分子生物学实验操作方法与技巧（2）

null分子生物学与生物化学实验 操作、设计与技能分子生物学与生物化学实验 操作、设计与技能质粒提取技巧及常见问题分析 李刚 副教授质粒提取技巧及常见问题分析 质粒提取技巧及常见问题分析 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是许多人却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。本次课将告诉大家常见的几种质粒提取的方法、原理、步骤及其技巧，并对质粒提取过程中遇到的常见问题进行分析。分子生物学实验所需基本工具分子生物学实验所需基本工具高效菌株： DH10B，Top10, DH5,XL-1 blue,HB101，BL21 （E.coli）;芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等）；酵母（毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母）等。 各种基因：基因一般位于各种载体（如克隆载体pUC18 和表达载体pET32等）上。 生化试剂：一般多为分析纯，少数为化学纯。 水：最好的是超纯水，其次为三(双)蒸水，最差为去离子水，一般很少用自来水。 高效酶类：限制酶，修饰酶，连接酶，Taq酶，pfu等。 经典的分子生物学工具书：分子克隆（目前出到第三版），精编分子生物学实验指南（目前出到第四版）等。 各种仪器设备：离心机、培养箱、PCR仪、灭菌锅等；基因（质粒）的获取基因（质粒）的获取1、从本实验室或其它实验室（尤其是国外）获得；（首选） 2、从商业公司购买；（次选） 3、自己克隆。（末选） （1）RT-PCR 克隆：需要原始材料。 （2）合成全长基因：采用OE-PCR技术，不需要原始材料，价格昂贵，一般合成1kb基因约需花费5000-6000元，3-4星期时间。 （3）自己合成寡核苷酸引物并拼接：采用OE-PCR技术，不需要原始材料，一般自己合成基因的费用约相当于专业公司合成价格的三分之一至二分之一，所需时间视个人操作技巧。 什么是质粒？ 什么是质粒？质粒是独立于染色体外的DNA分子，其大小范围在１KB至２００KB以上不等。大多数来自细菌细胞的质粒是双链、共价闭合的环状分子，以超螺旋形式存在。 至少在实验室，大多数质粒是通过写信获取而并不需要自己动手构建。所有的质粒，无论来自于商家还是科技工作者，在用于实验以前一定要进行验证（验证的方法一般为酶切、电泳）！ 获得基因（质粒）后的处理方法获得基因（质粒）后的处理方法1、如果得到的是质粒DNA，一般是沉淀在７０％乙醇中的DNA，将其离心并用TE缓冲液（PH８.０）溶解，转化大肠杆菌菌株，从转化子中提取质粒DNA，并进行酶切鉴定和琼脂糖电泳．根据赠予者或发表的文献中所提供的图谱，表交所观察到的条带的大小与预期中是否相符。 2、如果质粒保存在细菌菌株中，通常以真空密闭的冻干粉或涂在无菌滤纸片上来邮寄。将上述菌种取少量，转移到３mL含有合适抗生素的液体培养基中，然后在合适温度下剧烈振荡１８－２４小时。待液体培养物长好后，在含合适抗生素和适当的必要添加物的琼脂糖培养皿中划线培养，于合适的温度保温过夜。检查皿中所有的克隆，确定其在外形和气味上是否与大肠杆菌相同（大肠杆菌一般为酸臭味，外形为规则的圆形、半透明或微透明；酵母土腥味或酒香味，致病菌不要闻！）。然后将分离的克隆进行小规模液体培养，提取质粒，用不同的限制酶消化质粒，并用琼脂糖凝胶电泳。根据赠予者或发表的文献中所提供的图谱，比较所观察到的条带的大小与预期中是否相符。 3、大肠杆菌和酵母菌株必须保存在－70˚C冰箱中，菌种中必须含有15％以上（15％－20％）的甘油。 实验室常用提取质粒的方法实验室常用提取质粒的方法1、碱法提取； 2、煮沸法提取； 3、高纯提取法（Kit）； 4、碱法结合Kit制备法。 5、超快提取法（纯度不高，多用于筛库）；碱法提取质粒的原理碱法提取质粒的原理将细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶液使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐（SDS）包盖。当用钾离子（来自溶液3）取代钠离子时，这些复合物就会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。煮沸法原理煮沸法原理这个方法是将细菌悬浮于含有TritonX-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到１００ C使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是闭环质粒DNA由于具有互相缠绕的拓扑结构而不会分离。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子。离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。 试剂盒提质粒的原理试剂盒提质粒的原理国内外绝大部分的质粒抽提试剂盒使用的都是碱裂解法结合硅胶柱纯化技术。首先利用碱法中的试剂裂解细胞。裂解后的细胞液加入硅胶柱中。硅胶柱中使用了一种特殊的玻璃纤维滤膜，这种滤膜在高离子溶液剂（盐酸胍，NaI, NaClO4）的条件下，可以同核酸发生吸附反应，而在低盐条件下，核酸又可以从滤膜中释放出来，蛋白质和其它杂质不会被吸附，从而达到纯化核酸的目的。硅胶柱将核酸抽提或纯化变成一种简单的过滤操作，以取代传统溶液型抽提技术的离心方式。