不同生长因子对大鼠牙乳头细胞生物学特性的影响

不同生长因子对大鼠牙乳头细胞生物学特性的影响 不同生长因子对大鼠牙乳头细胞生物学特 性的影响 口腔颌面修复学杂志2010年5月第11卷第3期 不同生长因子对大鼠牙乳头细胞生物学特性的影响 赵征刘洪臣鄂玲玲王东胜 ? 论着? 【摘要】目的:探讨bFGF+IGF1,TGF[31+BMP4,bFGF+IGF1+TGFpI+BMP4对体外培养的大鼠牙乳头细 胞(rDPCs)增殖,分化的影响并筛选出最佳的组合因子.方法:分离培养,鉴定rDPCs,应用四唑盐(MTT)比色法 和酶动力学法分别检测不同组合因子刺激后的第1/4/7/10/14天rDPCs的增殖活性,细胞内总蛋白合成量,碱性磷 酸酶(ALP)的分泌水平,应用罗式诊断法和放射免疫分析法检测细胞上清液内钙,磷浓度和骨钙素含量.结果:组 ?bFGF(10ng/mL)+IGFI(100ng/mL)在P4d能最显着地促进rDPCs的增殖,分化与矿化,并在P10d能显着地升高 细胞外液的钙离子,磷离子浓度;组~TGF[3l(Sng/mL)+BMP4(10ng/mL)在P4d能最大程度地促进rDPCs的分化, 矿化并显着促进细胞外液骨钙素的分泌合成,且在P7d能最显着地促进rDPCs内总蛋白的合成(P<0.05).结论: bFGF+IGF1,TGF[31+BMP4两组因子均可促进rDPCs的增殖活性和分化潜能,为体外牙齿再生提供实验依据. 关键词:生长因子;大鼠牙乳头细胞;骨钙素;增殖; [中国图书分类号】R780.2[文献标识码】A 分化 [文章编号】1009—3761(2010)03—0l29—06 Theeffectsofdifferentgrowthfactorsonbiologicalcharacteristicsofratdentalpapillacells(rDPCs) ZHA0Zheng,LIUHong—chen.ELing—ling.WANGDong— sheng.1InstituteofStomatology.ChinesePLAGeneralHos— pital,Beijing100853,China) [Abstract]Objective:ToinvestigatetheeffectsofbFGF+IGF1,TGF[31+BMP4,bFGF+IGFI+TGF[31+BMP4onprolif- erationanddifferentiationofratdentalpapillacells(rDPCs)culturedinvitroandscreenoptimalcombinedfactor.Methods: RDPCswereisolated.cultured.andidentifiedinvitro.MTTchromatometryandenzymedynamicsassayswereusedto determinerDPCsproliferationactivity,totalproteinsynthesisinrDPCsandsecretionlevelofalkalinephosphatase(ALP) respectivelyat1/4/7/10/14dafterstimulatedbydifferentcombinedfactors.Rochediagnosisanalyticalmethodandradio immunoassaywereperformedtodetecttheconcentrationofcalciumandphosphor,andosteocalcin(OCN)contentincell supernate.Results:bFGF(10ng/mL)+IGF1(100ng/mL)couldpromoteproliferation,differentiationandmineralizationof rDPCsmarkedlyatP4d,andadvanceconcen~ationofcalciumandphosphorwithinextracellularfluidnotablyatP10d. TGFB1(5ng/mL)+BMP4(10ng/mL)couldenhancedifferenfiationandmineralizationofrDPCstomaximalextentatP4d. andpromotethesecretionandsynthesisofOCNwithinextracellularfluidsignificantly.Moreover,TGF[31(5ng/mL)+ BMP4(10ng/mL)couldfacilitatethetotalproteinsynthesisofrDPCsnotablyatPTd<0.05).Conclusions:bFGF+IGF1 andTGF[31+BMP4couldpromoterDPCsproliferationactivityanddifferentiationpotentiality,whichprovideexperimental basesfortoothregenerationinvitro. Keywords:growthfactor;ratdentalpapillacells(rDPCs);osteocalcin(oct;proliferation;diff erentiation 基金项目:国家自然科学基金(项目编号:307724501 赵征解放军总医院口腔医学研究所博士后北京 100853 刘洪臣通讯作者解放军总医院口腔医学研究所所长 主任医师教授北京100853 鄂玲玲解放军总医院口腔医学研究所副主任技师 北京100853 王东胜解放军总医院1:2腔医学研究所副主任技师 北京100853 生长因子是一类存在于体内的生物活性因子, 在相应的靶细胞表面高度亲和性受体的介导下,在 软硬组织的修复中发挥重要作用.目前与牙源性细 胞增殖,分化相关的生长因子主要有碱性成纤维细胞 生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF), 胰岛素样生长因子(insulin—likegrowthfactor, IGF),骨诱导形成蛋白(bonemorphogeneticprO— teins,BMPs)和转化生长因子B(transforming ?129? 口腔颌面修复学杂志2010年5月第11卷第3期 growthfactor-p,TGF—p)等,这四种因子单独作 用对牙源性间充质细胞生物学活性的影响已多见报 道[J.引,其中bFGF(10ng/mL),IGF1(1OOng/mL), TGFpl(5ng/mL),BMP4(10ng/mL)分别为其最 佳作用浓度,但联合应用对大鼠牙乳头细胞(rat dentalpapillacells,rDPCs)增殖,分化的影响尚 未见详细报道.本文拟利用细胞生物学和生物化学 检测技术研究这四种因子促rDPCs增殖,分化作 用的最佳组合,为rDPCs复合生物支架移植动物 体内构建组织牙提供实验依据. 1.材料与方法 1.1主要试剂和仪器大鼠bFGF/IGF1/ TGFp/BMP4生长因子(Peprotec,美国),DSPP (SantaCruz,美国),细胞培养试~i](Gibco,美国), 细胞培养瓶(Nunc,美国),鼠抗Vimentin/Cy- tokeratin单克隆抗体(北京中杉金桥生物科技公 司),Rochediagnosiskit(罗式诊断试剂盒),MTT, Tritc荧光二抗,DAPI核染料(Sigma,美国),BCA 总蛋白检测试剂盒(北京赛驰生物科技有限公司), 碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物制品研究所),碘 【125I]骨钙素放射免疫分析试剂盒(北京普尔伟业生 物科技有限公司),ELX800UV酶联免疫检测仪, UV/VIS2802PCSpectrophotometer,体视显微镜, 倒置相差显微镜,激光共聚焦显微镜,数码照相系 统(Olympus,日本),一般化学试剂均为国产分析纯. 1.2大鼠牙乳头细胞(rDPCs)的分离培养,鉴定 1.2.1酶消化法培养rDPCs将出生24h内的 Wistar乳鼠1O只浸入75%乙醇中消毒5min,取 其头颅在超净台内分离出上,下颌骨,用含双抗的 0.01mol/LPBS反复浸洗,体视显微镜下完整分 离上,下颌双侧磨牙胚.根据已初步钙化的釉基质 的边缘处确定颈环的大概位置,首先剥离包绕颈环 外侧的纤维样牙囊组织,然后切取颈环包绕的牙乳 头组织,用PBS液冲洗后剪碎,离心收集组织碎 块,加入4mL3g/LI型胶原酶充分吹匀后放37~C 水浴摇床进行消化,1h后终止.1500r/min离心 5min,收集细胞及消化松散的组织块,加入10mL 含200ml/L新生牛血清的高糖DMEM/F12培养 液,接种75cm塑料培养瓶内,置于37~C,95%空 气,50ml/L的CO孵箱中孵育,次日换液.