色谱

简写 柱色谱CC 纸色谱KLC 薄层色谱TLC 气相色谱GC 热导检测器(Thermal Conductivity Detector简称TCD) 氢火焰离子化检测器(Hydrogen Flame Ionization Detector简称FID) 电子捕获检测器(Electron Capture Detector简称ECD) 火焰光度检测器(Flame Photometer Detector简称FPD) 高压液相色谱HPLC 吸附色谱(Adsorption Chromatography) 分配色谱(Partition Chromatography) 离子色谱(Ion Chromatography) 体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography) 亲和色谱(Affinity Chromatography) 紫外吸收检测器(UVD) 折光指数检测器(RID) 电导检测器(ECD) 荧光检测器(FD) 色谱定义:色谱法或色谱(chromatography)也称之为色层法或层析法,是一种物理化学分析方法,它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别,当溶质在两相间做相对移动时,各物质在两相间进行多次分配,从而使各组分得到分离。可完成这种分离的仪器即色谱仪 色谱的分类: 一、按两相物质物理状态来分 气液色谱法液液色谱 气液色谱法液相色谱法 气固色谱法液固色谱法 二、按照固定相的形式来分:柱色谱法、薄层色谱法、纸色谱 三、按照色谱分离原理来分:吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法和凝胶色谱法(排阻色谱法或分子筛色谱法)。 四、按使用领域不同对色谱仪的分类: 1)分析用色谱仪:主要用于各种样品的分析,其特点是色谱柱较细,分析的样品量少。 2)制备用色谱仪:又可分为实验室用制备型色谱仪和工业用大型制造纯物质的制备色谱仪分离原理: 吸附色谱:其作用原理是利用混合物各组分对吸附剂的吸附能力不同,而将各组分分离 分配色谱:其作用是利用混合物的各组分在相间的分配系数不同,而进行各组分的分离。包括气-液分配色谱和液-液分配色谱。 离子交换色谱:其原理是基于溶液中的离子与某种称为离子交换剂的吸附剂表面的离子之间的相互交换作用。 凝胶色谱法:根据分子量大小不同来实现分离的目的。 糖中除酸(葡萄糖中除去柠檬酸) 向阴离子交换柱中通入糖液,则柠檬酸负离子被交换于树脂上,排出糖液,则达到分离目的。树脂用碳酸铵液洗提,则得柠檬酸铵溶液。然后树脂再用NaOH液再生。 除去羰基化合物——异丙醇中除去少量丙酮。 向阴离子交换柱中加入亚硫酸氢钠液,则亚硫酸氢根负离子交换于树脂上,用水洗至无碱性,然后通入异丙醇丙酮样品,则丙酮与交换于柱上之亚硫酸氢根负离子加成而留于树脂上,而余下之异丙醇则流出,从而达到分离目的。 然后向柱中再通入稀NaCl液,则氯离子顶替出亚硫酸氢钠和丙酮,完成洗涤任务,最后树脂再于碱液中再生。 纸色谱的分离原理:纸上色谱法是分配色谱法中较常用的,其作用是利用混合物的各组分在相间的分配系数不同,而进行各组分的分离 由于被吸附物与吸附剂间的作用力包括色散力、静电力、诱导力和氢键作用力,这四种力的强弱顺序为: 氢键作用力>静电力>诱导力>色散力 因而在各类有机化合物中,饱和烃的吸附最小,如果分子中含有某些官能团,如-NO2, -COOR, -CHO, -OH, -COOH,-NH2,=NH等,常有显著的氢键力存在,则吸附力增大。由实验知,含单官能团的有机化合物与硅胶和氧化铝的亲和力大小次序如下: 羧酸>醇、酰胺>伯胺>酯、醛、酮>腈、叔胺、硝基化合物>醚>烯>卤代烃>烷 分子双键数目增加,亲和力也增加。特别是当双键处于共轭时更加如此,芳环的影响比双键大,芳烃的增加及同系物中分子量的增加,吸附力也增加。分子中极性官能团数目增多,一般情况下,吸附力增加,但两个官能团处于邻位而能发生分子内氢键时,则亲和力将小于不发生分子内氢键的位置异构体,如: 为什么薄层色谱比纸色谱的检测灵敏度高? 因为纸色谱用的滤纸纤维之间空隙较大,因而使产品的扩散范围大,而薄层色谱用的固定相的内部结构比较紧密,因而样品扩散的慢,样品范围较小,其中心的确定误差较小,故薄层色谱比纸色谱的检测灵敏度高 薄层色谱Rf受到哪些因素的影响? 色谱法中的Rf值可作为定性有机化合物指标之一,薄层色谱中的Rf值将受到下列因素的影响: 1.吸附剂的性质和质量:不同厂家和不同批号的吸附剂质量不一定一样,因之对同一样品的Rf会有所不同。 2.吸附剂的活度、空气湿度及存放期长短之不同。 3.取样量大小之不同。 