纸色谱法实验报告

纸色谱法实验 篇一:纸层析法分离氨基酸实验报告 前言 纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂;也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜确定斑点位置。根据组分移动距离(Rf值)与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸 作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。 在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。在 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液(石油醚)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法 能清楚地将叶绿体中的色素分离。 图1 叶绿素的分离 氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61,，在饮料工业占30,，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的 比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: (1)在食品行业的应用 (2)在医药工业的应用 (3)在饲料添加剂行业的应用 (4)在化妆品行业的应用 (5)在农业上的应用 (6)在其他行业的应用 氨基酸工业还有着广阔的发展前景: (1)传统的氨基酸生产方法 (2)运用基因工程手段生产氨基酸 (3)大力发展药用中间体,具体为: ?氨基酸及其衍生物逐渐成为药用中间体 ?非天然氨基酸是合成活性药物的重要原料 ?生产高附加值的非天然氨基酸 一、实验目的 (1)掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包 括点样、平衡、展层、显色)。 (2)学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方 法。 二、实验原理 (1)纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟 基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流过固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。 (2)溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值示。 (3)Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。 (4)在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。材料与方法 三、实验装置与试剂 (1)氨基酸液(1mg/ml) 亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。 (2)80%甲醇 (3)0.1%茚三酮丙酮溶液 (4)氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL) (5)正丁醇 实验仪器 (1)新华滤纸×1 (2)培养皿×1 (3)电热鼓风干燥箱×1 (4)吹风机×1 (5)毛细管×4 (6)针、线、尺×1 (7)钟罩(高约430mm,直径约290mm，具磨口塞)×1 实验操作 (1)滤纸 选用国产新华 1号滤纸， 6cm×7cm。在距滤纸2cm处划线，用 铅笔在线上标上四个点作为点样位子(留出缝线空间)。 (2)点样 点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。 将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。 (3)展层 将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 (注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置。 酸溶剂系统: 正丁醇: 80%甲酸:水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度25?