硅胶柱的过滤吸附操作大大减少了抽提过程中离心和干燥时间，并去除耗时的醇类沉淀过程。此外，硅胶柱还第一次提供了一种高通量的纯化方式，大大加速了各种高通量筛选的科研项目，各种96孔板或384孔板的纯化方式纷纷出现。至目前为止，硅胶柱已经成为目前核酸分离纯化中最主流的技术。提质粒方法的选择提质粒方法的选择从经济的角度讲，碱裂解法是首选，一般不建议用煮沸法，除非获得质粒的目的仅仅是初步的鉴定，而不是用于构建载体。 碱裂解法所获得的质粒经酚：氯仿纯化后可满足绝大多数的分子生物学实验要求。 试剂盒提取的质粒在纯度上比碱法更好，而且更简单、快速，但比较昂贵（随着试剂盒的规模化和国产化，目前绝大多数实验室已能承受其价格）。 我们实验室建立的超快提质粒法一般只适用于大量转化子或质粒文库的快速筛选，一般不作为质粒制备的方法推荐。 结合碱裂解法和试剂盒法，我发展出一种大量制备高纯度质粒的方法，将在本次课的后面介绍。 碱法质粒抽提用到的三种溶液碱法质粒抽提用到的三种溶液溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl，pH 8.0 / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 溶液I的配制溶液I的配制溶液I：50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl，pH 8.0 / 10 mM EDTA，pH 8.0； 配制：1000 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0） 25 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0） 20 ml 20% Glucose（1.11 M） 45 ml ddH2O 910ml 将以上溶液混合装瓶， 15磅（121˚C）高压灭菌15 min 或8磅（116˚C）高压灭菌25 min，冷却后4 ℃保存。 注意：含葡萄糖等糖类的培养基需要过滤除菌或8磅灭菌。0.5M EDTA母液的配制0.5M EDTA母液的配制配制量：1L。 配制方法： 1．称取186.1g Na2EDTA·2H2O置于1L烧杯中。 2．加入800ml的去离子水，置于磁力搅拌器上充分    搅拌。 3．用NaOH调节pH值至8.0（约需20g NaOH），当pH 接近8.0时， EDTA方可完全溶解，加入去离子水 定容至1L。 4．小份分装后，高温高压（121˚C，20分钟）灭 菌，室温保存。溶液II的配制 溶液II的配制 溶液II：0.2N NaOH ， 1% SDS 配制： 500 ml 10% SDS 50 ml 2N NaOH 50 ml(也可用10N NaOH稀释) 取以上溶液，用灭菌去离子水定容至500 ml，充分混匀。室温保存（不需灭菌）。此溶液保存时间最好不超过一个月，最好现用现配。 注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 溶液III的配制 溶液III的配制 溶液 III ：3 M 醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 5.6。 5 M 冰醋酸。 配制：500 ml 醋酸钾 147 g 冰醋酸 57.5 ml 加入300 ml去离子水后搅拌溶解。待醋酸钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至500 ml。高温高压（121˚C，20分钟）灭菌后，4℃保存。TE缓冲液（pH 8.0）的配制TE缓冲液（pH 8.0）的配制10×TE缓冲液（pH 8.0）：100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0) 。 配制：1000 ml 1 M Tris-HCl 缓冲液(pH 8.0) 100 ml 500 mM EDTA (pH 8.0) 20 ml 加入约800 ml的去离子水，均匀混合。溶液定容至1 L。高温高压（121˚C，20分钟）灭菌后，4℃保存。苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)的配制苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)的配制量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡过的苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。 两个常见问题： 1、Tris饱和的酚和水饱和的酚有什么区 别？ 2、配好的苯酚/氯仿/异戊醇为什么会分 层？应该用上层还是下层去纯化DNA？分子生物学常用的苯酚种类分子生物学常用的苯酚种类1、水饱和酚。 水饱和酚又叫水平衡酚。水饱和酚的pH小于7，通常与异硫氢酸胍一起使用，用于细胞RNA的提取，这样DNA在酚相，RNA在水相。两者就分开了。 2、Tris饱和酚。 一般PH大于7.8，用于DNA的提取和纯化。其制作过程如下： （1）冰箱取出重蒸酚，室温放置一会，然后放入68度水浴溶化，切 勿立即放入68度的水浴中，以防玻璃炸裂。 （2）加8－羟基喹啉至0.1％和β－巯基乙醇至0.2％，混匀，溶液呈 现黄色，倒入分液漏斗中（也可在烧杯中进行）。 （3）加入等体积的1M的Tris(pH8.0),反复混匀后，静至分层；放出 下层黄色酚液，弃上层。 （4）加固体Tris约1g/100ml酚，摇匀，去水相。 （5）加0.1M Tris(pH 8.0)平衡数次，至pH为8.0。 （6）加0.1M Tris(pH 8.0)于棕色瓶中4度保存。 注意：无论重蒸酚、水饱和酚还是Tris饱和酚现在均可直接买到，不需自己制备。但不管哪种酚，如黄色消失或呈粉红色，则不能使用。苯酚/氯仿/异戊醇为什么会分层？苯酚/氯仿/异戊醇为什么会分层？因为所用的Tris饱和酚中有水，而水难以与苯酚、氯仿或异戊醇混溶，所以会分成两层。 上层是水相，下面那层淡黄色的液体是苯酚/氯仿/异戊醇的混溶液。DNase－free RNase储存溶液配制 DNase－free RNase储存溶液配制 溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的1 mM的乙酸钠水溶液中（pH 5.2）,使终浓度为10 mg／ml。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。然后在室温下缓慢冷却后，用1 M的Tris－HCl调pH至7.4，小管分装后，置于-20℃贮存。（配制过程中要戴手套）。 质粒提取中所需的其它试剂质粒提取中所需的其它试剂异丙醇、氯仿/异戊醇（24:1）、无水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素贮存液（50 mg/ml或100mg/ml）。 100 mg/ml 氨苄青霉素的配制： 配制量：50ml。 配制方法： 1．称取5g Ampcillin置于50ml塑料离心管中。 2．加入40ml无菌去离子水，充分混合溶解之后定容至 50ml。 3．用0.22μm滤膜过滤除菌，小份分装（1ml一管）后， 置于－20℃保存。溶液I的作用分析溶液I的作用分析 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2 +和Mg2+ 等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 溶液II的作用分析溶液II的作用分析轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。 注意：往菌液中加入溶液II是碱法提质粒的关键步骤甚至是决定步骤，假如这一步失败了，就不用继续下面的步骤了，可以停下来准备下一次质粒提取实验了。 思考题：如何判断这一步是成功还是失败呢？溶液III的作用分析溶液III的作用分析每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。细菌的收获和裂解（1） 细菌的收获和裂解（1） 细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。 (1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用温和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液[50mM Tris-Cl(pH8.0), 10% (m/V 蔗糖)]中，然后用溶菌酶和EDTA进行处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。 (2)可用普通的碱裂解法或更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。 (3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。 故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。 细菌的收获和裂解（2）细菌的收获和裂解（2）(4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA 株，如HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。 (5)目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。 质粒DNA的纯化 质粒DNA的纯化 常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。 除极少数特殊用途的质粒纯化需要用到密度梯度纯化方法外，大多数实验室用途的质粒的纯化可以用质粒纯化试剂盒或聚乙二醇方法纯化。聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA一般用不到，这里不列出。 聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA: (1)将核酸溶液所得]转入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于4℃下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。 (2）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10 000转/分离心10分钏， 回收沉淀的核酸。 (3）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管倒置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。 (4）用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。 (5）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟，以回收质粒DNA。 (6）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。 (7）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。 (8）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。 (9）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。 10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE（pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－20℃。 如果后续实验需要较纯的质粒DNA，强烈推荐直接用Kit提取质粒DNA，或使用碱法抽提与质粒提取试剂盒相结合的方法来纯化质粒。质粒DNA的碱裂解法小量制备（1）质粒DNA的碱裂解法小量制备（1） （一）细菌的收获和裂解 1．收获 1）将2ml含相应抗生素的ＬＢ加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜。 2）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。 3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。 质粒DNA的碱裂解法小量制备（2）质粒DNA的碱裂解法小量制备（2）2．碱裂解 1）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液Ｉ中，剧烈振荡。 须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡（用Votex），可使沉淀迅速分散。 含糖培养基的灭菌方法： 1、8磅压力下（116 C ）灭菌25分钟[普通培养基一般是15 磅压力下（121C ）灭菌20分钟]。 2、配1M的葡萄糖母液，0.22 µm口径的过滤器过滤除菌并储 存在4 C 。然后加入灭菌后的培养基中稀释到终浓度。 质粒DNA的碱裂解法小量制备（3）质粒DNA的碱裂解法小量制备（3）2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。 盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面 均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。 3）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ。 盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后 将管置于冰上3－5分钟。 质粒DNA的碱裂解法小量制备（4）质粒DNA的碱裂解法小量制备（4）4）用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。 5）可做可不做：加等量酚：氯仿， 振荡混匀， 用微量离心机于4 ℃以12000g离心 2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。 6）用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合， 于室温放置2分钟。 7）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。 8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。 9）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。 i.此法制备的高拷贝数质粒（如Ｘf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3－5μg。 ii．如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶， 在适宜温育1－2小时。将剩余的DNA贮存于－20℃。 iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物。 质粒DNA的煮沸法小量制备 质粒DNA的煮沸法小量制备 1）将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。 STET 0.1mol/L NaCL 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 5% Triton X-100 2）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。 3）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。 4）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。 