4.层析缸的饱和程度(不饱和时Rf大) 5.边缘效应:同一样品、点样于薄层两边比点样于中间的Rf大,特别是用低沸点混合展开 剂时更是如此,此种现象叫边缘效应。其原因是薄层两边的展开剂中,非极性低沸点部分易挥发,剩余极性溶剂比较多(与中间相比),使样品解吸快之故。但层析缸中展开剂蒸气饱和程度较大时,则可避免发生边缘效应。 6.薄层厚度不同。 7.展开剂中的杂质(如水分)。 8.展开方式:上行与下行法的Rf值可能不同。 9.样品中杂质的存在,大量杂质的存在会影响Rf值。 10.温度:用混合剂为展开剂时,温度变化会影响溶剂挥发性,近而影响展开剂组分变化,从而Rf值变更。 薄层色谱显色的方法有哪几种: 1.蒸气 利用一些物质的蒸气与样品作用而显色,如碘、溴、浓氨水等蒸气,它们可与样品发生加成,或吸附等作用而呈色,多数是化合物对碘的吸附作用,碘一般能显黄——黄棕色斑点,显色后,斑点在空气中会褪色(碘又挥发出去),故在大多数情况下,碘是一种非破坏性显色剂,特别利于制备色谱。 2.喷雾显色: 将显色剂配成一定浓度溶液,用喷雾法均匀喷于薄层上,再于一定条件下处理,即可显色,喷雾时,喷雾器最好距离薄层2~3尺远,以免将吸附剂吹散。 3.荧光显示 有些化合物本身发荧光,展开后可在紫外灯下观察荧光斑点,用铅笔在薄层板上画出记号。有的化合物本身荧光不强,但用碘蒸气熏一下时,荧光灵敏度将提高;有的化合物与某一试剂作用后才显荧光;也可在制板时在吸附剂中加入一定无机荧光物,则在紫外灯下无荧光物斑点呈暗色。 气相色谱检测器的分类: A 按检测机理分为浓度型和质量型: 浓度型检测器,响应正比于物质在载气中的浓度,其瞬间响应值(峰高)基本与载气流速无关,而积分响应值(峰面积)则随流速升高而降低。 质量型检测器响应正比于单位时间内通过检测器的物质量,即正比于质量流速,其响应值(峰高)与载气流速呈正比而峰面积与流速无关。 B 按检测器对各类物质响应的差别,分为通用型和选择性两类,通用型对所有物质都有响应,选择型对有些物质有很大响应,而对其它物质响应很小或无响应。 名词解释 半高峰宽(peak width at half height) (Wh/2)是在峰高一半处的色谱峰的宽度,即下图中的CD,单位可用时间或距离表示。 峰宽(peak width)(W)是在流出曲线拐点处作切线,在下图中于基线上交于E,F处,此两点间的距离叫峰宽,有些色谱上叫做“基线宽度”。 偏差(σ)在下图中色谱峰高0.607处峰宽AB距离的一半叫标准偏差。 在这三种表示方法中以前两者使用较多,三者的关系是: W=4σ Wh/2 =2√2ln2σ=2.354820σ 死时间(dead time)(tM)一些不被固定相吸收或吸附的气体通过色谱柱的时间,如用热导池作检测器时,从注射空气样品到空气峰顶出现时的时间,以s或min为单位表示。 死体积(dead volume)(VM)指色谱柱中不被固定相占据的空间及进样系统管道和检测系统的总体积,等于死时间乘以载气的流速。 死区域(dead zone)(VG) 指色谱柱中不被固定相占据的空间。 保留时间(retention time)(tR) 从注射样品到色谱峰顶出现时的时间,以s或min为单位表示。 调整保留时间(adjusted retention time)(t'R) 保留时间减去死时间即为调整保留时间(tR-tM)。保留体积(retention volume)(VR) 从注射样品到色谱峰顶出现时,通过色谱系统载气的体积,一般可用保留时间乘以载气流速求得,以mL为单位表示。 调整保留体积(adjusted retention volume)(V'R) 保留体积减去死体积即为调整保留体积(VR-VM)。 净保留体积(net retention volume)(VN) 经压力修正的调整保留体积, 即:VN=jV'R 式中j——色谱柱进口和出口之间的压力梯度校正系数。 2 Pi -1 3 Po j= 3 2 pi -1 po 式中pi——色谱柱进口压力;Po——色谱柱出口压力。 比保留体积(specific retention volume)(Vg) 把净保留体积进一步校正到单位质量固定液和273K时的保留体积,如下式: V N 273 Vg= × VLρL T 式中VL——固定液的体积;ρL——固定液的密度;VLρL——固定液的质量。 理论塔板数(n)的计算和测定 色谱柱的柱效率可以用理论塔板数(n),也可以用理论板高(H)表示。H=L/n 式中L是色谱柱的柱长,L, H均以mm表示。 计算理论塔板数(n)的计算公式是: n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 测定理论塔板数(n)是在一定的色谱条件下(即一定的色谱柱,一定的柱温、流速下),注入某一测试样品,记录色谱图,测定色谱峰的半高峰宽(或峰宽)和进样点到色谱峰极大点的距离,二者的单位要一致。 