凝结芽孢杆菌芽孢形成液体培养基的研究

杭州食品科技 2003年第 4期 总第 71期 · 5 · 摘要：本文对一株具有疗效作用的同型乳酸发酵菌——凝结芽孢杆菌 TO．33的产芽孢培养基 进行了研究。该菌徕在普通液体培养基中通常不形成芽孢。而在所的一种含Mnz (50ppm) 的液体培养基中，可产生 7．5×10 C兀J／rnl以上的芽孢(活菌计数)，占总菌效的 52--58％。 关键词 ：凝结芽孢杆菌 芽孢形成 引 言 本院微生物教研室采用Kitahara& Suzuki培养基⋯1。从脱脂奶粉中分离到一株同型乳酸 发酵的凝结芽孢杆菌 TQ33。将该菌的芽孢作为活性因子，经小范围人体服用试验明，它对 常见的肠道疾病如：慢性结肠炎、腹泻及便秘等均有明显的疗效。与普通乳酸菌相比，TQ33 的优势在于能形成耐热性和耐酸性较强的芽孢，因而适于向需经加热的食品中添加，并且。其 芽孢作为活性因子耐受胃酸顺利到达肠道并定植存活的能力也较强。 虽然 TQ33在多种固体培养基上形成芽孢良好，但在普通液体培养基中却不能形成芽孢。 由于固体培养的局限性必将妨碍其扩大生产及其实际应用，因此，寻找适于TQ33的液体培养 产芽孢条件。对奠定该菌制剂的工业化生产具有一定现实意义。 材料与方法 1．菌种 凝结芽孢杆菌TQ33(Bacillus Coagulans TQ33)，本院微生物教研室选育。 2．培养基 TQ33芽孢形成液体培养基：酵母膏 1．O％，蛋白胨 1．O％，MnSO4 50ppm，K2HPO4 0．2％． 葡萄糖 0．6％，MgSo4·7I-t,_0 0．1％，pH7．0 维普资讯 http://www.cqvip.com · 6 · 杭州食品科技 2003年第 4期 总第 71期 麸皮琼脂培养基：蛋白胨 2g，酵母膏 0．3g，葡萄糖 0．2g，琼脂 2g，麸皮水 100ml，pH7．0— 7．2。(麸皮水：5g麸皮加水 100ral，小火煮沸 1小时，纱布过滤。) 麸皮液体培养基：除不加琼脂外，成分同麸皮琼脂培养基。 淡薄培养基[2l，玉米粉——酵母膏培养基[2l，TAM培养基[3l，加淀粉的TAM 培养基[3l， 芽孢形成培养基[ ，补充锰的营养琼脂培养基[6]6，普通营养琼脂培养基，Nakayama培养基[6]6。 3．方法 (1)培养条件 固体培养基上芽孢形成的培养：取一环斜面活化菌种接入5ml麸皮液体培养基中，40℃静 置培养24小时，取0．5ml培养液涂布于待测芽孢形成固体培养基平板上，40℃培养。 液体培养基中芽孢形成的培养：取一环斜面活化菌种接入 TQ33芽孢形成液体培养基中 (250rrd三角瓶装 15—50rrd培养基)，40—50℃振荡培养(140rpm)或静置培养。 (2)总菌数及耐热芽孢数的测定 采用淡薄培养基，40℃培养48小时，计平板菌落数从而算得培养液的总菌数。芽孢数的 测定，是将培养液经 80℃加热处理 10分钟，然后以同样的方法进行平板活菌计数。 结果与讨论 (一)固体培养基上芽孢形成的观察 对多种固体培养基进行了实验，结果见表 1。 表 1 TQ33在不同固体培养基上芽孢形成情况 注：一表示无芽孢；+表示有个别芽孢 ；++表示有少量芽孢 (<10％)；+++表示有大量芽孢 ；／未观察 由表 1可以看到，对TQ33芽孢形成有利的固体培养基有：淡薄培养基、TAM培养基、加 淀粉的TAM培养基、补充锰的营养琼脂培养基，其次为麸皮琼脂培养基及玉米粉酵母膏培养 基，而TQ33在芽孢形成培养基上不形成芽孢。 (二)产芽孢液体培养基的设计 1．液体培养基中芽孢形成的观察 采用与上述产芽孢较好的固体培养基相同配方(除不添加琼脂外)的液体培养基以及 Nakayama培养基进行产芽孢实验。发现 TQ33在 TAM液体培养基，经振荡培养能产生大量 芽孢，耐热芽孢占总菌数的41％。