原代 ?130? 培养约3d,细胞长满瓶底90%左右,2.5g/L胰蛋 白酶消化,l:2传代培养,取第2代细胞用于下 述实验. 1.2.2rDPCs的形态学观察和来源鉴定(1)形 态学观察:倒置相差显微镜下观察细胞形态,制备 细胞爬片.(2)来源鉴定:免疫荧光染色(步骤同参 考文献[4])检测Vimentin(1:100稀释)和Cytok— eratin(1:100稀释)在P2代rDPCs的表达.将 rDPCs经bFGF(10ng/mL)+IGF1(100ng/mL)诱导 14d后,免疫荧光染色检测牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP,1:1O0稀释)的表达. 1.3实验分组 (1)MTT检测:?含bFGF(10ng/mL)+IGF1 (100ng/mL)的5%NBS的DMEM/F12诱导组; ?含TGFp1(5ng/mL)+BMP4(10ng/mL)的5% NBS的DMEM/F12诱导组;?含bFGF+IGFI+ TGF61+BMP4的5%NBS的DMEM/Fl2诱导组; ?空白对照组:DF12+5%NBS. (2)ALP,BCA总蛋白检测:?含bFGF(10ng/ mL)+IGF1(100ng/mL)的5%NBS的矿化诱导液 组;?含TGFP1(5ng/mL)+BMP4(10ng/mL)的 5%NBS的矿化诱导液组;?含bFGF+IGF1+ TGFpl+BMP4的5%NBS的矿化诱导液组;?空 -t-5%NBS. 白对照组:矿化DF12 矿化诱导液:250ml培养基中加入5%新生牛 血清(NBS),p一甘油磷酸钠(0.765g),抗坏血酸 VitC(0.0125g),地塞米松l0(25txL). 1.4MTT法检测细胞增殖调整细胞密度为 lX10/mL(2000个细胞/孔)接种96孔板,各组 n=12,IO%NBS的DF12培养24h后换0.5%FCS 的DF12饥饿培养12h,再加各组因子培养24h,于第 2天检测A值即为P1,其后分别检测P4/P7/P10/ P14的A伽值.应用四唑盐(MTT)比色法检测细胞的 增殖活性,具体步骤见参考文献[5】并作统计学分析. 1.5酶动力学法检测ALP活性,细胞总蛋白 含量测定按照正常传代比例(1:2)调整细胞密度 为105/mL,接种24孔板,每孔lmL,各组fi=6, 待细胞伸展至90%汇合后,换0.5%FCS的DF12 饥饿培养12h,分别于加因子后P1/P4/P7/P10 P14d每孔加入l50txLTritonX-100放置4?24h, 然后充分吹打细胞收取细胞裂解液,按照试剂盒说 口腔颌面修复学杂志2010年5月第11卷第3期 明,分别检测P1/P4/P7/P10/P14的总蛋白吸 光度值(A)和ALP值(Ao)并作统计学分析,具 体步骤见参考文献[5]. 1.6细胞上清液钙磷,骨钙素的检测分别收 集1.5中的Pl/P4/P7/Pl0/Pl4的细胞培养上清 液用于检测钙,磷,骨钙素浓度,按照罗式诊断分 析法,碘[125I]骨钙素放射免疫分析试剂盒进 行操作,自动放免仪检测. 1.7统计学分析应用SPSS13.0软件包进行 统计学分析.实验数据以X?S表示,多组问均数 比较采用单因素方差分析的SNK检验,P<0.05 为差异具有显着性. 2.结果 2.1rDPCs的形态学及来源鉴定 2.1.1形态学原代培养的rDPCs6h贴壁约 8O%,12h开始伸展,24h基本展开.细胞大多数 呈长梭形,少数为多角形或椭圆形,体积较大,胞 体丰满,胞核位于胞质中央,呈卵圆形,约3d达 到90%汇合(图1A). 2.1.2来源鉴定免疫荧光结果显示Vimentin 在rDPCs胞质中呈现阳性的红色荧光表达(图lB), Cytokeratin在rDPCs胞质中表达阴性,胞核经 DAPI染呈蓝色荧光(图1C).rDPCs经bFGF+ IGF1诱导14d后,多数分化为多角形或长梭形, 胞质分泌更加丰富,细胞突起较多,卵圆形胞核位 于胞质中央,牙本质特异性蛋白DSPP在胞质中呈 强阳性表达(图1D). 2.2MTT检测结果(图2)组?bFGF+IGFl 在P4d平均吸光度(A值)达到最高,从P4d,P14d 呈递减趋势.P4d与Pld,10d,14d的A值分别 比较,差异显着(P<0.01).