尿囊液病毒RNA的提取-

尿囊液病毒RNA的提取及反转录 1、目的及适用范围: 该SOP主要用于尿囊液病毒中RNA的提取,以获得所需病毒RNA,然后经过反转录后得到病毒的cDNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA 污染很少,可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA,体外翻译和分子克隆等。其原理是利用Trizol(主要成分是异硫氰酸胍和苯酚)能破坏细胞,使RNA释放同时保持RNA的完整性的特性使RNA被释放,然后加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,再通过异丙醇沉淀来还原RNA。 2、主要仪器及试剂 离心机、Trizol、氯仿、异丙醇、DEPC水,75%酒精(DEPC水配制)、RNA free枪头 3、操作步骤 3.1 取尿囊液病毒250ul置于RNA free的EP管中,然后加入750ul预冷的Trizol,震荡器剧烈震荡15s,于室温下,静置5min; 3.2 加入300ul氯仿,剧烈震荡15s后,于室温下,静置3min; 3.3 将EP管放入预冷的离心机中,4℃,12000rpm离心15min; 3.4 取上层(500-700ul,一般取600ul)置于另一新的RNA free的EP管中,加入600ul的异丙醇,上下颠倒轻轻混匀,于室温下,静置10min;(所取上层溶液的量与异丙醇的量的比例为1:1); 3.5将EP管放入预冷的离心机中,4℃,12000rpm离心10min; 3.6 弃上清,每管中中加入1ml75%的乙醇洗涤RNA沉淀(可轻轻上下颠倒或用枪轻轻吹吸),然后将EP管放入预冷的离心机中,4℃,12000rpm离心10min; 3.7 弃上清,室温下晾干,一般为20min左右。 3.8 每管加入30ul DEPC水溶解RNA沉淀(用枪轻轻混匀),可立即用于反转录,或-80℃冻存。 3.8 反转录体系及条件 (以25ul反应体系为例): RNA 样品14ul 10mM dNTPS 2ul 随机引物(或特异性上、下游引物或流感Uni12)各或1ul. 5×MLV Buffer 5ul RRI(RNA酶抑制剂)1ul MLV(反转录酶)1ul DTT(0.1M)1ul 反转录条件为:42℃×59min,80℃×5min,4℃+∞。 4、注意事项 4.1 所用试剂需RNA专用,并在RNA提取专用操作区操作。 4.2 操作人员需带上口罩,操作过程中尽量不要说话。 4.3 反转录酶也可用AMV等;引物也可用随机引物;