如半高峰宽(Wh/2)=2mm,进样点到色谱峰极大点的距离tR=18mm,按公式计算得: n=5.54(18/2)2=449 有效塔板数(neff) 为了消除色谱柱中死体积对柱效的影响,人们常用有效理论塔板数(neff)表征色谱柱的实际柱效,按下式计算 neff=16(t'R/W)2=5.54(t'R/Wh/2)2 相应的有效理论塔板高度(Heff) Heff=L/neff 范特姆特方程,即板高方程。 H=A+B/U+CU 式中: H——理论板高; A——称涡流扩散项,A,为σ12/L; B——称分子扩散项,B/U, 为σ22/L; C——称传质阻力项,CU,为σ32/L U——载气线速度。 上式,板高与载气线速度有关系,亦称速率理论方程。由于许多参数还不能定量求出,因此,还只能定性说明影响板高的因素。 保留指数(retention index)(I)保留指数是1958年克瓦茨(Kovats)提出来的,用以表示化合物在一定温度下在某种固定液上的相对保留值,具体说它是以一系列正构烷烃作标准的相对保留值,其定义如下: lgt'R(x)-lgt'R(n) I= ×100m+100n lgt'R(n+m)-lgt'R(n) 式中t'R——某化合物在某一固定液上的调整保留时间; t'R(n) ,t'R(n+m) ——在同一固定液上,碳数为n和n+m的正构烷烃的调整保留时间,在测定时要求t'R(n+m)>t'R(x)>t'R(n),规定在任何固定液上、任何温度下正构烷烃的保留指数均为100n(n为正构烷烃的碳数) 基团截面积法:热导池组分上的FNi/s可由基团结构单元的FNi/s值加合性得到,有机官能团的FNi/s称为截面积值 用基团截面积法预测FNi/S实例 乙酸正丁酯:CH3COOCH2CH2CH2CH3 2CH3- =24 3- CH2- =33 -COO- =77 总和134 实验值135 甲乙酮CH3-CO-CH2-CH3 2CH3 - =24 -CH2- =11 -CO- =64 总和99 实验值98 气相色谱定量方法很多,常用的有下面几种: 归一化法:样品中所有组分均能从色谱柱洗出并都有相应色谱峰,同时已知各组分的相对校正因子,则可求出各组分的重量百分含量: Wi Pi%= W1+W2+…+Wi+…+Wn Ai/Fwi = A1/Fw1+A2/Fw2+…+Ai/Fwi+…+An/Fwn Ai/Fwi = ∑Ai/Fwi Pi%——为组分i的重量百分含量;Fwi——组分i的相对重量校正因子。 内标法:当色谱柱不能使所有组分都洗出来,或检测器不是对所有组分都有信号,以及在定量分析中只要求测定某一个或几个组分。其它组分因含量过高或过低而难以测定时,可用内标法定量。这是在一定量(W)样品中,加入一定量(Ws)某纯物质作内标,选用的内标物为样品中不存在的物质,且不与样品作用,能与样品中各组分在色谱中分离。 其计算公式可推导如下: Wi Pi%= ×100% W Ws Ps%= ×100% W Pi% Wi = Ps% Ws i%——组分i 的百分含量。 Ps%——为内标物与样品的重量比(以百分比表示)。 W ——为样品重量 Ws ——为加入内标物的重量。 Ai, As ——为组分i 和内标物的峰面积。 Fwi/s', Fws/s'——为组分i 和内标物s 的相对校正因子 。 若内标物与测定相对校正因子的标准物为同一物质,则 Fws/s'=1 外标法:又称已知校正法或定量进样法。欲测定样品中组分i 的含量,用纯的组分i 配制成已知浓度的标样,在同样操作条件下,分析标准样和未知样,要求准确定量进样。根据组分量与相应峰面积或峰高呈线性关系,则在标准与未知样进样量相等时 Ai Pi%= ×Pis% Ais Pi ——为组分i 在样品中的百分含量 Pis ——为组分i 在标准样中的百分含量 Ai ——试样中组分i 峰面积 Ais ——标准样中组分i 峰面积。 在色谱分析中是按体积(液体、溶液、气体)进样,上式在试样和标样比重相等或相近时适用。考虑到比重上的差别,最好用浓度、即单位体积中试样和标准中被测组分的量(W/V )表示。 Ai Ci= ×Cis As 式中Ci ——试样中,单位体积中组分i 的量。 %%%%'/'/'/'/s s Wi s s Ws i s s Ws s s Wi i s s i i P F A F A P F A F A P W W P ???=?=?=%1%/s s Wi s i i P F A A P ??= Cis——标样中,单位体积中配制组分的i量。 试样与标样中的溶剂成分应一致。 