组?TGF6+BMP4组 在P7dA值达到最高,其后呈递减趋势.P7d与 Pld,4d,l0d,14d分别比较,差异显着(P<0.01). 组?bFGF+IGFl+TGF61+BMP4组在P7dA值达 到最高,其后递减.PTd与Pl0d,14d分别比较, 差异显着(P<0.01).对照组Control(组?)在P7d A值最高,其后递减.P7d与其余时间分别比较, 差异显着(P<0.O1).在Pld,组?A值最大,在 P4/7d组?A值最高,且与其他各组分别比较, 差异显着有统计学意义(尸<0.01o说明组?在 P4/7d均能显着促进rDPCs的增殖,以P4d的表 达水平最高. : .一.丽l471U14 时间f天) 图2实验各组MTT检测结果 2.3细胞总蛋白和ALP检测结果总蛋白检 测(图3):组?,?分别在Pl0d,7d达最高值, 在P1/4/7d,组?与其余各组分别比较,差异显着 (P<0.01);在各时间点,实验组与对照组分别比 较,均差异显着有统计学意义(P<0.01).提示组 ?在P7d能最大程度地促进细胞内总蛋白的合成. 14710l4 时间(天) 图3细胞上清液内总蛋白检测结果 一一一一A:P2代rDPCs(X200),B:免疫荧光抗Vimentin胞质中阳性表达 (TRITC/DAPI荧光标记x200);C:免 疫荧光抗Cytokeratin胞质中阴性表达,胞核经DAPI染呈蓝色(DAPI荧光标记× 200);D:免疫荧光抗DSPP 胞质中呈强阳性表达(TRITC/DAPI荧光标记x400) 图1HDPSCs的形态学观察及来源鉴定 ? 131? 口腔颌面修复学杂志2010年5月第11卷第3期 ALP检测(图4):组?,?在P4dALP值达 最高,从P4d-14d呈递减趋势.组?,?在P7d 达最高,其后递减.说明组?,?在P4d能最大 程度地促进细胞的分化与矿化(P<0.01). -bFGF+IGF1口TGFp+BMP4口bFGF+IGFI+TGFB+BMP4口Contml I .. 1471014 时间(天1 4实验各组ALP检测结果 2.4细胞上清液内钙磷,骨钙素的含量检测 钙浓度检测(图5):实验各组均在P1一l0d呈递增趋 势,在10d达最高,其后下降.在各时间点,组? 的钙浓度最高,且与其他各组分别比较,差异显着 (P<0.05);在Pl,4,14d,各实验组与对照组分别 比较,均差异显着有统计学意义(P<0.05).说明组 ?在P10d能最显着地升高细胞外液的钙离子浓度. GF1口TGFBI+BMP4bFGF+IGF1+TGFBI+BMP4口Con~ol 471014 时间(_人) 图5实验各组钙浓度测定结果 磷浓度检测(图6):实验各组均在Pl-lOd呈 递增趋势,在10d达最高,其后下降.在P10, 14d组?的磷浓度最高,且与其他各组分别比较, 差异显着(P<0.01);且PIO,14d的实验各组与对 照组分别比较,均差异显着(P<0.05).说明组? 在P10d能最显着地升高细胞外液的磷离子浓度. ?132? IGFI口TGFBI+BMP4目bFGF+IGFI+TGFpI+BMP4Con~ol }.i47l014 时间(天) 图6实验各组磷浓度测定结果 骨钙素含量(图7):各组均在P7d达最小值; 组?在P4d达最高值,且与其他组分别比较,差 异显着有统计学意义(P<0.05).说明组?在P4d 能显着地促进细胞骨钙素的分泌合成. -b 0 喜 S 蚓 抽 弓 0 FGF+IGF1DTGF8+BMP4口bFGF+IGFI+TGF13+BMP4_Control 图7实验各组骨钙素含量测定结果 3.讨论 牙乳头细胞是颅神经嵴细胞发生广泛的迁移, 分化,增殖而形成的来源于外胚层的牙源性问充质 细胞,具有分化为前期成牙本质细胞和牙髓成纤维 细胞的潜能,是研究牙齿发育特别是成牙本质细胞 分化和牙本质基质矿化的良好实验模型_61;生长因 子,调控基因等因素可以影响体外培养的牙乳头 细胞的增殖,分化和矿化,进而影响牙胚的发育进 程[71.本文对第2代rDPCs进行了来源鉴定,并在 bFGF+IGF1诱导14d后检测到牙本质涎磷蛋白 DSPP的强阳性表达,证实我们体外分离培养的 rDPCs为问充质来源的牙乳头细胞. 