，时间1h。 注意:使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。 (4)显色 待展层基本结束后, 置65?鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。 (5)Rf值的计算 篇二:气相色谱法实验报告 实验五—气相色谱法实验 气相色谱法实验 一、 实验目的 1.了解气相色谱仪的各部件的功能。 2.加深理解气相色谱的原理和应用。 3.掌握气相色谱分析的一般实验方法。 4.学会使用FID气相色谱对未知物进行分析。 二、 实验原理 1.气相色谱法基本原理 气相色谱的流动向为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。气相色谱仪器框图如图1所示: 图1.气相色谱仪器框图 仪器均由以下五个系统组成: 气路、进样、分离、温度控制、检测和记录系统。 2.气相色谱法定性和定量分析原理 在这种吸附色谱中常用流出曲线来描述样品中各组分的浓度。也就是说，让分离后的各组分谱带的浓度变化输入换能装置中，转变成电信号的变化。然后将电信号的变化输入记录器记录下来，便得到如图2的曲线。 它表示组分进入检测 器后，检测器所给出的信号随时间变化的规律。它是柱内组分分离结果的反映，是研究色谱分离过程机理的依据，也是定性和定量的依据。 图2.典型的色谱流动曲线 3.FID的原理 本次试验所用的为氢火焰离子化检测器(FID)，它是以氢气和空气燃烧的火焰作为能源，利用含碳有机物在火焰中燃烧产生离子，在外加的电场作用下，使离子形成离子流，根据离子流产生的电信号强度，检测被色谱柱分离出的组分。 三(实验试剂和仪器 (1)试剂:甲醇、异丙醇、异丁醇 (2)仪器:气相色谱仪带氢火焰离子化检测器(GC-2014气相色谱仪); 氢-空发生器(SPH-300氢气发生器)、氮气钢瓶;色谱柱; 微量 注射器。 四(实验步骤 1. 打开稳定电源。 2. 打开N2钢瓶(减压阀)，以N2为载气，开始通气，检漏;调整柱前压约 为0.12MPa。 3. 调节总流量为适当值(根据刻度的流量表测得)。 4. 调节分流阀使分流流量为实验所需的流量。 5. 打开空气、氮气开关阀，调节空气、氮气流量为适当值。 6. 根据实验需要设置柱温、进样温度和FID检测器温度。本实验柱温的初 始温度恒温。气化室及检测器温度设定，一般比柱温高50~100?。 7. 打开色谱工作站，设定相关参数。 8. 待仪器稳定后，进样分析，注意进样量，1μ L左右。 9. 峰记录与处理，微机化后自动获得积分面积、高、保留时间等数据。 10. 实验结束后首先调节柱温到室温，调节氢气、空气流量为零，随后关闭 氢-空发生器，待柱温降到室温后关闭色谱仪，最后将氮气钢瓶关闭。 五(数据记录和处理 用气相色谱法对未知混合物进行气相色谱测定，可得其色谱图如图3所示: 2.341/2386957 uV(x1,000,000)2.622/1451103 2.833/7671 图3.未知混合物的气相色谱图 将未知物与标准溶液对照，发现未知混合物的色谱图与异丙醇和异丁醇的气相色谱图标准溶液相吻合，第一个峰:停留时间2.341与异丙醇接近，第二个峰停留时间2.622，与异丁醇接近。可推断该混合物为异丙醇和异丁醇的混合物。 篇三:实验三__纸色谱 实验三 纸色谱 一、实验原理、方法、 1、原理 纸层色谱为在纸上将混合物进行分离的色谱方法，分为分析型和制备型纸层色谱。多数 情况下，纸层色谱的原理属于分配色谱原理，色谱滤纸为支持剂，滤纸纤维可以吸附25%, 30%的水分，其中6,7%的水分和滤纸结构中的羟基以氢键结合，为固定相。其他溶剂可 自由通过，为流动相。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断 分配而得到分离。物质被分离后在纸 色谱图谱上的位置用Rf值(比移值)来表示: Rf值 = 原点到色谱点中心的距离/ 原点到溶剂前沿的距离 在一定条件下某种物质的Rf值是常数，其大小受物质的结构、性质、溶剂系统物质组 成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等多种因素影响。此外，样品中的盐分、其他杂质 以及点样过多均会影响的有效分离。但由于影响比移值的因素较多，因而一般采用在相同实 验条件下与对照物质对比以确定其异同。作为药品的鉴别时，供试品在色谱中所显主斑点的 颜色(或荧光)与位置，应与对照品在色谱中所显的主斑点相同。作为药品的纯度检查时， 可取一定量的供试品，经展开后，按各药品项下的规定，检视其所显杂质斑点的个数或呈色 (或荧光)的强度。