5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。 6）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。 7）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。 8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。 9）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g离心2分钟。 10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2－5）分钟。 11）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。 注：当从表达内切核酸酶Ａ的大肠杆菌株（endA 株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下温育时质粒DNA可被降解。 在上述方案的步骤9）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。 碱裂解法提质粒中常见问题及可能原因 碱裂解法提质粒中常见问题及可能原因 碱裂解法和煮沸法都极其可靠，重复性也很好，而且一般不会遇到麻烦。但我仍然强烈推荐碱裂解法而一般不要用煮沸法。多年来，在我们实验室中日常使用碱裂解法的过程中，只碰到过以下几个问题： (1)有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果问题依然存在，可用离心柱层析法（Kit）纯化DNA。 (2)在十分偶然的情况下，有些人的制备物会出现无质粒DNA的现象。这多数情况下是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去，有时是因为试剂配制有问题（如成分、浓度或pH错误等）。 (3)提取的质粒DNA呈涂布状或弥散状(Smear状)：操作过程中用力过猛，动作过大或操作过程中试剂被污染。质粒DNA的大量碱裂解法制备 质粒DNA的大量碱裂解法制备 参见分子克隆相关章节，具体步骤此处略。 与小量制备法大同小异，基本上相当于小量制备法的按比例放大。 碱法和试剂盒联合大量制备 质粒DNA的方法 碱法和试剂盒联合大量制备 质粒DNA的方法 碱裂解法大量提取质粒DNA时，质粒中常常含有较多的杂质，而使得质粒无法应用于一些对质粒纯度要求很高的后续研究中。而小量提取质粒的试剂盒虽然提取的质粒纯度很高，但每个柱子只能提取1.5-3mL菌液中的质粒DNA，所得到的质粒DNA量较少（最多只有几μg），也无法满足某些后续研究的需要，而且也造成了试剂盒柱子中膜的DNA结合能力的浪费（可结合多达20-30μg DNA）。尽管目前已有很多公司可以提供专门用来大量提取质粒的试剂盒（如QIAGEN Plasmid Maxi Kit），但这类试剂盒常常价格较贵，而且使用次数很少（通常1-5次）。因此作者结合碱裂解法和小量提取质粒的试剂盒，发展了一个大量制备高纯度质粒DNA的方法。操作步骤 （1）操作步骤 （1）1、简易的碱裂解法大量提取质粒DNA： （1）挑取单菌落，接种于30ml含有相应抗生素的LB培养基中，震荡培养至对数晚期（OD600=0.6）。取25ml培养物转入500ml含抗生素的LB培养基中，于37˚C震荡培养至OD600=0.4-0.8。 （2）4˚C，5000rpm离心10分钟收集菌体，弃上清，加入15ml溶液I，充分重悬，加入1.5ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/mL），混匀。 （3）加入30mL新配的溶液II，颠倒离心管数次以充分混匀内容物，室温放置10分钟。 （4）加入20mL用冰预冷的溶液III，混匀后冰浴放置10分钟。然后于4˚C，5000rpm离心15分钟，取出上清，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟后，除去异丙醇。 操作步骤 （2）操作步骤 （2）2、接着，使用小量提取试剂盒（以QIAGEN公司的QIAGEN Plasmid Mini Kit为例）进行质粒的纯化： （1）大致估计上述异丙醇沉淀得到的质粒DNA的量，并决定所使用的QIAprep Spin柱子的数量。（上述方法制备的质粒DNA的量通常为0.5-5μg/mL，视质粒DNA的大小及性质而异。而每个柱子中的膜可以吸附高达20-30μg的质粒DNA，为了节省柱子，并增加所提DNA的纯度，通常我们用8-16个柱子吸附来自500mL菌液的质粒DNA。而用2-4个柱子吸附来自50mL菌液的质粒DNA。） （2）每个柱子需要使用250μlBuffer P1来溶解上述的质粒沉淀。根据柱子的数量，采用相应数量的Buffer P1（要确保RNase A已经被加入Buffer P1中）充分溶解异丙醇沉淀所得质粒DNA。 （3）每250μl质粒溶液转入一个1.5mL的微量离心管中。 （4）每个微量离心管中再加入250μl Buffer P2,并且轻轻翻转离心管4-6次以混匀溶液。 （5） 加入350μl Buffer N3,立即轻柔地翻转离心管4-6次。 （6）室温13000rpm离心10分钟。 （7）小心吸出上清液，加入一个QIAprep Spin柱子中。 （8）13000rpm室温离心1分钟。 （9）加入750μlBuffer PE到柱子中，13000rpm离心1分钟以洗涤柱子。 （10）弃去滤过液，13000rpm再离心1分钟以除去残余的液体。 （11）放QIAprep柱子到一个干净的1.5ml离心管中，加入200μl Buffer EB到柱子中 心，室温放置1分钟后，以13000rpm离心1分钟。 （12）将滤过液吸到一个干净的1.5mL离心管中，储于-20℃冰箱中。 质粒的超快提取法质粒的超快提取法 本方法极为快速和简便，可用于从cDNA文库或转化实验中高通量地筛选大量重组子，尤其适于鉴定没有蓝白斑反应的高拷贝重组载体，例如pDNR-LIB, pPICZαA等。此外，这个方法也适于从细菌培养物中抽提质粒。仅仅需要两个步骤（NaOH溶解和离心）、总共12-15分钟就可以从12个样品抽提出质粒DNA。虽然该方法所制备的质粒DNA纯度较差，但在中和后仍然可以满足大部分的分子生物学操作，例如酶切、连接和转化。 实验细节详见以下这篇论文： Bingxue Dong, Lan Ouyang, Liang Qin, Gang Li*. A rapid and simple method for screening large numbers of recombinant DNA clones. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, 2007, 15, 244-252.实验原理实验原理使用NaOH快速裂解细胞，离心后含有质粒的裂解液直接用来电泳。以未连接外源DNA的质粒作为对照，则重组质粒由于携带外源DNA而在凝胶电泳的时候迁移率变慢，与对照相比在凝胶上电泳条带中呈现后退。据此可判断哪些克隆是重组质粒。如果该方法用于提取质粒DNA，则在NaOH裂解细胞后，需要用0.1 M HCl中和裂解液，所得质粒DNA才可以用于酶切和连接、转化等后续操作。实验步骤实验步骤本方法可以用于从cDNA文库平板上的重组克隆中快速提取质粒DNA并筛选重组克隆，也可以从细菌培养液中快速制备质粒DNA。下面就上述两种应用分别介绍其操作步骤： 1、从平板上的重组克隆中提取质粒DNA。 以应用该方法筛选人肝脏Uni-ZAPXR cDNA文库平板中的重组克隆为例，介绍其操作步骤： （1）将人肝脏Uni-ZAPXR cDNA文库涂布平板，37˚C培养16-18小时，待菌落长至1-2mm，用牙签随机挑取单菌落重悬于20μl 0.2 N NaOH中。 （2）加入 1μl RNase（10μg/μl）,37˚C 处理7分钟，消化RNA。 （3）13000rpm离心3min，上清液即为质粒DNA溶液。 （4）上清液中加入40μl 0.1 M HCl，轻轻混合均匀（注意：如果该质粒DNA后面需要进行酶切，则需要进行此中和步骤。如果提取质粒DNA的目的只是鉴定重组克隆，则此中和步骤可省略）。 （5）取上清液，加入适量溴酚蓝或者loading buffer, 在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳。凝胶两端点样孔中加同样处理的空载体质粒作为对照。 （6）电泳后，质粒DNA条带滞后于对照条带的，则很可能是携带外源DNA片段的重组质粒，可以进行进一步的酶切鉴定。实验步骤实验步骤2、从细菌培养液中提取质粒DNA。 仍以应用该方法筛选人肝脏Uni-ZAPXR cDNA文库平板中的重组克隆为例，介绍其操作步骤： （1）将人肝脏Uni-ZAPXR cDNA文库涂布平板，37˚C培养12-16小时，待重组克隆长出后，用牙签随机挑取需要鉴定的单菌落，分别接种于含有100 μg/μL氨苄青霉素 (Amp)的LB培养基中培养至对数生长后期（OD600约为0.6），然后取200μl 培养液，10000 rpm 离心30秒。 （2）用40μl 0.2 N NaOH充分重悬细胞沉淀，然后加入 1μl RNase（10μg/μl）,37˚C 处理7分钟，消化RNA。 （3）13000 rpm离心3min，上清液即为质粒DNA溶液。 （4）上清液中加入40μl 0.1 M HCl，轻轻混合均匀（注意：如果该质粒DNA后面需要进行酶切，则需要进行此中和步骤。如果提取质粒DNA的目的只是鉴定重组克隆，则此中和步骤可省略）。 （5）取上清液，加入适量溴酚蓝或者loading buffer, 在0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳。凝胶两端点样孔中加同样处理的空载体质粒作为对照。 （6）电泳后，质粒DNA条带滞后于对照条带的，则很可能是携带外源DNA片段的重组质粒，可以进行进一步的酶切鉴定。 超快提质粒法电泳图片 超快提质粒法电泳图片该方法的操作要点 该方法的操作要点 1、这个方法筛选重组子的关键是看所提质粒DNA在同等电泳条件下迁移率的不同，因此电泳时一定要在凝胶两端加上同样处理的空载体作为对照。 2、该方法所提质粒DNA中含有NaOH，如果没有上述第4步的中和步骤，则无法进行酶切。质粒提取试剂盒（Kit）的选择质粒提取试剂盒（Kit）的选择最佳选择：Qiagen、GE、Invitrogen、Promega。但价格约是同类国产品牌的3-8倍。这些品牌是世界各地研究人员公认的最好的几种核酸纯化品牌。 性价比较高的选择： Omega公司（飞扬代理）和U－gene的性价比最高。价格比国产的同类试剂盒稍贵，但质量接近国外试剂盒。不过，上述两个公司的产品质量最近有所下降。 其它牌子还有天耕（Tiangen）、生工、三博远志 等，效果通常也可以，但有时质量不太稳定。 如果是一般实验就用国产的Kit，如果是重要实验就用Qiagen等国外的Kit。 null