本实验在ALP,BCA总蛋白检测的实验各组 中,加入了低浓度的矿化诱导液,据以往研究显 示,矿化液在少于14d的短期作用中并不能显着 影响细胞的分化,且NBS采用5%的低浓度,以尽 量减低对rDPCs分化的影响,保证不同组合生长 因子分别作用1/4/7/10/14d后检测结果的可靠性. 研究显示:多种细胞生长因子如bFGF,IGF1, TGF[31,BMP2,BMP4,EGF等均参与了牙乳头细 胞向牙髓干细胞,成牙本质细胞分化的过程[2,…, 其中bFGF(10ng/mL),IGF1(100ng/mL),TGF6l (5ng/mL),BMP4(10ng/mL)分别为其最佳作用 浓度. Takayana等.1研究证实bFGF(10ng/mL)在创 伤修复的早期促进未分化的人牙周膜细胞(human periodontalligamentcells,HPDLCs)增殖,相应 地增加转化为成骨细胞,成牙骨质细胞及成纤维细 胞的数量,从而促进牙周组织再生.Zhan[111等研 咖啪瑚?跏枷姗瑚?o 一】?邑刍 +8642186420=!. (r1,I.目目一铎|】 ? 2O8642O 【1几og邑聪 一 口腔颌面修复学杂志2010年5月第11卷第3期 究发现bFGF(10ng/mL)影响牙周膜成纤维细胞 DNA合成,可使DNA合成量提高l82%,并可促 进牙周膜新生血管网形成,提供牙周膜成纤维细胞 的血供,为牙周软组织再生创造条件.IGF是由成 骨细胞产生,以自分泌,旁分泌形式作用于骨再生 过程;IGF1(100ng/mL)作用于人牙周膜细胞可使 其骨钙素合成增加.IGF1(100ng/mL)和bFGF (10ng/mL)联合应用,作用于人PDLC,可明显促 进其增殖,分化].Onishi等研究发现,IGF1 (100ng/mL)对体外培养的牙髓细胞的增殖和分化 起一定的调控作用. Begue-Kirm等【】.发现,TGF~I(5ng/mL)~H 肝素能促进牙乳头表层细胞发生极化并向成牙本质 细胞分化,这些细胞转录DSPP并分泌前期牙本 质,其中TGF-61在诱导中起决定作用.TGF{3以 时间一剂量依赖的方式促进牙周膜细胞的有丝分 裂和蛋白合成_1.另有研究发现TGF-[31(5ng/mL) 能抑制细胞增殖,促进细胞分化和骨钙素的分泌, 表明其作用有双相性:低含量刺激细胞增殖,高含 .BMP4(10ng/mL)能诱导牙周 量抑制骨的生长[】 组织中未分化间充质细胞分化为成牙骨质细胞和成 骨细胞,并明显刺激体外培养的牙周膜细胞分泌骨 钙素,提示BMP4基因在牙周膜细胞在根方的附 着,以及在牙槽骨,牙骨质的修复重建过程中起重 要的调控作用. 包柳郁[]等研究发现,bFGF(10ng/mL)+IGFl (100ng/mL)或TGF[31(5ng/mL)诱导的人牙源性 问充质细胞部分表达牙本质涎蛋白(DSP),RT-PCR 结果显示诱导后的细胞中存在DSuRNA的表 达.牙本质特异性蛋白DSPP,DPP和DSP是目 前公认的成牙本质细胞的特异性标志物,DSP和 DPP是同一基因DSPP转录和翻译后的前体蛋白 的剪切产物【].Martin等研究发现,aFGF和 bFGF均可促进体外培养的牙乳头组织的表层细胞 发生极化,bFGF(10ng/mL)和IGF1(100ng/mL) 有协同作用,联合应用可增强彼此的诱导功能,促 进牙乳头表层细胞的极化以及向成牙本质细胞样细 胞的功能性分化,并分泌细胞外基质.若用一定浓 度的适宜生长因子BMP4+TGF61以及bFGF+ IGF1对牙源性间充质细胞进行接种前的平面诱导, 将更有利于其在三维培养体系中的生长和向成牙方 向的分化. 本文根据上述学者的研究成果,利用四种因子 的单独作用最佳浓度进行组合,以期筛选出促 rDPCs增殖,分化的最佳组合.MTT比色法是一 种广泛应用于检测细胞增殖活性的方法,通过测定 光吸收值(A值)即可反映细胞数量和增殖活性l1. 碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)是一种较 成熟的参与和促进矿化活动,与矿化组织形成密切 相关的酶类,与牙本质沉积,矿化密切相关,是成 骨细胞分化成熟的重要标志;分化程度越高,分泌 矿化基质的能力越强,则ALP活性越高.目前 ALP已被广泛作为检测牙源性间充质细胞分化, 矿化的重要参考指标. 