流式细胞仪12-DNA的获取和分析

DNA测定 一、材料和试剂 1、抗凝外周血； 2、DNA QC Particle，DNA测定质量控制试剂盒（BD公司，349523，25tests） CEN：小鸡红细胞核，CTN：小牛胸腺细胞核，核酸染料PI。 CEN试剂经过特殊处理而成，包括单个核，双联体核，三联体核和更大的聚集体，用来检测仪器的线性度和分辨率。PI染色后，由于这些细胞核聚集程度的不同，在PI-A的直方图中会出现至少4个峰，而前4个峰分别代表单个核，双联体核，三联体和四联体。若染色正常，仪器的线性度良好，则后三个峰所在道数的平均值与第一个峰值的比值应接近于2，3，4。 CTN具有细胞周期的各个时期，大部分核处于G0/G1期，小部分处于S期和G2/M期。两个粘连起来的G0/G1期细胞核可以通过DDM与单个G2/M期细胞核区分开来，DDM的功能就是将双联体细胞核或其它聚集体与单个细胞核区分开来，以确保G2/M期的比值有意义。 3、CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit（BD公司，340242，40tests） 试剂A（10ml）:含有胰蛋白酶，四氢氯化精胺去污剂，可用于分离实体组织片段，消化细胞膜及细胞骨架。 试剂B（8ml）:含有胰蛋白酶抑制剂，RNA酶，柠檬酸盐缓冲液，四氢氯化精胺。用于抑制胰蛋白酶的作用并消化RNA。 试剂C（8ml）:含有PI染液，四氢氯化精胺，柠檬酸盐缓冲液。PI作用时的最终浓度至少有125ug/ml。 二、样本制备 1、质控样本的制备（DNA QC Particle） CEN：轻轻摇匀后，吸取40ul到1mL的PI中，混匀，室温避光放置10分钟，即可上机。 CTN：大力震荡试剂瓶，吸取40ul 到1mL PI中，混匀室温避光放置10分钟即可上机检测。 2、外周血DNA样本的制备（CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit） 2.1 将100ul抗凝外周全血加入12x75mm的管中； 2.2 加入1x的溶血素2ml，混匀，室温放置10分钟； 2.3 室温300×g离心5分钟，吸去上清夜； 2.4 加入2mlPBS洗涤细胞2次，室温300×g离心5分钟， 吸去上清液； 2.5 加入250ul A液，轻轻混匀，不要震荡，室温静置10分钟； 2.6 加入200ul B液，轻轻混匀，不要震荡，室温静置10分钟； 2.7 加入200ul C液，轻轻混匀，不要震荡，低温（2-8℃）避光静置10分钟； 2.8 用300目过滤尼龙网或50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞； 2.9 低温避光放置以待上机检测。建议在加入C液后3小时内上机，上机前轻轻混匀细胞悬液。 3、培养细胞DNA样本的制备： 3.1 胰酶充分消化，加PBS吹打成单个细胞； 3.2 室温500×g离心5分钟，吸去上清液，加1mlPBS重悬； 3.3室温300×g离心5分钟，吸去上清液，加1mlPBS重悬； 3.4 吸去上清液，加入PBS重悬细胞，调整细胞浓度到1.0×106细胞/ml； 3.5 取上述浓度的细胞1ml，室温300×g离心5分钟，吸去上清液，留下100ul左右悬液； 3.6 混匀，按“外周血DNA样本的制备”步骤中的2.5继续制备样本。 三、流式上机检测（以CTN为例）： 1、 在浏览框里建文件夹（DNA）和实验组（PI），样本（日期），1个采集管（CTN），并重命名。 2、 选择Cytometer>View Configuration，确保当前的仪器设置包含了合适的参数，本实验需要添加一个parameter，即PI，蓝光激发，用B接收器接收。 3、 将“浏览框”的采集箭头选中采集管，点击“仪器框”的参数parameter页面，删除不必要的荧光参数，仅保留PI（仪器设置列表中B探测器下有多个参数，默认显示PerCP-Cy5.5，在该参数的下拉菜单中选择PI）。 