粗蛋白、能量、钙磷的测定方法

粗蛋白、能量、钙磷的测定方法 饲料粗蛋白的测定 一、实验目的 通过饲料样品中粗蛋白质的测定，让学生了解了解凯氏定氮法测定的基本原理，掌握半微量凯氏定氮法测定饲料粗蛋白质的方法，掌握粗蛋白质含量的计算方法。 二、实验原理 各种饲料的有机物质在还原性催化剂(如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉)的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使蛋白质和其它有机态氮(在一定处理 NH4)2SO4，而非下也包括硝酸态氨)都转变成NH4+并与H2SO4化合成( 含氮物质，则以CO 2 ?，H2O?，SO 2?状态逸出。消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的铵态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵，然后以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用HCl溶液( 0.1mol/L)滴定，求出氮的含量，根据不同的饲料再乘以一定的系数(通常用6.25系数计算)，即为粗蛋白质的含量。 其主要化学反应如下: 1、2NH4(CH2)2COOH+13H2SO4?(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2(丙氨酸) 2NH 3+3H2O+2Na2SO4 2、(NH4)2SO4 +2NaOH? 3、4H3BO3+ NH 3?NH4HB4O7+5H2O 4、NH4HB4O7+HCl+5H2O?NH4C1+4H3BO3 本法不能区别蛋白氮和非蛋白氮，只能部分回收硝酸盐和亚硝酸盐等含氮化合物。在测定结果中除蛋白质外，还有氨基酸、酰胺，铵盐和部分硝酸盐、亚硝酸盐等，故以粗蛋白质示之。 三、实验设备 1、实验室用样品粉碎机或研钵; 2、分析筛:孔径0.45mm(40目); 3、分析天平:感量0.0001g; 4、消煮炉或电炉; 5、滴定管:酸式，25或50ml; 6、凯式烧瓶:100或500m1; 7、凯氏蔗馏装置:常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式; 8、锥形瓶，150或250m1; 9、容量瓶:100ml。 三、实验内容 1、称取0.5,1g试样(含氮量5,80mg)准确至0.0002g，无损失地放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜0.9g，无水硫酸钾(或硫酸钠)15g，与试样混合均匀，再加硫酸25ml和2粒玻璃珠，在消煮炉士小心加热，待样品焦化，泡沫消失，再加强火力(360,410?)直至溶液澄清后，再加热消化15min。 2、氨的蒸馏 (1)常量直接茂馏法 将上述的试样消煮液冷却，加蒸馏水200ml，摇匀，冷却。沿瓶壁小心加入40,氢氧化钠溶液100ml，立即与蒸馏装置相连(蒸馏装置冷凝管的末端应浸入50ml硼酸吸收液lcm。加混合指示剂2滴，轻摇凯氏烧瓶，使溶液混匀，加热蒸馏，直至馏出液体积约150ml。先将吸收液取下，再停止加热。 (2)半微量水蒸汽蒸馏法 上述试样的消煮液冷却，加蒸馏水20m1转入100ml容量瓶，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。取2,硼酸溶液20ml，加混合指示剂2滴，使半微量蕉馏装置的冷凝管末端浸入此溶液;蒸馏装置的蒸汽发生器的水中应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此液为橙红色，否则应补加少许硫酸。准确移取试样分解液10,20ml注入蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml40,氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，并在入口处加水封密好，防止漏气，蒸馏4min，使冷凝管末端离开吸收液面，用蒸馏水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。 3、滴定 用硼酸吸收氨后，立即用0.05mol/L的HCI标准溶液滴定，仍以甲基红或混合甲基红为指示剂。 在测定饲料样本中含氮量的同时，应做一空白对照测定，即各种试剂的用量及操作步骤完全相同，但不加样本，这样可以校正因药品不纯所发生的误差，吸收氨后的吸收液立即用0.05mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。 