外标法常用峰高作为定量依据,有时又称为峰高定量法。 在应用上,亦可用纯组分(或纯组分的溶液)以不同量定量进样分析,求出组分量对峰面积(或峰高)的校正曲线。在同样操作条件下分析未知样时,根据组分的峰面积,即可从校正曲线上求出组分含量。这又称为校正曲线定量法。 外标法的标准物就是测定组分本身,比较适用于固定组分的定量分析。较多使用在工业生产分析上。此法要求严格控制操作条件,且要求准确定量进样。而归一化法和内标法不要求准确定量进样。 转化定量法 是将被分析组分在进入检测器之前利用催化剂转化为同一组分(CO2或CH4)。使定量工作简化,特别是当某些组分在检测器上没有响应信号时,或搞不到定量校正因子时,转化定量法的优点就更为突出,常用的转化定量法有:把碳氢化物转化为CO2,把CO, CO2转化为CH4,把水与碳化钙转化为乙炔等。 高效液相色谱法具有以下特点: (1)分离效能高由于新型高效微粒固定相填料的使用,液相色谱填充柱的柱效可达2×103~5×104块/米理论塔板数,远远高于气相色谱填充柱103块/米理论塔板数的柱效。(2)选择性高由于液相色谱柱具有高柱效,并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。因此,高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物及同分异构体,还可分析在性质上极为相似的旋光异构体,并已在高疗效的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要的作用。 (3)检测灵敏度高在高效液相色谱法中使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外吸收检测器,最小检出量可达10-9g;用于痕量分析的荧光检测器,最小检出量可达10-12g。 (4)分析速度快由于高压输液泵的使用,相对于经典液相(柱)色谱,其分析时间大大缩短,当输液压力增加时,流动相流速会加快,完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟。 高效液相色谱法除具有以上特点外,它的应用范围也日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器,样品被分析后,在大多数情况下,可除去流动相,实现对少量珍贵样品的回收,亦可用于样品的纯化制备。 高压液相色谱方法的局限性: 第—,在高效液相色谱法中,使用多种溶剂作为流动相,当进行分析时所需成本高于气相色谱法,且易引起环境污染。当进行梯度洗脱操作时,它比气相色谱法的程序升温操作复杂。 第二,高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器)。近年来蒸发激光散射检测器的应用日益增多,有望发展成为高效液相色谱法的一种通用型检测器。 第三,高效液相色谱法不能替代气相色谱法,去完成要求柱效高达10万块理论塔板数以上,必需用毛细管气相色谱法分析组成复杂的具有多种沸程的石油产品。 第四,高效液相色谱法也不能代替中、低压柱色谱法,在200kPa至1MPa柱压下去分析受压易分解、变性的具有生物活性的生化样品。 综上所述可知,高效液相色谱法也和任何一种常用的分析方法一样,都不可能十全十美, 作为使用者在掌握了高效液相色谱法的特点,应用范围和局限性的前提下,充分利用高效液相色谱法的特点,就可在解决实际任务中发挥重要的作用。 高效液相色谱仪由哪几部分组成? 高压输液泵对高压输液泵的要求是:①泵体能耐化学腐蚀②能在高压下连续工作③输出流量范围宽④输出流量稳定,重复性高 高压输液泵可以分为如下两类: 1.恒流泵恒流泵可输出恒定体积流量的流动相。 2.恒压泵恒压泵又称气动放大泵,是输出恒定压力的泵。 进样装置(一)六通阀进样装置(二)自动进样器 色谱柱 检测器高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件(高压输液泵、色谱柱、检测器)之一,主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓度的变化,并由记录仪绘出谱图来进行定性、定量分析。一个理想的液相色谱检测器应具备以下特征:灵敏度高;对所有的溶质都有快速响应;响应对流动相流量和温度变化都不敏感;不引起柱外谱带扩展;线性范围宽;适用的范围广。可惜至今没有一种检测器能完全具备这些特征。 常用的检测器为紫外吸收检测器(UVD)、折光指数检测器(RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)