以通过下边套有橡皮管及管夹的普通漏斗进行分装。 分装量视需要而定。一般分装入三角瓶以不超过其容积的一半为宜。分装试管时，斜面培养基以试管高度的1/5左右为宜，半固体培养基以试管高度的1/3左右为宜。 5.加棉塞:试管和三角瓶口需用棉花堵塞，主要目的是过滤除菌，避免污染。 做棉塞所用的棉花应是普通长纤维棉花，不要用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水变湿而滋长杂菌。棉塞制作方法有多种，主要的要求是不宜过松或过紧，应宜塞拔方便而又不易脱落为准。正确的棉塞其头部应较大，约有1/3在试管外，2/3在试管内(示范)，试管以内部分不应有缝隙。 6.灭菌:在装培养基的三角瓶或试管的棉塞外面包一层牛皮纸，即可灭菌。应用铅笔注明培养基名称、配制日期等。 如制斜面培养基时，灭菌后趁热将试管斜放(示范)，注意勿使培养基沾染棉塞。 如制平板培养基时，灭菌后待培养基温度降至50?左右时以无菌操作将培养基倒入无菌培养皿内，每皿约15-20ml，平放冷凝即成平板培养基，简称平板。 若制半固体深层培养基，灭菌后垂直放置，冷凝即成。 二、灭菌与消毒 灭菌指杀死或消灭所有微生物体。消毒则是指破坏或消灭病原微生物，只能杀死微生物的营养细胞，而不能杀死全部芽孢。 灭菌与消毒的方法很多，可概分为物理和化学的两类。如湿热灭菌、间歇灭菌、煮沸消毒、干热灭菌、紫外线灭菌和化学灭菌与消毒等。实验室常用的方法介绍如下。 高压蒸汽灭菌:高压蒸汽灭菌是一种湿热灭菌法。在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固;同时，湿热的穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触冷凝成水时，又可放出热量，使温度迅速升高，从而增加灭菌效力;另一方面，随着压力增高，达到饱和蒸汽时所具有的温度也高。这样，高压蒸汽灭菌时微生物体受热、湿及压力的作用而被杀死。 由于高压蒸汽灭菌具有灭菌效果好，适用面广的特点，因此，是实验室最常用的消毒灭菌方法。适于消毒在高温高压下不易分解变压的培养基。将配制好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅中，使其压力增至15磅后/吋?(相当于121?)。维持半小时。即可达到灭菌目的。 高压蒸汽灭菌器分为立式，卧式及手提式等几种。但原理都是相同的，使用时必须注意以下几点: 1.使用前必须首先注意将器内加入足够的水。 3 2.将需要灭菌的器物放在灭菌器中，将盖密闭，打开气门。 3.加热，待器内冷空气完全排除后(蒸汽从气门有力地冲出)，才可关闭气门， 因为空气本身有压力，如不完全赶出，则压力表上所指示的压力便不准确，达不到 灭菌要求。 4.当压力上升到所需要的指标后，开始计算时间，灭菌过程中保持压力不变。 5.达到需要灭菌时间后，停止加热，使器内压力自然下降，如欲使压力下将快 些，可将气门稍稍打开，使蒸汽徐徐放出(愈慢愈好)，切勿将气门立即全部打开 放气，不然因器内压力骤然降低，引起瓶内和管内的培养基沸腾外溢，沾污棉塞， 不但增加以后操作的困难，而且培养基也易污染。 6.当内外压力相等(压力表指针降到0时)，才能打开高压蒸汽灭菌器的盖。 7.千万注意，加热时必须有专人看管，不可疏忽，勿使压力过大。超出允许范 围，以免发生危险。 三、几种常用培养基配方及制作法 1.牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 蒸馏水 1000ml pH7.2—7.4，121?高压蒸汽灭菌20分钟。 2.高氏一号培养基 可溶性淀粉 20g KNO 1g 3 NaCl 0.5g KHPO 0.5g 24 MgSO?7HO 0.5g 42 FeSO 0.01g 4 琼脂 15—20g 蒸馏水 1000ml 自然pH7.2-7.4,121?高压蒸汽灭菌20分钟。 3.查氏培养基 NaNO 2g 3 KHPO 1g 24 KCL 0.5g MgSO?7HO 0.5g 42 FeSO 0.01g 4 4 蔗糖 30g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml 自然pH,121?高压蒸汽灭菌20分钟。 4.马丁氏培养基 葡萄糖 10g 蛋白胨 5g KHPO 1g 24 MgSO?7HO 0.5g 42 琼脂 15—20g 蒸馏水 1000ml 自然pH，115?高压蒸汽灭菌20分钟。 5.马铃薯培养基 马铃薯 200g 蔗糖或葡萄糖 20g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml 新鲜马铃薯去皮，切成薄片，称200g,加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱 布过滤，补足因蒸发而减少的水量，即制成20%马铃薯汁. 在马铃薯汁中加入琼脂, 煮沸溶化，加糖搅匀，补足水分，115?高压蒸汽 灭菌20分钟。 自然pH,加入蔗糖，用于培养霉菌;加入葡萄糖，用于培养酵母菌。 将pH调至7.2-7.4，加入葡萄糖，用于培养放线菌及芽孢杆菌。 四、实验报告和思考题 1. 将琼脂培养基分装试管时应如何操作及其。 2. 高压蒸汽灭菌时应注意什么问题,为什么, 五、参考 王家玲 环境微生物学实验 高等教育出版社 实验二 显微镜的使用、微生物的大小的测定 显微镜的种类很多，一般可分为光学显微镜与非光学显微镜两大类。光学显微 镜按其性能不同又可分为明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、紫外光显微 镜、偏光显微镜和荧光显微镜等。非光学显微镜为电子显微镜。本实验学习明视野 显微镜的使用方法，重点介绍油镜物镜的基本原理与操作步骤。 一、 显微镜的使用 5 1. 光学显微镜的一般构造 光学显微镜的结构分为光学和机械两大部分。光学部分包括接物镜、接目镜、聚光器、虹彩光圈及反光镜;机械部分包括镜头转换器、粗调节器、细调节器、载物台(镜台)、镜筒、镜臂和镜座等。 