4、 所有参数均设为线性，FSC选H高度信号，其余选A面积信号，PI还需选择W宽度信号。阈值设为PI，定为5000（收集包括从二倍体G1峰道数值1/10处以上所有的信号）。 5、 在“通用工作页面”上建获取模板： ① 一共画三个图：前两个图为散点图，第三个为单参数直方图。 第一个图，横轴FSC-H，纵轴SSC-A； 第二个图，横轴PI-W，纵轴PI-A，（DDM模式，区别粘连细胞）； 第三个图，横轴PI-A； ② 选中第三张图： ⑴ 在50和100道数位置设两个间隔门P1、P2。并选择“Show Population Hierarchy”。 ⑵ 单击右键，选择“Create Statistics View”，右键单击统计图，选择“Edit Statistics View”，在“Edit Statistics View”窗口的“Statistics”页面选择PI的“Mean，CV”选项。 6、上机检测： 1 放CTN在流式细胞仪上。 确认调节机器、获取样本均为低速。 ② 确认数据采集箭头指向该管；点击“Acquire”按扭。 ③ 看通用工作页面中的散射光点图，调整FSC和SSC电压，使图中细胞群显示在合适位置。 ④ 看PI直方图，调节PI电压，使得CTN单个细胞核的DNAG0-G1峰位于50道数上。 ⑤ 看PI散点图（横轴PI-W，纵轴PI-A），观察单个细胞群的位置。 ⑥ 调试结束后，在“采集控制框”里选择获取全部30000个微粒停止，记录数据。 四、数据导出： Diva软件的数据是以“FCS 3.0”版本输出。而ModFIT软件可的流式数据为“FCS 2.0”版本格式，因此需将数据导出，转变版本格式。 1、 在“D：\BD Export\FCS”目录下，选择“File>New>Folder”命令，新建一个文件夹。 2、 双击打开要导出的实验组，选择“File>Export>Export FCS”命令。 3、 在“Export Parameter（输出参数）”窗口中选择“FCS 2.0”版本，所有实验涉及的参数均设为线性关系，并把不用的参数选为none，单击“OK”。 4、 在目录路径的最后，加上您在“驱动盘D:”中新建的文件夹的名字或者用对话框上的“Browser”找到新建文件夹的存储路径。 5、 单击“Save (保存)”。 五、Analysis数据分析（用ModFIT软件） 1、 在桌面上双击ModFIT图标，打开软件，OK-OK-进入软件主屏； 2、 在File下打开数据保存文件夹，文件类型设为ALL File，选出待分析的文件； 3、 选择参数Choose parameter of analysis，选PI-A，双击； 4、 在设门中选择Defile gate（根据需要，选择是否设门，设几个门） ? Gate 1：X轴选FSC，Y轴选SSC，OK，然后在图中圈出你所要分析的细胞； ? Gate 2：X轴选PI-W，Y轴选PI-A，OK，然后在图中圈出你所要分析的单个细胞； ? OK后出现一个峰图。 5、 对这个图进行分析 ? 自动分析（点击工具栏中的Auto键）。 ? 手动分析 1） 单击工具栏中的Mod键：选择分析所要的参数（是否有凋亡Apoptosis，是否有参照Standard，是否有聚集体），选择有几个Cycle（二倍体、四倍体、异倍体），并对每一个循环是否有S期和G2/M期进行定义－OK; 2） 确认每个峰的位置，并将Range放置于不同的峰上； 3） 单击工具栏中的Fit键，软件开始以最小乘法拟合曲线，并进行统计； 4） 此外，还可以点击工具栏中的Diags键来得到关于分析结果的一系列评估指标。 6、 Save As 保存分析结果，Print打印分析结果。 7、 中至少应包含以下信息： ⑴ DNA倍体，包括所有群体的DI；      ⑵ 主要G1峰的CV；      ⑶ S期比例； ⑷ 必要的简单：如细胞数的不足、碎片较多、CV太高等。