而在其它几种液体培养基中，无论是静止培养还是振荡培 养，都未观察到有芽孢形成。 维普资讯 http://www.cqvip.com 杭州食品科技 2003年第 4期 总第 7l期 ·7 · 2．芽孢形成液体培养基的初步设计 采用TAM液体培养基，经振荡培养，可形成一定量的芽孢，但再现性差。调整TAM培养 基组分，特别是采用不同氮源代替 TAM培养基中的麻蛋白胨，经大量试验发现，用蛋白胨代 替豚蛋白胨，用蛋白胨代替麻蛋白胨能获得一定数量的芽孢，并且重复性较好。初步设计的 TQ33芽孢形成液体培养基配方为：蛋白胨 0．5％，酵母膏 0．5％，葡萄糖 0．3％，K2．HPO 0， 1％ ，MnSO450ppm，MgSO4。7I-tl00．05％。 3．芽孢形成液体培养基各组分对芽孢形成的影响 为确定液体培养基各组分对芽孢形成的影响，选用正交表 L】8(3 )，进行六因素三水平正 交试验。4O℃振荡培养 72小时，测定总菌数及耐热芽孢数，计算耐热芽孢数占总菌数的百分 比。实验设计及结果分析见表2、表 3及表 4。 表 2 因素与水平表 表 3 Ll8(3 )正交试验设计及试验结果表 耐热芽孢数／ 试验号 A B C D E F 空白) 总菌数( ％) l 0 0．5 0．6 0 0 0．05 0 2 0 0 0．3 0．1 50 0 0 3 0 1．0 0 0．2 l00 0．1 1．22 4 0．5 0．5 0．6 0．1 50 0．1 2．92 5 0．5 0 0．3 0．2 100 0．05 0 6 0．5 1．0 0 0 0 0 0 7 l_0 0．5 0．3 0 100 0 O 8 1．0 0 0 0．1 0 0．1 0 9 1．0 1．0 0．6 0．2 50 0．05 37．7 l0 0 0．5 0 0．2 50 0 7．75 ll 0 0 0．6 0 l00 0．1 0 l2 0 1．0 0．3 0．1 0 0．05 0．3 l3 0．5 0．5 0．3 0．2 0 0．1 l0．32 l4 0．5 0 0 0 50 0．05 0 l5 0．5 1．0 0．6 0．1 l00 0 l0．0 l6 1．0 0．5 0 0．1 l00 0．05 0 l7 1．0 0 0．6 0．2 0 0 0 18 1．O 1．0 0．3 0 50 1．0 21．13 I i 9．27 20．99 50．62 21．13 l0．62 38 Ⅱ； 23．24 O 31．75 l3．22 69．5 l7．75 ∑yi=91 ． 34 Ⅲ； 58．83 70．35 8．99 56．99 l1．22 35．59 Q 681．17 898．28 6o8．48 644．85 844．82 5o4．29 P=463．5 S 217．67 434．78 144．98 181．35 381．32 4079 维普资讯 http://www.cqvip.com · 8 · 杭州食品科技 2oo3年第4期 总第 71期 表4 Ll8(3’)方差分析结果 方差来源 平方和 自由度 均方 F 显著性 A 217．67 2 108．84 1．85 △ B 434．78 2 217．39 3．7O (*) E 381．32 2 190．66 3．24 (*) C 144．98 2、 I D 181．35 2 l 58．83 F 40．79 2}¨ 误差 280．05 5 总和 1680．94 17 注：(*)表示影响较显著 ；△表示有一定影响 由方差分析结果可知，酵母膏(B)、MnSO4(E)对芽孢形成有较显著的影响，蛋白胨 (A)有 一 定影响。在实验范围内BEA的最优水平组合为 B3E2A2，即：酵母膏 1．0％，MnSO450ppm， 蛋白胨 1．0％。