接物镜:接物镜在成像中起最重要的作用。普通光学显微镜的接物镜有高倍镜、低倍镜及油镜三种。接物镜上刻有放大率如10×，45×，100×等符号。油镜头上刻有“OI”“HI”等字样，并有黑圈或红圈标志。 接目镜:接目镜的作用是把接物镜的实像再放大一次，并把物象映入观察者的眼中。一般有接目镜2—3个，其上刻有5×、6×、10×等符号以表示它的放大倍数，数字越大，放大率越高。 一般计算显微镜的放大倍数是: 接目镜的放大率×接物镜的放大率=显微镜的放大倍数 例如接目镜放大率为10，接物镜放大率为45，此时显微镜的放大倍数为450，其余类推。 反光镜:显微镜下方的圆镜，可向四面转动，用镜面收集光线，使光线射向聚光器，反射到接物镜中。反光镜有平、凹两面，凹面镜聚光力强，适合于光线弱时或无聚光器的显微镜，以及收集通过窗纱的光线或光源为日光灯、物体放大低于100倍时用;平面镜聚光力较弱，适合于光线较弱，如光源为显微镜灯时用。 聚光器:在载物台下方，能聚集光线，增强视野的亮度。聚光器有的可以升降，升高时增强反射光，下降时减弱反射光。聚光器内部附有虹彩光圈(也称光圈或光阑)，可开大或缩小，以调节进入镜头的光线。光圈大小应适当，使物像能得到更清晰的效果。 2. 显微镜效能与油镜使用原理: 利用显微镜观察菌体时，总希望能看见最细小的部分，即分辨力(分辨本领)要高。分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力，主要是由接物镜来决定的。分辨力与接物镜的数值口径成反比，与镜检光波长度成正比: 分辨力=(1/2光波长度)/数值口径 数值口径(亦称开口率，numerical aperture,简写为N.A.)愈大，光波愈短，则所能辨晰的物体愈小。人们肉眼所能感受的光(即可见光)波长范围在400—700nm，平均光波长度为0.55µm 。如果放大率为90倍的油镜(N.A. =1.25)和放大率为9倍的接目镜时，其总放大率虽为810倍，但分辨力为0.55/2×1.25=0.22µm。即便用倍数更大的接目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出小于0.22µm的结构。 数值口径可由下式计算: N.A. =n?sinɑ 6 ɑ为镜口角(最大入射角)的半数。N为介质折射率。镜口角(图2-1)的大小，决定于接物镜的透镜的直径和焦距，是显微镜光学质量的关键。介质的折射率。空气是1，水是1.33，香柏油是1.515。油镜头焦距短，镜口较大，又滴加香柏油作介质，因而其N.A.最高。 使用油镜必须加油的另一原因是避免散光现象。因为空气的折射率和玻璃的折射率(1.52)相差较大，当光线经载玻片，再经空气进入接物镜时，部分光线将因折射而散失，从而使视野得不到足够的照明;如果加香柏油，则因其折射率与玻璃折射率相近，可使视野光亮充足。 3. 显微镜的使用法 ? 打开镜箱，右手紧握镜臂，左手托住镜座，轻放桌上。 ? 检查各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁。 ? 调解光线时不易用阳光，宜用散射光。将低倍接物镜对正下方，接物镜头离载物台约1cm，开放光圈，升高聚光器，调节反光镜，一般在光线较强的天然光源下，宜用平面反光镜;光线较弱的天然光源或人工光源，宜用凹面镜。镜检为染色的标本时，宜用较弱光线。 ? 将标本置载物台上，使之处于接物镜头的正下方。 ? 低倍镜观察:转动粗调节器实低倍接物镜头向下移动至距标本玻片约0.5cm处。再由目镜观测，同时转动粗调节器使镜筒慢慢升起直至看到物象时停止。再用细调节器微调至物象清晰。将合适的目的物用推动器移至视野中央，以备高倍镜观察。 ? 高倍镜观察:推动转换器将高倍接物镜头转至镜筒正下方，转换时应从侧面用眼观察，以防止接物镜头与载玻片相碰。然后从目镜中观察，调节光圈与聚光器使得到适宜照明，在转动细调节器(勿动粗调节器～)微调至物象清晰，再将需要放大观察的目的物移至视野正中央，以备油镜观察。 ? 油镜观察 用粗调节器将镜筒提起约1.5-2cm，将油镜头转至镜筒下方。滴加一滴香柏油与载玻片要观察的部位上。 眼睛从侧面注视，用粗调节器缓缓降下镜筒，直至油镜头浸没于香柏油内，至几乎与载玻片相接触，但注意不能相碰，以免压迫载玻片并损伤油镜头。然后从目镜中观察，首先调节光圈与聚光器，使光亮适当加大，用粗调节器极其缓慢地提起镜筒至出现物象为止。再用细调节器微调至物象清晰。如果镜头已提升出香柏油面而尚未见物象时，因按上述过程重复操作。 油镜使用完毕，将镜筒提起，取下载玻片，用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再取另一张纸沾取少量二甲苯擦镜头，然后用干净擦镜纸擦去镜头上残留的二甲苯。注意二甲苯用量不宜过多，擦拭时间应短。 7 ?. 显微镜使用完毕，将接物镜转成“八”字形，放平反光镜，降下聚光器再下旋镜筒，擦拭镜身灰尘后，归置镜箱中。 二. 微生物大小的测定 微生物大小可利用目镜测微尺来测量。目镜测微尺是一块可以置放在接目镜中隔板上的圆形玻片，中央刻有等分为50或100小格的标尺。目镜测微尺不是直接测量微生物，而是观测显微镜放大后的物象。因目镜测微尺每小格所表示的长度由使用的接目镜和接物镜的放大倍数及镜筒的长度而定，所以在使用前，需用镜(载物)台测微尺进行校正，以求得在特定的显微镜光学系统下目镜测微尺每小格所实际代表的长度。 镜台测微尺为一中央刻有精确刻度的载玻片，一般为1mm等分为100格，每格为10µm,专门用来校正目镜测微尺。 1. 方法和步骤 ? 用镜台测微尺校定目镜测微尺的长度 将目镜测微尺刻度朝下装入接目镜两透镜间的隔板上，将镜台测微尺置于载物台上，使刻度朝上并对准聚光器。 ? 先用低倍镜观察，调焦距，看清镜台测微尺后，转动接目镜使目镜测微尺与镜台测微尺平行对正。 ? 移动推进器，使二尺的一端重合，然后找出另一端第二条重合的线。如图中之AB与A’B’重合，另一端CD与C’D’重合。 ? 