作为药品的含量测定时，将主色谱斑点剪下洗脱后，再用适宜的方法测 定。 无色物质的纸色谱图谱可用光谱法(紫外光照射)或显色法鉴定，氨基酸纸色谱图谱常 用茚三酮显色法鉴定。纸层色谱适用于极性较大的亲水性化合物或极性差别较小的化合物的 分离。 2、实验方法 之饱和，一般可在展开室底部放一装有规定溶剂的平皿或将浸有 规定溶剂的滤纸条附着在展 开室内壁上，放置一定时间，俟溶剂挥发使室内充满饱和蒸气。然后添加展开剂使浸没溶剂 槽内的滤纸，展开剂即经毛细管作用沿滤纸移动进行展开，展开至规定的距离后，取出滤纸， 标明展开 剂前沿位置，俟展开剂挥散后按规定方法检出色谱斑点。 (2) 上行法 点样方法同下行法。展开室内加入展开剂适量，放置俟展开剂蒸气饱和后，再下降悬钩， 使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm,展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上升，除另有规定外， 一般展开至约15cm后，取出晾干，按规定方法检视。 展开可以向一个方向进行，即单向展开;也可进行双向展开,即先向一个方向展开,取出， 俟展开剂完全挥发后，将滤纸转动90?,再用原展开剂或另一种展开剂进行展开;亦可多次展 开、连续展开或径向展开等。 3、注意事项 [1] 层析纸使用前，应在烘箱中干燥，具体方法为100度的温度下，烘1~2小时。否则会 产生拖尾现象。 [2] 画线时只能使用铅笔，不能使用其它的笔。其它笔的颜色为 有机染料，在有机溶剂中 染料溶解，颜色会产生干扰。 [3] 无论是画线还是点样，不能用手接触层析纸前沿线以下的任何的部位，因为，手指上 有相当量的氨基酸，并足以在本实验方法中检出干扰实验。 [4] 纸层析须在密闭容器中展开。加入展开剂后，再等20分钟左右，使标本缸内形成此 溶液的饱和蒸汽。 [5] 喷有显色剂的层析纸，在烘干时应注意温度的控制，温度太高，不但氨基酸会产生颜 色，茚三酮也会产生颜色干扰实验现象。 [6] Rf值随分离化合物的结构，固定相与流动相的性质、温度以及纸的质量等因素而变化。 当温度、滤纸等实验条件固定时，比移值就是一个特有的常数，因而可作定性分析的依据。 二、实验——用纸色谱法分离氨基酸 (一)实验目的 通过对氨基酸的分离，学习运用纸色谱法分离混合物的基本原理，掌握纸色谱的操作方 法。 (二)药品和仪器 1(仪器 层析缸毛细管(内径为0.5mm) 层析纸 喷雾器 7.5cm×15cm标本缸 新华1号(5×14cm。)直尺、 铅笔 2(试剂 0.1,甘氨酸水溶液 0.1,亮氨酸水溶液 0.1,茚三酮乙醇溶液 正丁醇 甲酸 未知液 (三)实验原理 (参见本节一、1、) (四)实验步骤 1、层析纸的准备: 将活化[1]的一张5×14厘米的层析纸条，在离底边1.5厘米处用铅笔[2]画一直线作为始 线，在起始线上点A、B、C三个点，各点之间的距离为1.5厘米，A、C两点分别离层析纸 边为1厘米，在起始线7厘米处画一直线作为溶剂前沿线[3]。见图5。 2、点样。 取内径约0.5mm的毛细管三小段，分别插入试样溶液中，借毛细虹吸现象吸取溶液少 许，在A上点甘氨酸溶液，B上点未知液，C上点亮氨酸溶液，样点的直径约2,3mm，如 溶液太稀，第一次点样，吹干后，再点第二、第三次，每次都要点在同一位置上。 3、展开: 将30毫升展开剂(正丁醇:甲酸:水/5:3:2)倒入层析缸中，盖上盖子，饱和20分 钟后[4]，再将点好样品的层析纸上端用回形针别住，把层析纸悬挂在层析缸盖的钩上，使层 析纸的底边浸入展开剂0.5厘米，如图9所示。展开剂到达前沿线后，展开完毕，取出层析 纸，晾干或红外灯下烘干。 4、显色: 将烘干的层析纸，用喷雾器喷洒显色剂(茚三酮溶液)，再到红外灯下烘到显色为止[5]。 5、计算各氨基酸的Rf值: 用笔画出斑点，找出斑点的中心距离，并量出起始线至斑点中心的距离，如图6所示。 根据下列公式计算各氨基酸的Rf值，并将纯样品和未知样品的Rf值进行对照，鉴定未液[6]。 图5 层析纸的准备图 6斑点 图9展开1,层析缸 2,层析纸 3,展开剂 Rf?起始线至斑点中心的距离 起始线至溶液前沿线的距离 图 7 层析纸的操作 (五)思考题 1、展开剂的液面高出滤纸上的样点，将会产生什么后果 2、纸色谱为什么要在密闭的容器中进行, 3、根据亮氨酸[(CH3 )2CH2CH(NH2)COOH]与谷氨酸[HOOCCH2CH2CH(NH2)COOH]的结构式判断何者Rf值大? 为什么, 4、纸层析中影响Rf值的因素有哪些, 5、简述薄层色谱的基本原理和主要应用。