4、空白测定 称取蔗糖0.0lg，以代替试样，按上述测定步骤进行空白测定，消耗0.05mol/L盐酸标准溶液的体积应不得超过0.3ml。 5、计算 每m1的lmol/L盐酸标准溶液相当于0.0140g的N。因此， 式中:v2—试样滴定时所需酸标准溶液的体积(m1); v1—空白滴定时所需酸标准溶液的体积(m1); c—盐酸标准溶液的浓度(mol/L); m一试样的质量(g); v —试样的分解液总体积(ml); v’—试样分解液蒸馏用体积(m1); 0.0140—每ml HCl标准溶液相当于N的克数; 6.25一氮换算成蛋白质的平均系数。 每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。 当粗蛋质含量在25,以。上，允许相对偏差为1,;当粗蛋白质含量在l0,,25,时，允许相对偏差为2,;当粗蛋白质含量在10,以下时，允许相对偏差为3,。 测定步骤的检验 精确称取0.2g硫酸铵，代替试样，按测定步骤文字中的各步骤操作，并按计算(但不乘系数6.25)，测得硫酸铵含氮量为21.19?0.2,，否则应检查加碱，蒸馏和滴定各步骤是否正确。 试样消煮时，加入硫酸铜0.2g，无水硫酸钠2g，与试样混合均匀，再加硫酸10ml，仍可使饲料试样分解完全,只是试样焦化再变为澄清所需时间要略长些。 饲料钙的测定 一、实验目的 通过饲料样品中钙的测定，使学生掌握钙的测定原理和方法。 二、实验原理 将试样中有机物破坏，钙变成溶于水的离子，用草酸铵定量沉淀，用高锰酸钾法间接测定钙的含量。 三、实验材料 1、实验室用样品粉碎机或研钵; 2、分样筛:孔径0.45mm(40目); 3、分析天平:感量0.0001g; 4、高温炉;电加热，可控制温度在550土20?; 5、坩埚:瓷质; 6、容量瓶:100ml; 7、滴定管:酸式，25或50ml; 8、玻璃漏斗:6cm直径; 9、定量滤纸:中速，Φ7,9cm; 10、移液管:10，20ml; 11、烧杯:200ml; 12、凯氏烧瓶:250或500ml。 四、实验内容 1、试样的分解 (1)干法 称取试样3,5g于坩埚中，准确至0.0002g，在电炉上小心炭化，再放入高温炉于550?灼烧3h(或测定粗灰分后接续进行)。在盛灰坩埚中加入盐酸溶液10m和浓硝酸数滴，小心煮沸。将此溶液转入l00ml容量瓶，冷却至室温;用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。 (2)湿法(用于无机物或液体饲料) 称取试样2,5g于凯氏烧瓶中，准确至0.0002g。加入硝酸(GB326—65，化学纯)30m1，加热煮沸，至二氧化氮黄烟逸尽，冷却后加入70%,72,高氯酸(GB623—77，分析纯)10ml，小心煮沸至溶液无色。不得蒸干(危险～)。冷却后加蒸馏水50ml，并煮沸驱逐二氧化氮，冷却后转入100ml容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。 2、试样的测定 准确移取试样分解液10,20ml(含钙量20mg左右)于烧杯中，加蒸馏水100ml，甲基红指示剂2滴。滴加氨水氨水溶液至溶液至橙色。再加盐酸溶液使溶液变红色(pH2.5,3.0)。小心煮沸慢慢滴加热草酸铵溶液l0ml，并不断搅拌。如溶液变橙色，应补滴盐酸溶液至红色。煮沸数分钟，放置过夜使沉淀陈化(或在水浴上加热2h)。 用滤纸过滤，用1:50的氨水溶液洗沉淀6,8次，至无草酸根离子(接滤液数ml加!加硫酸数滴，加热至80?，再加高锰酸钾1滴，呈微红色，应0.5min不褪色)。 将沉淀和滤纸转入原烧杯，加硫酸10ml，蒸馏水50ml，加热至75,85?，用0.05mol/L高锰酸钾滴定，溶液呈粉红色应半分钟不褪色为终点，同时进行空白溶液的测定。 式中:V—0.05mol/L高锰酸钾标准溶液滴定用体积(ml); V0—测定空白时，0.05mol/L高锰酸钾标准溶液滴定用体积(ml); C—高锰酸钾标准溶液浓度(mol/L); m—试样质量(g); V’—滴定时移取试养分解液体积(ml); 40/2—钙的mol数。 每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。含钙量1%以下时，允许相对偏差3%;含钙量1%,5%时，允许相对偏差5%;含钙量1%以下时，允许相对偏差10%。 饲料总磷的测定 一、实验目的 通过饲料样品中磷的测定，使学生掌握用钼黄比色法测定饲料样品中总磷含量的原理和方法。 二、实验原理 先将试样中有机物破坏，使磷游离出来，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理，生成黄色，(NH4)3PO4NH4VO3?16MoO3，在波长420nm下进行比色测定。