计算目镜测微尺每小格实际长度，记载。以图所示为例: 镜台测微尺格数×10 目镜测微尺每小格长度=—————————— 目镜测微尺格数 5×10 =————=8.33μm 6 ? 同法:在高倍接物镜下找出二尺的重合线，计算目镜测微尺每小格长度，记载。 ? 在镜台测微尺上加香柏油一滴，同法求出使用油镜头时目镜测微尺的每小格长度，记载。 2. 实测微生物的大小: 8 ? 取下镜台测微尺，换上待测标本片。 ? 按常规操作观察标本片，如细菌菌体大小，在高倍接物镜下不易测量，则用油镜。不管用任何接物镜头其结果应为一致。 ? 先量出菌体的长和宽各占目镜测微尺的格数，然后换算成微米数。一般测量细菌的大小，在同一标本片上，需测定10-20个菌体，求出其平均值及变化范围。 三. 实验报告和思考题 1. 如何正确使用油镜, 2. 为什么要使用目镜测微尺测量菌体,为什么在实测菌体之前要先校正目镜 测微尺, 四、参考资料 王家玲 环境微生物学实验 高等教育出版社 实验三 细菌、放线菌、霉菌的菌落形态观察及常用细菌染色法 一、 目的要求 1. 认识细菌、放线菌和霉菌的代表种类的菌落形态特征。 2. 学习常用细菌染色法。 二、基本原理 菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、放线菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。 三、实验材料 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 细黄链霉菌(5406放线菌，Streptomyces microflavus) 青霉属(Penicillium) 曲霉属(Aspergillus) 根霉属(Rhizopus) 显微镜、载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、酒精灯、纱布、接种环、吸水纸、香柏油、二甲苯、蒸馏水、齐氏石炭酸复红染色液、吕氏碱性美兰染液、草酸铵结晶紫染液、鲁哥氏碘液和番红染色液。 四、 实验步骤 1. 认真观察各种菌的菌落形状、大小、颜色、质地等特征并作描述纪录。 2. 制临时玻片，用显微镜对细菌、放线菌和霉菌进行观察，试比较它们的形态 特征。 细菌、放线菌和霉菌的简介: 9 ? 细菌:菌落表面光滑，有粘稠性，颜色乳白色或浅黄色。细菌是一类单细 胞微生物，个体小，一般需要放大1000倍才能看到，基本形态有球状、杆 状和螺旋状三种。球状的直径为0.5-2.0微米;杆菌和螺旋菌的宽度为 0.5-1.0微米，长度因种类的不同有较大差异，一般为1-5微米。 有些杆菌在细胞内能形成圆形或椭圆形的无性休眠体结构，称为芽孢。 芽孢的壁很厚，含水量少，化学物质不易渗透，对高温、光线、干燥和化学 药品等有较强的抵抗力，因此，进行消毒灭菌时，湿热灭菌需提高到120? 以上，干热灭菌需140-160?方能达到灭菌要求。 ? 放线菌:在琼脂培养基上，放线菌的菌落形态与细菌菌落有明显差异。其菌落大小介于霉菌和细菌之间。菌落表面多为紧密的绒状，坚实多皱，长孢子后呈粉末状。放线菌的细胞细长，中间不分隔，称为菌丝，菌丝的宽度与细菌相近，在1微米左右，需放大1000倍才能看到。它的菌丝有两种，一种长在培养基内部和紧贴在培养基表面，称为基内菌丝，起吸收营养的作用;一种在培养基表面，向空气中伸出，称为气生菌丝。气生菌丝发育到一定阶段，顶端形成孢子丝，产生孢子。孢子丝的形态不同，有的是直的，有的是波浪似的，有的螺旋状，是区分放线菌种类的重要特征。 ? 霉菌:霉菌的菌体成丝状，称为丝状真菌，但霉菌的菌丝要比放线菌粗十倍到数十倍。霉菌的菌落比细菌、放线菌都大，呈绒状或疏松的棉絮状，并有各种颜色。生物进化上比较低等的霉菌，菌丝体不分隔，整个菌体就是一个大细胞;较高等的霉菌，菌丝有许多分隔，成为多细胞微生物。霉菌的菌丝也分为营养菌丝和气生菌丝，他们的作用也和放线菌一样，营养菌丝具吸收养料的功能，气生菌丝可分化出繁殖器官，产生孢子。孢子随风飞散， 漂浮在大气中，遇到适宜的条件就萌发成新的菌丝体。他们对营养条件要求不严格，很容易在各种物质上生长，造成“发霉”的现象。 ? 青霉属(Penicillillum) 青霉菌的菌丝体无色，有横隔，在琼脂培养基上形成的菌落密毡状或棉絮状，初期白色，后期呈蓝绿色，青霉菌的分生孢子梗呈扫帚状分支，顶端串生球形至椭圆形的分生孢子，菌落的蓝绿色即是分生孢子表现的颜色(显微镜示范片)。 ? 曲霉属(Aspergillus)曲霉的菌丝通常无色，有横隔，老熟时渐变浅黄至褐色。接触培养基的菌丝分化出厚壁的足细胞，并由此向上生长直立的分生孢子梗，其顶端膨大成半球形或椭圆形的顶囊，顶囊表面以辐射状长出一层或双层瓶状小梗，小梗顶端串生分生孢子。分生孢子呈球状或柱状(显微镜示范片)。 ? 根霉属 (Rhizopus)菌丝不分隔，为多核的单细胞微生物。在培养基上生长时，由营养菌丝体产生匍匐枝向四周蔓延，匍匐枝的末端产生一丛假根，伸入培养基中吸收养料。从假根的相反方向长出直的孢子囊梗、端生膨大的孢子囊、囊内充满着球形的孢囊孢子。孢子囊成熟后破裂，释放出褐色的孢子(显微镜示范片)。 10 五、常用细菌染色法 细菌个体小,菌体透明,必须通过染色使其着色后,才能较好地在光学显微镜下观察其个体形态与部分结构.几种常用染色法介绍如下. 1. 简单染色法 采用一种单色染料对细菌进行染色，适用于菌体一般形态的观察。简单染色法操作步骤如下: ? 涂片:取干净载玻片一块，滴一小滴蒸馏水或生理盐水(菌悬液可不加水)，用接种环以无菌操作挑取少许菌落(或菌液)，与载玻片上水调匀涂成极薄菌膜。 ? 风干:使载玻片上的菌液在空气中自然干燥。 ? 固定:涂片面向上，用大拇指与食指夹住载玻片一端的侧面，使载玻片在酒精灯火焰上通过3-4次加热以固定细菌。注意不是用火烤。 ? 染色:在已固定的涂片上，滴加适当染色液，染色时间随不同染色液而异。如用齐氏石炭酸复红染色液，染色1-2分钟;如用吕氏碱性美兰染液，则染-3分钟。 ? 