根据方差分析结果，葡萄糖、K2吼 、MgSO4·7H20对芽孢形成的影响很小， 原则上可任意取值。但试验发现，缺乏碳源(葡萄糖)时，细胞增殖缓慢且总菌数低，因而芽孢 总数也不可能达到较高的数量。考虑到这一原因，按表 3中三个水平的最大值取葡萄糖 0． 6％。对 K2HPO4及 MgSO4·7H20也取三个水平中的最大值。因此，芽孢形成液体培养基的 最佳配方为：酵母膏 1．0％，MnSO450ppm，蛋 白胨 1．0％，葡萄糖 0．6％，K2HPO40．2％，Mg— SO40．1％。 关于 Mn2+能否促进芽孢形成的报道并不一致。Rowe等(1975)[’]认为，Mn2 并非 B． Stearothermophilus形成芽孢所必需的微量元素；而 Anderson等 (1972) J及 Cheung等 (1982)[9]的研究结论正好相反。本实验结果表明，Mn2 有促进 TQ33菌株形成芽孢的作用， 这与Yokata等(1981)t~o3的报道相一致。他们认为 Mn2 能促进 Bacillus野生株及突变株开始 形成芽孢并合成D一葡萄糖脱氢酶(GLD，D—glucose dehydrogenase)。GLD是一种只与芽孢 形成有关的酶，存在于前孢子中，目前尚未在母细胞中发现。．该酶的合成被认为是芽孢形成过 程中一系列生化反应的特征标志之一。 (三)温度和通风量对芽孢形成的影响 在4O℃、45'E、50℃三个温度下，以250ml三角瓶分装 15、25、35、45ml培养基，对 TQ33 的芽孢形成情况进行试验。以转速 140rpm振荡培养 72小时，测定结果见表 5、6、7。 表 5 40℃时不同通风量对芽孢形成率的影响 维普资讯 http://www.cqvip.com 杭州食品科技 2003年第 4期 总第 71期 ·9 · 表6 45"C时不同通风量对芽孢形成率的影响 装液量(rra) 总菌数(C J／rn1) 芽孢数(CFu／rn1) 芽孢数／总菌数(％) 由表 5、6、7可知，温度对 TQ33的芽孢形成有显著影响。 在 40～50℃范 围内，TQ33的芽 孢形成率随温度升高而递增。在 4o、45℃条件下，菌体主要以营养 体形式存在，芽孢形成率较低；而 在 50℃条件下，芽孢形成率可达 到 57．7％。另外，从表中数据可 知，通风量对 TQ33的芽孢形成 率也有影响，，I、Q33的芽孢形成率 随通风量的减小而递增。在 50℃ 条件下，当装液量由 35 变为 45 时，芽孢形成率由 33．1％突 增到 57．7％。由实验结果说明， 在较高温度和通气不良的条件 下，芽孢菌属的细菌以形成芽孢 的形式抵抗不良环境而生存。为 此，选择培养温度 50℃，三角瓶装 液量 45 ，为 TQ33菌株产芽孢 的最适条件。 (四)TQ33在芽孢形成培养 基中的生长及 芽孢形成曲线 ， ， 维普资讯 http://www.cqvip.com · 1O · 杭州食品科技 2003年第4期 总第7l期 在TQ33形成芽孢的最适条件下，以时间为横坐标，总菌数、耐热芽孢数、pH值为纵坐标 ， 得到图1。从图1中曲线可知，耐热芽孢的数量在菌体生长的对数后期迅速增加 ， 当进入稳定 期时仍缓慢增长，在培养60小时时，达到最大值(8．0×10 CFU／m1) ， 占总菌数的 52．1％，而 后基本保持不变。pH在菌体生长的开始阶段，变化较小，但在 12至 24小时之间 ，pH迅速上 升至 7．4，至 72小时时，pH达 7．5。 结论 凝结芽孢杆菌TQ33在本文所设计的芽孢形成液体培养基中，于 50"C振荡培养 ， 耐热芽孢数 可达8．O×10 CFU／ral，约占总菌数的 52％。Mn2 对 TQ33芽孢形成有明显促进作用 ，不含 Mn2 的液体培养基中未观察到芽孢形成。 参考文献(略) 维普资讯 http://www.cqvip.com