此法测得为总含磷量，其中包括动物难以吸收的植酸磷。 三、实验设备 1、实验室用样品粉碎机或研钵; 2、分样筛:孔径0.45mm(40目); 3、分析天平:感量0.0001g; 4、分光光度计:有10mm比色池，可在420nm下测吸光度; 5、高温炉:电加热，可控制温度在550?20?; 6、坩埚:瓷质; 7、容量瓶:100ml或1000ml; 8、容量瓶或具塞比色管:50ml; 9、刻度移液管:10ml; 10、凯氏烧瓶:250ml或500m1。 四、实验内容 1、试样的分解 (1)干法 称取试样3,5g于坩埚中，准确至0.0002g，在电炉上小心炭化，再放入高温炉于550?灼烧3h(或测定粗灰分后接续进行)。在盛灰坩埚中加入盐酸溶液10m和浓硝酸数滴，小心煮沸。将此溶液转入l00ml容量瓶，冷却至室温;用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。 (2)湿法(用于无机物或液体饲料) 称取试样2,5g于凯氏烧瓶中，准确至0.0002g。加入硝酸(GB326—65，化学纯)30m1，加热煮沸，至二氧化氮黄烟逸尽，冷却后加入70%,72,高氯酸(GB623—77，分析纯)10ml，小心煮沸至溶液无色。不得蒸干(危险～)。冷却后加蒸馏水50ml，并煮沸驱逐二氧化氮，冷却后转入100ml容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。 2、标准曲线的绘制 准确移取磷标准溶液(50μg/m1)0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，15.0ml于50ml容量瓶中，各加入钒钼铵辊邑试剂10ml。用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置10min以上。以0ml溶液为参比，用10mm比色池，在4200m波长下，用分光光度计测各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 3、样的测定 准确移取试样分解液1,10ml(含磷量50—500μg)于50ml容量瓶中，加入钒钼酸铵显色试剂10ml，按上述的方法显色和比色测定，测得试样分解液的吸光度。用标准曲线查得试样分解液的含磷量。 式中:m —试样质量(g); V—比色测定时所移取试样分解液的体积(ml); X—由标准曲线查得试样分解液含磷量(μg)。 每个试样取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。含磷量在0.5%以上时，允许相对偏差3%;含钙量0.5%以下时，允许相对偏差10%。 能量的测定 一、实验目的 使学生了解了解氧弹式热量计测热的基本原理及方法。 二、实验原理 有机物的燃烧热系单位质量有机化合物完全氧化时，所能释放出的热量，称为该物质的燃烧热，也称总能。 根据热力学第一定律，一个热化学反应，只要其开始与终末状态一定，则反应的热效应就一定。这一原理使我们测定各种物质的燃烧热变为有意义。有机物差不多均能氧化完全，并且反应进行很快，因此，准确地测定燃烧热就有了可能。由所测得的燃烧热还可以计算反应的热效应和化合物的生成热。 将由消化代谢试验所用的饲料或日粮以及所收集的粪、尿样品，制备成一定质量-2的测定试样，装于充有(25?5)kg?cm纯氧氧弹中进行燃烧。燃烧所产生之热量为氧弹周围已知质量的蒸馏水及热量计整个体系所吸收，并由贝克曼温度计读出水温上升的度数。该上升的温度乘以热量计体系和水的热容量之和，即可得出试样的燃烧热。 在测定过程中一些因素会影响测定结果的准确性，须加以校正才可得出真实的热价。例如，由于辐射的影响，水温上升的度数与由燃烧产热所致的实际升温之间有偏差;引火丝本身燃烧的发热量;以及含有氮、硫等元素的样品，在氧化后生成硝酸、硫酸，其发热量应予以扣除等。 三、实验设备 1、氧弹式热量计; 2、氧气钢瓶(附氧气表)及支架; 3、容量瓶:2000，1000，200mL; 4、量筒200，500mL; 5、滴定管50mL; 6、吸管10mL; 7、烧杯250，500mL。 四、实验内容 1、准备工作 测定前应擦净氧弹各部污物及油渍，以防试验时发生危险，氧气钢瓶应置于阴凉安全处，并应注意避免滑倒。 (1)称量样品及引火丝的准备。取1,1.5g风干饲料样品(经粉碎过40目筛)，用压样机压成饼状，然后置于干燥洁净的坩埚中称重(准确至0.000lg)。 样品的多少依测定时温度上升不高于3,4?为准，最好以1?左右为宜。如温差大时，热量计因辐射而损失的热也多，引起的误差也较大。