水洗:用细水流将涂片上染料洗去，水流勿过急过猛，应由玻片上端倾斜流洗至无多余燃料时止，将涂片自然干燥或吹风至干。 ? 镜检。 2. 格兰氏染色法 是细菌学中一个重要的鉴别染色法。根据细菌对此种染色法的反应不同，可将细菌区分为两大类，菌体呈紫色者为格兰氏阳性细菌，呈红色者为格兰仕阴性细菌。 格兰氏染色法是一种复染色法，应用结晶紫与番红两种不同性质的染料进行染色。染色成败的关键在于严格掌握酒精脱色程度，和应使用新鲜幼龄的菌体进行涂片。其操作步骤如下: ? 涂片:将待检细菌按上述简单染色法涂片、风干、固定。固定时通过火焰2次即可。 ? 初染:加草酸铵结晶紫染液染色1分钟，水洗。 ? 碘液固定:滴加鲁哥氏碘液冲去残水，覆盖涂片1分钟，水洗。 ? 酒精脱色:用95%酒精滴洗涂片处，至流洗出的酒精不呈现紫色时，立即用水冲洗酒精。脱色时间约20秒钟，或视涂片厚薄而略有差异。 ? 复染:用番红(或称沙黄)染色液染色1-2分钟，水洗。风干后镜检。 六、实验报告与思考题 1. 系统描述所观察的各种菌落的形态特征。 2. 格兰氏染色的关键何在,为什么, 七、参考资料 11 王家玲 环境微生物学实验 高等教育出版社 附:常用染色剂的配制 1. 齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液 溶液A 碱性复红(basic fuchsin) 0.3g 95%酒精 10ml 溶液B 石炭酸 5.0g 蒸馏水 95ml 将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使之溶解，配成溶 液A. 将石炭酸溶解在蒸馏水中，配成溶液B 将溶液A与溶液B混合即成.通常将此混合液稀释5-10倍使用。因稀释液易变 质失效，故一次不宜多配。 2. 吕氏(Loeffler)碱性美兰染液 溶液A 美蓝(methylene blue，亦称亚甲蓝) 0.6g 95%酒精 30ml 溶液B KOH 0.01g 蒸馏水 100ml 分别配制溶液A和溶液B,配好后混合即可。 3. 草酸铵结晶紫染液 溶液A 结晶紫(crystal violet) 2.0g 95%酒精 20ml 溶液B 草酸铵 [(NH4)C2O4•H2O] 0.8ml 蒸馏水 80ml 将A及B二溶液混合，静置48小时后使用。 4. 鲁哥氏(Lugol)碘液 I2 1.0g KI 2.0g 蒸馏水 300ml 先将KI溶解在少量蒸馏水中，再将I2溶解KI溶液中，然后加水至300ml 即成。 5. 番红染色液 番红(safranine O，亦名沙黄) 2.5g 95%酒精 100ml 蒸馏水 90ml 将上述配好的番红酒精溶液10ml与90ml蒸馏水混合即成。 12 实验四 环境监测中的微生物学方法(一) 土壤中主要异养菌的分离与计数 土壤是微生物最适宜的生活环境。土壤微生物类群繁多，以化能异养型的细菌、放线菌和霉菌为主，它们是自然界生态系统中的重要成员，也是人类利用微生物资源的主要来源。 微生物分离培养的基本原理是，选用不同成分和酸碱度的培养基，在不同的温度和不同的通气条件下进行培养，使只有适合该条件的微生物得以生长。由于土壤中各种菌的数量高，常需进行一定量稀释，使微生物能在培养基上长成单个菌落，以达到分离的目的。 常用的分离方法有平板划线分离法及平板稀释分离法(又称倾注法)。平板稀释分离法又可分为混匀法与涂布法两种。它不仅可用于分离，而且可通过此法测定原样品中的微生物数量。混匀法是将1ml菌悬液加入无菌培养皿中，然后再倾注溶化了的培养基与菌液混匀，凝固成平板后即可进行培养(详见实验六)。涂布法是先将溶化了的培养基，用无菌操作倒入无菌培养皿中制成平板，再将菌液涂布于平板表面进行培养。 本实验通过平板涂布法及平板划线法学习土壤中一般异养性细菌、放线菌和霉菌的分离及计数方法，并进行形态观察。 一、 器材与用品 1. 培养基(配方见实验一) ? 牛肉膏蛋白胨培养基，分离细菌用。 ? 高氏一号培养基，分离放线菌用。临用时向溶化的培养基中加入10% 的酚数滴，然后倒平板。 ? 马丁氏培养基，分离霉菌用。每1000ml培养基中加入1% 孟加拉红(玫瑰红，rose bengal)溶液3.3ml。临用时每100ml培养基中加1% 链霉素液0.3ml，然后倒平板。 2. 盛90ml无菌水的三角瓶，内装玻璃珠;盛9ml无菌水的试管;无菌培养皿;无菌1ml刻度吸管;无菌玻璃涂布棒等。 3. 显微镜、扭力天平、无菌取土铲及无菌盛土器等。 4. 乳酚油(乳酸石炭酸液):配制方法如下: 乳酸(比重1.2) 20g 石炭酸 20g 甘油(比重1.25) 40g 蒸馏水 20ml 配制时先将石炭酸加热溶解，倒入水中，再慢慢加入乳酸和甘油。 13 二、 方法和步骤 1. 取土样:选定取样点，按对角交叉取样法五点取样。先除去表层2cm的土壤。在2-10cm处取土样。若取土铲未曾灭菌，则需再取样前插入土中数次。将五点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，装入无菌容器中。土样取回后应尽快投入实验。同时称取待测土样10-15g，记下准确重量，经105?烘干8小时，置干燥器中冷却后称重。待干土至恒重时按下列公式计算土壤含水量的百分数，以便换算干土中的微生物数量。 湿土重- 干土重 土壤含水量 % =————————×100% 湿土重 2.制备土壤稀释液: 称新鲜土样10g，盛于有90ml无菌水的三角瓶内，充分 -1-1振摇15分钟，此即为10浓度的稀释液。静置15秒钟后，用无菌吸管取10稀释 -2液1ml加至9ml无菌水试管中，充分摇匀，此即为10浓度稀释液。另取无菌吸管， -3-4-6依次作10倍稀释，制成10、10„„等一系列土壤稀释液，通常稀释至10浓度。 3.接种 ? 涂布接种法:用无菌吸管分别吸取适宜浓度的土壤稀释液0.1ml,接种于相 -4-5-6应的培养基平板上。通常，细菌采用10、10、和10三种稀释度接种于肉膏蛋 -3-4-5白胨培养基，放线菌采用10、10和10三种稀释度接种于高氏一号培养基，霉 -2-3-4菌则采用10、10和10三种稀释度接种于马丁氏培养基。