蔗糖合成酶活性测定

蔗糖合成酶活性测定 蔗糖合成酶 1 .粗酶的制备:取30-40粒籽粒，去壳(滤纸上进行)，将其放入预冷的研钵中， ?。用移液管吸取3-5ml 100mmol/L的将研钵置于盛有冰块的盆中，保持0 Tricine-NaoH，研磨成糊状，然后转移至5ml的离心管中，在高速低温离心机中15000*g离心5min，取出上清液用于以下实验。 2. 用移液管吸取015ml上清液置于15ml规格离心管中，加015mlHepes-NaoH?,在恒温30?培养20min。恒温箱要提前设定好温度。 3. 取出离心管，用泡沫板固定，在沸水中煮30s(水要提前煮开) 4. 沸水后用移液管吸取0.1ml 50mmol/L Hopes-NaoH?放置30?恒温箱中培养30min，之后取出置于沸水中30s。 5. 从沸水中取出，在30?的高速离心机中15000*g离心5min 6. 从离心机中取出，用移液管吸取0.3ml放入新的1.5ml离心管中，用移液管吸 取0.3ml50mmol/LHepes-NaoH?在室温下培养5min，用移液枪加入20微升 己糖激酶和2微升葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在340nm波长下立即比色。酶活性 表示方法:光谱吸收值每分钟增加1个单位为酶的一个活性单位。以Units/ grain?min)表示，设定每半分钟取一次值 ( 器材: 电子天平 1/10000。盆子(用于装冰)，d=80mm瓷体研钵，移液管*6，恒温水浴箱，低温高速离心机，移液枪，枪头20微升、2微升，紫外分光光度计，容量瓶20ml、25ml、50ml、1L，烧杯，量筒5、10、50、250、1000ml 试剂: Hepes-NaoH?: Hepes 0.2978875g (50mmol/L), 25ml ADPG 0.0253324g (1.6mmol/L) PH=7.4 DTT 0.05784375g (15mmol/L) 取各试剂加入烧杯中，加20ml蒸馏水用玻璃棒搅拌均匀，然后 转入25ml容量瓶，再用1mlPH=7.4的NaoH溶液清洗烧杯，转 入容量瓶，清洗三次，再用吸管吸取PH=7.4的NaoH溶液进行 定容，上下摇匀，4?保存 【每次1mg直链淀粉】 Hopes-NaoH?:Hepes-NaoH 0.23831g (50mmol/L) 20ml PEP 0.0168042g (5mmol/L) PH=7.4 KC l0.2982g (200mmol/L) MgCl2 0.04066g 取各试剂加入烧杯中，加20ml蒸馏水用玻璃棒搅拌均匀，然后 转入15ml容量瓶，再用1mlPH=7.4的NaoH溶液清洗烧杯，转 入容量瓶，清洗三次，再用吸管吸取PH=7.4的NaoH溶液进行 定容，上下摇匀，保存【每次丙酮酸激酶1.5单位】 Hepes-NaoH?:Hepes-NaoH 0.595775g (50mmol/L) 50ml Glucose 0.099085g (10mmol/L) MgCl2 0.2033g (20mmol/L) NADP 0.595775g (50mmol/L) Tricine-NaoH: Tricine 17.917g (100mmol/L) MgCl2 2.033g 1L EDTA 0.58448g 2-巯基乙醇 3.907g 甘油 120ml PVP50g 取各试剂加入烧杯中，加980ml蒸馏水用玻璃棒搅拌均匀，然 后转入1L容量瓶，再用1mlPH=7.4的NaoH溶液清洗烧杯， 转入容量瓶，清洗三次，再用吸管吸取PH=7.4的NaoH溶液进 行定容，上下摇匀，保存 【每次20微升己糖激酶 2微升葡萄糖-6-磷酸脱氢酶】 分光光度计的用法: 用待测溶液荡洗比色皿2-3次，将待测溶液倒入比色皿，溶液量约为比色皿高度的3/4，用擦镜纸将透光面擦拭干净，按一定的方向，将比色皿放入样品架。合上样品室盖，拉动样品架拉杆使其进入光路，读取测量数据。