骨钙素(Osteocalcin,OCN)是一种相对小分子 质量蛋白质,含49个氨基酸,主要沉积在骨组织 的细胞外间质中,可由成骨细胞产生,也可由成牙 骨质细胞和成牙本质细胞产生,是骨样组织中最丰 富的非胶原基质蛋白.OCN对钙和羟基磷灰石具 有较高的亲和力,并发挥骨代谢方面的作用,被认 为是成骨细胞最具特征性的表型标志,OCN的合 成和分泌对骨吸收区域破骨细胞前体细胞的聚集起 作用,它是成骨细胞分化晚期的标志蛋白n.钙离 子(Ca)在细胞功能的调节中起重要作用,如神经 传导,细胞分泌和增殖,形态发生,细胞老化等许 多细胞反应过程都有Ca>的调节作用.磷离子(P+) 对人体细胞生理功能和骨骼矿化起着非常重要的作 用,并参与神经传导,能量和物质代谢,核酸代 谢,肌肉收缩等重要生理,生化过程,磷对细胞代 谢有稳定作用[201. 增殖和分化是细胞的基本生命活动形式,细胞 通过增殖数量增加,在增殖的过程中分泌活性增 加,为形成组织提供条件.而通过分化,细胞种类 增加,形成有特殊功能的细胞,最终导致不同组织 的形成[2】.但同时,增殖和分化又是细胞相对独 立而相互矛盾的两个阶段,细胞快速增殖能抑制其 分化,进入分化的细胞增殖速度则减慢.在多数情 况下,终末分化细胞不再具有增殖能力】.细胞经 不同生长因子刺激后的增殖和分化特性的表达水平 是有显着差异的,本实验应用MTT比色法,酶动 力学方法,放射免疫分析法和罗式诊断分析法分别 证实:组ObFGF(10ng/mL)+IGF1(100ng/mL)以 ? 133? 口腔颌面修复学杂志2010年5月第11卷第3期 特定组合浓度,在特定时间(P4d)flg最显着地促进 rDPCs的增殖,分化与矿化,并在P10d能显着地 升高细胞外液的钙,磷离子浓度;说明两种因子的 协同作用能同时提高rDPCs的增殖活性和分化水 平.组?TGFI31(5ng/mL)+BMP4(10ng/mL)在 P4d也能最大程度地促进细胞的分化,矿化并显着 促进细胞骨钙素的分泌合成,且在P7d能最显着地 促进细胞内总蛋白的合成.这与之前的研究结果[2] 基本相符,提示bFGF+IGF1或TGFI3I+BMP4两 组生长因子均可促进或维持rDPCs的增殖活性和 牙向分化潜能,而组?四种因子的联合应用并未能 显着刺激rDPCs的增殖,分化,提示bFGF,IGF1, TGFBl,BMP4之间并不具备协同作用. 种子细胞,生物支架和生长因子微环境被认为 是组织工程的三要素[24】,本研究通过体外实验筛选 出适宜的因子组合,为生长因子刺激细胞后复合支 架移植动物体内构建组织工程牙和牙周组织提供了 可靠依据. [3】 [4】 【5] [7】 参考文献 赵征,刘洪臣.组织工程牙再生发育的研究进展.中华老 年口腔医学杂志,2009,7(4):248-252 NakashimaM,NagasawaH,YamadaY,eta1.Regulatory roleoftransforminggrowthfactor-beta,bonemorpho— geneticprotein-2.andprotein-4ongeneexpressionofex— tracdlularmatrixproteinsanddifferentiationofdentalpulp cells[J].DevBiol,1994,62(1):l8-28 OnishiT,KinoshitaS,ShintaniS,eta1.Stimulationofpro- liferationanddifferentiationofdogdentalpulpcellsin serum——freeculturemediumbyinsulin-likegrowthfactor[J]. ArchOralBiol,1999,44(4):36l-37l 赵征,黄征难,徐军明.ADAM28真核表达质粒的构建及转 染人牙囊细胞后的表达分析[J].上海口腔医学,2007,16(4): 404-409 赵征,徐军明,赵威丽.ADAM28反义核酸对人牙乳头细 胞增殖,分化和凋亡的影响[J].北京口腔医学,2009,17(1): l1—15 RitchieHH.RitchieDG.WangLH.Sixdecadesofdentino- genesisresearch[J].EurJOralSci,1998,106(Suppl1): 211-220 包柳郁,金岩,史俊南,等.人牙源性间充质细胞向成牙 本质细胞的诱导分化[J】.实用口腔医学杂志,2005,21(2): 178—182 ? 134? 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