每一稀释度至少有三个平板重复(平行)。接种时每一稀释度用一支无菌试管，菌液注入平板后，应立 即用无菌涂布棒将该液均匀地涂布于平板表面。注意勿刮破琼脂。 ? 平板划线法: 取不同培养基平板，做好标记。在火焰边，左手托住培养皿并稍微开启皿盖，右手执无菌接种环沾取浓土壤液一环在培养基表面轻轻划线，注意勿划破琼脂。划线方法很多，图5-2示两种常用划法。A图系将平板分作3-4区，先将浓菌液在第1区平行划线3-4条，转动培养皿约60-70º角;用在火上烧过并冷却的接种环通过第1区划线在第2区划平行线，同法在第3区和第4区划线。B图系将沾有浓菌液的接种环在平板上作连续划线。 4.培养: 将上述接种后的培养皿倒置，于28-30?温箱中培养。 5.菌落观察与计数:需氧性细菌培养2-4天，霉菌4-7天，放线菌7-12天，观察结果。一般来说，细菌菌落较易自培养基上挑取;放线菌菌落较小，干燥、致密、坚实，不宜自培养基上挑取;霉菌菌落较大、疏松，常呈绒毛状或絮状。 涂布接种平板上菌落的计数方法，细菌和放线菌选取菌落数在30-300之间的培养皿，霉菌选菌落数在10-100的培养皿，按下式计算出每克干土中的菌数。 14 同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数×10 每克干土中菌数=————————————————— 1-土壤含水量% 菌落在平板上生长可有不同情况，其计数方法可参考试验六。 6.菌体形态镜检:镜检可参考实验三。 三、实验报告 1.描述所见细菌、放线菌和霉菌菌落的主要特征并绘出其菌体形态。 2. 将所检测土壤中三大类微生物的菌数，填入下表。 采土日期与地点: 稀释 度 菌落/g干-6-5-4-3-210 10 10 10 10 菌落数 土 类别 细 菌 放线菌 霉 菌 四、 思考题 为平板计数准确，需要掌握的关键性操作是什么,为什么, 五、参考资料 王家玲 环境微生物学实验 高等教育出版社 实验五 环境监测中的微生物学方法(二) 空气中的微生物的计数 被微生物污染的空气是呼吸道传染病的主要传播途径。检验空气中细菌的常用方法有沉降法与滤过法两种，沉降法所测的细菌数量欠准确，但方法简便;滤过法虽比沉降法繁琐，但准确性较高，可用于测定空气致病菌或空气消毒效果评定。通过本实验了解一定环境空气中微生物的数量并学习检定和计数空气微生物的基本方法。 一、 沉降法 15 空气中的细菌自然沉降于培养基的表面，经培养后计数其上生长的菌落数，按公式推算出1m?空气中的细菌总数。 1. 器材与用品 ? 仪器:高压蒸汽灭菌器、干热灭菌器、恒温箱、4?冰箱、培养皿、吸管等。 ? 灭菌培养基 ? 牛肉膏蛋白胨培养基(配方参阅实验一)。 ? 查氏培养基(配方参阅实验一)。 ? 高氏一号培养基(配方参阅实验一)。 2. 方法与步骤 ? 将牛肉膏蛋白胨培养基、查氏培养基、高氏一号培养基溶化后，各倒8个培养皿。 ? 将上述三种培养皿各取四个。在室外打开皿盖，分别暴露于空气中5分钟、10分钟。另四个培养皿，在实验室空气中分别暴露5分钟、10分钟(不同时间各平行两皿)。 ? 盖上皿盖，将平板倒转，置于28?温箱中，细菌培养48小时，霉菌与放线菌培养时间分别为4-6天，计算其菌落数，观察菌落形态、颜色等。 ? 计算1m?空气中微生物的数目 奥梅梁斯基曾:如面积为100cm?的平板培养基，暴露在空气中5分钟，与37?培养4小时后所生长的菌落数，相当于10L空气中的细菌数。 N×100×100 X = —————— πr? X:每m?空气中的细菌数 N:平板暴露5分钟，与37?培养24小时后生长的菌落数 r?:平皿底半径(cm) 二、滤过法 使一定体积的空气通过吸附剂，而后 培养吸附剂中的细菌，计数出菌落数。 1. 器材与用品 ? 仪器:盛50ml无菌水的三角瓶、 蒸馏水瓶，其余同沉降法。 ? 培养基:同沉降法。 2. 方法与步骤 ? 先将仪器按图6-1装置。 16 ? 将下面的大玻璃瓶盛满4L水。 ? 旋开水龙头，使水缓缓流出。这时外界的空气被吸入，经喇叭口进入盛有50ml无菌水的三角瓶中。至4L水流完后，则4L体积空气中的微生物被过滤在50ml水中。 ? 自三角瓶中吸1ml水放入培养皿中(重复三遍)，然后加入已溶化并冷却至45?的牛肉膏蛋白胨培养基中，摇匀。凝固后置28?温箱中培养48小时后计算结果。 ? 计算结果:按下式计算 每皿平均菌落数×50 菌数/L空气 = —————————— 4 三、实验报告 1.记录用沉降法测得空气中微生物的种类和数量 菌落平 均数 细 菌 霉 菌 放 线 菌 环境 5min 室外 10min 5min 室内 10min 2. 分别计算用沉降法和滤过法测出的1L(或1m?)环境空气中所含菌数。 四、思考题 比较上述两种空气菌数测定的结果，并分析其优缺点。 五、参考资料 王家玲 环境微生物学实验 高等教育出版社 实验六 环境监测中的微生物学方法(三) 水中细菌总数的测定 细菌总数主要作为判定被检水样污染程度的标志。在水质卫生学检验中，细菌总数是指1ml水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，于37?经24小时培养后，所生长的细菌菌落的总数。 一、器材与用品 17 1. 仪器:高压蒸汽灭菌器、干热灭菌器、恒温箱、4?冰箱、放大镜。试管、培养皿(直径9cm)、刻度试管等置于干热灭菌器中160?灭菌2小时。 2. 培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(配方参阅实验一)。 二、操作步骤 1. 水样的采取:供细菌学检验用的水样，必须按一般无菌操作的基本要求进行采样，并保证在运送、贮存过程中不受污染。为了要正确反映水质在采样时的真实情况，水样采取后应立即送检;一般从取样到检验不应超过4小时。条件不允许立即检验时，应存于冰箱，但也不应超过24小时，并应在检验单上注明。 ? 