此外，在称量样品的同时，应测定样品的含水量，以便换算成绝干基础的热价。 量取及称重10cm的引火丝，将盛有样品的坩埚置于弹头的坩埚支架上，将引火丝固定在两个电极之上，其中一端应距样品表面1,2mm。引火丝切勿接触坩埚。 (2)加水及充氧。在弹头与弹体装配前，取5,10mL水注入氧弹底部，以吸收燃烧过程中产生的五氧化二氮与三氧化硫气体。加入的水量不要求很精确，但应与测定热量计水当量相一致。 然后用螺帽将弹头与弹体扭紧，取下进气阀的螺母，拧上连接氧气瓶的气管接头，2充氧之前应先打开针形阀。先充氧约5kg?cm，使氧弹中空气排尽。然后，充氧2压力应逐渐增至25,30kg?cm。但充氧不可过快，否则会使坩埚中的试样为气流所冲散而损失。这一点必须注意。 (3)内外水筒的准备及热量计的安装。从外筒的注水口加入水至离上缘1.5cm处止，为防止水中杂质的沉淀，应用蒸馏水。外筒灌水后可用搅拌器搅拌(外筒水不须经常更换)，待水温与室温一致时，才能使用。如热量计长期不用，应将水套中的水全部放出干燥保存。 热量计内筒的蒸馏水应盖过氧弹进气阀螺母2/3高度。各套仪器的水量不同，2000,3000g。国产GR-3500型热量计的加水量为3000g，每次称量应相等，准确至0.1,0.5 g(如不具备称量条件，可用容量瓶量取2000,3000mL蒸馏水)。为减少辐射，测定前应调节内筒水温使低于外筒水温，GR-3500型以0.5,0.7?为宜，其他型号在1,1.5?之间(试样发热量少时，可相差0.5 ?)。内筒灌水应在内筒放入外筒，并将氧弹放入内筒后才可进行。灌注时注意勿使水溅出，以免影响数值的准确性。 氧弹在内筒中应放置适当的位置，勿使搅拌器的叶片与内筒或氧弹接触，然后将贝克曼温度计固定于支架上，使其水银球中心位于氧弹一半高度的位置，最后盖上盖子。 整个热量计准备就绪后，才可开动搅拌器，为保证测定时搅拌所生的热大导相等。搅拌器的速度变化，不得超过10,。搅拌速度可由控制箱上的旋钮加以调节。 2、测定工作 全部测定工作分为3期:燃烧前期(即初期)、燃烧期(即主期)及燃烧后期(即末期)。 (1)燃烧前期(初期)是燃烧之前的阶段，用以了解热由外筒传入内筒的速度。搅拌器开动3,5min后，开始温度，每分钟1次。当每分钟温度上升几乎恒定时，可定为初期的起点，也即试验的开始点(定为d点)。然后，每隔1min读记1次温度，如此连续5,10min。读温度应精确至0.001?。 (2)燃烧前期之末按电钮点火(此时定为0点)，燃烧前期最后1次读温，也就是燃烧期(主期)的第一次读温。燃烧期(主期)内每0.5min记录1次，直至温度不再上升为止(此时为c点)，燃烧即行结束。使用的点火电压约为24V，由于点火而进入热量计体系的电热通常可忽略。但通电流的时间每次都应相同，不应超过2s。如通电时间过久，则因点火而产生的热会影响测定结果的精确度。 (3)燃烧后期(末期)。燃烧期结束即为燃烧后期(末期)的开始。其目的在测定热由内筒传向外筒的速度，亦须每分钟读记温度1次，至每分钟温度变化不大时为止，需5,10min。燃烧后期的终点，即为全部试验期的结束(定为d点)。 3 结束工作 测定温度后，停止搅拌器。首先取下温度计，然后从内筒取出搅拌器及氧弹氧弹应静置30min，使能溶解的气体完全溶解。然后将排气口打开，使氧弹中剩的氧气和二氧化碳在5,10min徐徐排出。拧开螺帽，取出弹头，如氧弹内有黑烟或未燃尽的试样，则这个试验应作废。如燃烧成功，则小心取出烧剩余的引火丝，精确测量其长度或质量。用热蒸馏水仔细冲洗氧弹内壁、坩埚及进气阀、导气管等各部分，洗液及燃烧后的灰分移入洁净的烧杯中，供测定酸与硫的含量，以校正酸的生成热。在一般情况下，由于酸的生成热很小，约为4J，因此常忽略不计。 氧弹、内筒、搅拌器在使用后应用纱布擦干净。各塞门应保持不关闭状态，并用热风将其接触部分吹干，防止塞门生锈而不能密闭而漏气。 每次燃烧结束后，应清除坩埚中的残余物。普通坩埚可置于高温电炉中，加热至600?维持3,4min，燃去可能存在的污物及水分。白金坩埚可在稀盐酸中煮沸，也可用氟氢酸稍加热以去污，石英坩埚只能擦拭，因加热与用氟氢酸处理，都对 石英有损。 饲料燃烧热(总能)的计算 -1式中Q为饲料或粪、尿样品的燃烧热，kJ?g;K为热量计的水当量;T为主期 阶段最终温度，?;T为主期阶段最初温度，?;R为在T温度计刻度的校正值，?;0 R为在T时温度计刻度的校正值，?;H为用贝克曼温度计时，温度计上海一刻00 度相当于实际温度值，?;m为试样的质量，g;?T为热量计与周围空气的热交-1换校正值;b为点火丝的质量，g;q为点火丝的热值，kJ?g。 -1 样品两次平行测定结果允许相差不超过0.13kJ?g。 -1-1 点火丝热值:铁丝，6.69kJ?g;镍丝，3.24kJ?g-1;铜丝，2.51 kJ?g;-1铅丝，0.42 kJ?g。