自来水:先将自来水龙头用火焰烧灼三分钟灭菌，然后再开放水龙头使水流5分钟，以排出管道内积存的死水，再用无菌容器接取水样，以待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶未灭菌前先按每采500ml水样加3% 硫代硫酸钠(Na2S2O3?5H2O)溶液1ml的量预先加入采样瓶内，用以采样后中和水样内的余氯，以防止其继续存在有杀菌作用。 ? 江水、河水、池水或湖水:可应用采样器，器内的采样瓶应先灭菌。采水样时，直接将水灌入已灭菌的采样瓶，不需再用样水洗采样瓶。采样后，采样瓶的水面与瓶塞底部间应留有一些空隙，以便在检验时可充分摇动混匀水样。 2.水中细菌总数的测定 ? 水样的稀释:根据水被污染程度的不同，可用无菌吸管作10倍系列稀释(稀释方法同实验四中的土壤液的稀释)。 ? 接种:以无菌操作方法用无菌吸管吸取原水样1ml或取2-3个适宜浓度稀释液1ml,注入灭菌培养皿中。倾注约15ml已溶化并冷却到45?左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即旋转培养皿，使水样与培养基充分混匀，每个稀释度平行三皿。另设三皿空白对照。 ? 培养:待冷却凝固后，翻转培养皿，使底面朝上，置于37?恒温箱内培养24小时，进行菌落计数，即为1ml水中的细菌总数。 ? 菌落计数:先计算同一稀释度的平均菌落数，若其中一个培养皿有较大片状菌落生长时，则不予采用，而应以无片状菌落生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到培养皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此培养皿计数乘2以代表全培养皿菌落数;然后再计算该稀释度的平均菌落数。 各种不同情况的计算方法: ? 首先选择平均菌落数在30-300之间者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则即以该平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表例次1)。 ? 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30-300之间，则应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中较少的菌落总数(见表例次2及3)。 18 ? 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表例次4)。 ? 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表例次5)。 ? 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间则以最近300或30的平均菌落乘以稀释倍数报告(见表例次6)。 表 计算菌落总数的方法举例 不同稀释度的平均菌落数 两个稀释度菌落总数报告方式 例次 备注 -1 -2 -3 101010菌落数之比 (个/ml) (个/ml) 41 1365 164 20 - 16400 16000或1.6×10 两位以 42 2760 294 46 1.6 37700 38000或3.8×10 后的数 4 3 2800 271 60 2.2 27100 27000或2.7×10字采取 54 无法计数 1650 513 - 513000 510000或5.1×10 四舍五 25 27 11 5 - 270 270或2.7×10 入的方 46 无法计数 305 12 - 30500 31000或3.1×10 法去掉 三、实验报告 报告本次你所测水样中每毫升细菌总数。并说明该水样是否合乎饮用水。 四、思考题 用这种方法是否测得全部水中细菌,为什么, 五、参考资料 王家玲 环境微生物学实验 高等教育出版社 实验七 酵母菌酵的加富培养与分离 酵母菌常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。大多数酵母菌营腐生生活，喜偏酸条件，最适pH为4.5-6。酵母菌生长迅速，易于分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快;利用酸性培养条件则可抑制细菌生长。因此，常用酸性液体培养基获得酵母的加富培养，然后在固体培养基上用划线法分离。 一、 器材与用品 1. 甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮。 19 2. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(配方见实验1)。 3. 乳酸马铃薯葡萄糖培养液，配方同上，但不加琼脂而加乳酸，按每1000ml培养液中含5ml乳酸量加入，再分装试管。 4. 0.1% 美蓝染色液。 5. 1ml刻度无菌吸管、无菌培养皿等。 二、 方法和步骤 1. 接种:取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置28-30?,培养24小时可见培养也变混浊。 2. 加富培养:用无菌吸管取上述培养后培养液0.1ml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28-30?再培养24小时或稍长(过长则霉菌长出)。 3. 镜检:用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.1% 美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并可根据菌体是否染上颜色来区别细胞的死活。因活酵母可使美蓝还原，故菌体不着色。 4. 分离:马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板。用划线法分离上述加富培养体，培养后可获得单个菌落。挑选单个菌落反复再次划线分离纯化，即可获得纯培养。 三、 实验报告 绘图并描述所得酵母的菌落和菌体形态。 四、 思考题 为什么在进行加富培养时要用酸性的培养液，而进行划线分离培养时可以不用酸性培养基, 五、 参考资料 王家玲 环境微生物学实验 高等教育出版社 实验八 金属的微生物腐蚀 埋地金属管道和水下金属构筑物的腐蚀中，除了化学因子外，还可以由微生物引起。参与金属腐蚀的微生物主要有铁细菌和硫酸盐还原菌两大类。铁细菌的作用在于它在金属表面形成生物垢和大量沉积物。这些沉淀物在金属表面能产生氧差电池引起的电化学腐蚀，同时它还为硫酸盐还原菌创造厌氧条件，对金属腐蚀起了间接的加速作用。硫酸盐还原菌能将硫酸盐还原为硫化物，通过消耗氢使金属表面阴极部位去极化，从而加速电化学腐蚀。因此，结合现场腐蚀特征观察，分析铁细菌 20 和硫酸盐还原菌的数量，有助于确定腐蚀的原因和提出防护措施。本实验学习MPN法计数金属腐蚀中的微生物。 MPN(most probable number)法中译名为最可能数法或最近似值法。它是将不同 稀释度的待测样品接种至液体培养基中培养。然后根据受检菌的特性选择方法以判 断其生长，并经统计学处理进行计数。此种方法亦称稀释液体培养计数法或稀释频 度法。 一、器材与用品 1. 铁细菌培养基 (NH)SO 0.5g 424 NaNO3 0.5g K2HPO4 0.5g MgSO4?7H2O 0.5g CaCl2•6H2O 0.2g 柠檬酸铁铵 10.0g 蒸馏水 1000ml pH7.0,按每只试管(15×150mm)8ml分装27支，121?高压蒸汽灭菌20分钟。 2. 硫酸盐还原菌培养基 乳酸钠(70%) 3.5g NH4Cl 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4.7H2O 2.0g Na2SO4 0.5g CaCl2 0.1g 硫酸亚铁铵 微量 蒸馏水 1000ml pH7.0,培养基按每只试管(15×150mm)8-10ml分装18支，每支试管加入1枚3cm长小铁钉(先用95% 酒精浸泡处理10分钟)作还原剂。121?高压蒸汽灭菌20分钟。 3. 盛灭菌9ml自来水试管(15×150mm)10支。 4. 盛99ml灭菌水和加有20粒玻璃珠的300ml三角瓶1个。 5. 灭菌1ml吸管10支。 6. 取样工具:小铁铲、灭菌小铝盒、胶布。 二、方法和步骤 1. 现场观察:通常受微生物腐蚀的金属具有如下特征:腐蚀坑充满黑色腐蚀 产物，加HCl处理时可放出H2S;腐蚀产物下面的金属表面往往发亮;腐蚀坑的表面 呈同心圆环状，纵剖面呈圆锥形等。 21 2. 样品采集:用取样小铁铲从发生腐蚀金属构件的腐蚀部位，采取腐蚀垢样10g左右，置于灭菌小铝盒中，用胶布封口备用。如不能立即进行微生物分析，需存放4?冰箱，并于48小时内分析完。 3. 样品稀释液制备:称取1g经混合均匀的腐蚀垢样，放入盛有99ml无菌水的三角瓶中， -2-8充分振荡10分钟。然后按常规的1比9稀释法制成10至10浓度的样品悬液。 -2-84. 接种培养:铁细菌取10至10稀释度，接入铁细菌试管培养液中，每一个 -2-6稀释度设三个重复(平行)，每管接种1ml，共21管。硫酸盐还原菌取10至10稀释度，接入硫酸盐还原菌培养液中，三个重复，共15管。接种后的试管，置于28—30?条件下培养。 5. 结果 ?观察成长与否:铁细菌于培养5—7天后观察培养液变浑浊，液面长有菌膜者为阳性;硫酸还原菌于10—14天后观察，培养液浑浊变黑者为阳性反应。纪录各管生长情况(+或-)。 -1 -2 -3 -4 -5 稀 释 度 1010101010 ，，，，， ，，，，， ，，，，, ，，,,, ,,,,, 生长情况 5 5 4 2 0 ?MPN法的结果计算法 ?根据稀释系列液中生长情况确定数量指标。不论稀释度及重复次数如何，数量指标均为三位数字，其第一位数字必须是在稀释系列中所有重复都有菌生长的最 -2高稀释度，如下例中的10。在此例中，其数量指标为542。如果其后的稀释度尚有 -5生长，设此例中的10不是0而是2，则应将此数加入数量指标的最末位数字上，即为544。 ?根据数量指标查MPN表(见本实验附注)查处最可能数，如此例数量指标542之最可能数值为25，在按下式计算结果: 最可能数×数量指标第一位数的稀释倍数 每克干样品中菌数 = ———————————————————— 干样% 三、 实验报告 1. 描述现场观察到的金属腐蚀特征。 2. 记载铁细菌及硫酸还原细菌在试管中的生长情况。 3. 查MPN法的三个重复最可能数表，计算并报告所测得两种菌菌数。 四、 思考题 22 初步分析所检金属构件腐蚀的原因。 五、附注 MPN法测数统计表 ?三次重复测数统计表 细 菌 细 菌 细 菌 数量指标 数量指标 数量指标 最可能数 最可能数 最可能数 000 0.0 201 1.4 302 6.5 001 0.3 202 2.0 310 4.5 010 0.3 210 1.5 311 7.5 011 0.6 211 2.0 312 11.5 020 0.6 212 3.0 313 16.0 100 0.4 220 2.0 320 9.5 101 0.7 221 3.0 321 15.0 102 1.1 222 3.5 322 20.0 110 0.7 223 4.0 323 30.0 111 1.1 230 3.0 330 25.0 120 1.1 231 3.5 331 45.0 121 1.5 232 4.0 332 110.0 130 1.6 300 2.5 333 140.0 200 0.9 301 4.0 ?四次重复测数统计表 细 菌 细 菌 细 菌 细 菌 数量指标 数量指标 数量指标 数量指标 最可能数 最可能数 最可能数 最可能数 000 0.0 113 1.3 231 2.0 402 5.0 001 0.2 120 0.8 240 2.0 403 7.0 002 0.5 121 1.1 241 3.0 410 3.5 003 0.7 122 1.3 300 1.1 411 5.5 010 0.2 123 1.6 301 1.6 412 8.0 011 0.5 130 1.1 302 2.0 413 11.0 012 0.7 131 1.4 303 2.5 414 14.0 013 0.9 132 1.6 310 1.6 420 6.0 020 0.5 140 1.4 311 2.0 421 9.5 021 0.7 141 1.7 312 3.0 422 13.0 23 022 0.9 200 0.6 313 3.5 423 17.0 030 0.7 201 0.9 320 2.0 424 20.0 031 0.9 202 1.2 321 3.0 430 11.5 040 0.9 203 1.6 322 3.5 431 16.5 041 1.2 210 0.9 330 3.0 432 20.0 100 0.3 211 1.3 331 3.5 433 30.0 101 0.5 212 1.6 332 4.0 434 35.0 102 0.8 213 2.0 333 5.0 440 25.0 103 1.0 220 1.3 340 3.5 441 40.0 110 0.5 221 1.6 341 4.5 442 70.0 111 0.8 222 2.0 400 2.5 443 140.0 112 1.0 230 1.7 401 3.5 444 160.0 ?五次重复测数统计表 细 菌 细 菌 细 菌 细 菌 数量指标 数量指标 数量指标 数量指标 最可能数 最可能数 最可能数 最可能数 000 0.0 203 1.2 400 1.3 513 8.5 001 0.2 210 0.7 401 1.7 520 5.0 002 0.4 211 0.9 402 2.0 521 7.0 010 0.2 212 1.2 403 2.5 522 9.5 011 0.4 220 0.9 410 1.7 523 12.0 012 0.6 221 1.2 411 2.0 524 15.0 020 0.4 222 1.4 412 2.5 525 17.5 021 0.6 230 1.2 420 2.0 530 8.0 030 0.6 231 1.4 421 2.5 531 11.0 100 0.2 240 1.4 422 3.0 532 14.0 101 0.4 300 0.8 430 2.5 533 17.5 102 0.6 301 1.1 431 3.0 534 20.0 103 0.8 302 1.4 432 4.0 535 25.0 110 0.4 310 1.1 440 3.5 540 13.0 111 0.6 311 1.4 441 4.9 541 17.0 112 0.8 312 1.7 450 4.0 542 25.0 120 0.6 313 2.0 451 5.0 543 30.0 121 0.8 320 1.4 500 2.5 544 35.0 122 1.0 321 1.7 501 3.0 545 45.0 24 130 0.8 322 2.0 502 4.0 550 25.0 131 1.0 330 1.7 503 6.0 551 35.0 140 1.1 331 2.0 504 7.5 552 60.0 200 0.5 340 2.0 510 3.5 553 90.0 201 0.7 341 2.5 511 4.5 554 160.0 202 0.9 350 2.5 512 6.0 555 180.0 六、 参考资料 王家玲 环境微生物学实验 高等教育出版社 实验九 纤维素的分解 每年有大量纤维素物质作为废弃物进入环境。纤维素的分解是自然界碳素转化的 重要环节。分解纤维素的微生物种类甚多，本实验主要培养观察在中温有氧与缺氧 条件下分解纤维素的微生物以及滤纸纤维素被分解的现象。 一、器材与用品 1. 赫氏噬纤维菌基础培养基 KH2PO4 1.0g CaCL2•6H2O 0.1g MgSO4•7H2O 0.3g NaCl 0.1g FeCl3 0.01g NaNO3 2.5g 蒸馏水 1000ml 琼脂 15-20g 调节pH7.0-7.2,121?高压蒸汽灭菌30分钟，趁热制成平板。 2. 厌氧性分解纤维素细菌培养液 蛋白胨 1.0g Na(NH4)HPO4 2.0g KH2PO4 1.0g CaCl2?6H2O 0.3g MgSO4?7H2O 0.5g CaCO3 5.0g 蒸馏水 1000ml 于每支1.5×150cm试管中灌注培养液12ml,放入1×2cm滤纸二条，使沉没在 试管下部。121?高压蒸汽灭菌30分钟。 3. 直径9cm的无菌圆形滤纸。 25 4. 菜园土、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)及白腐菌(Trametes hirsute T.versicolor Pleutrotus ostreatus)。 5. 液体石蜡。 二、 方法和步骤 1. 接种 ?取无菌圆滤纸四张，分别置于四个赫氏纤维菌基础培养基平板上，贴紧。用接种针挑取三种菌，注意挑取时要带上少许培养基，每种菌挑取十小块，分别接种在三个滤纸表面。最后一个滤纸上不接种，作为对照。 ?取厌氧性分解纤维素细菌培养液二管。一管不接种，一管接入少许菜园土。培养液面上注入一层液体石蜡以造成厌氧环境。 2. 培养:将上述培养皿置28-30?恒温箱中，培养7-10天，上述试管置33-37?恒温箱中，培养10-15天。 3. 观察: ?滤纸被分解情况:注意滤纸出现斑点或变薄，分解旺盛时可见滤纸彻底溃烂 状。 ?试管滤纸条上可见灰色半透明或黄色斑块的纤维溶解区，即为厌氧性分解纤维素细菌菌落，挑取带黄色的纤维少许于载玻片上，加无菌水一滴，将纤维散开，干燥固定，同齐氏石炭酸复红染色。油镜下观察，常可见一种长杆菌，形成芽孢时，细胞末端膨大成鼓槌状，此即分解纤维素能力很强的奥氏梭菌(Clostridium omelianskii)。 三、实验报告 描述(接种与不接种)培养皿及试管中滤纸的分解情况。 四、思考题 本实验培养基中加入滤纸的作用是什么, 五、参考资料 王家玲 环境微生物学实验 高等教育出版社 26