人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性

人干细胞生长因子cDNA克隆、达和纯化及其造血种属特异性 人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性 作者: 原野，张云生，李秀森，郭子宽，刘晓丹，侯春梅，唐佩弦，毛宁【摘要】 人干细胞生长因子(human stem cell growth factor，hSCGF)是一种早期造血调控因子。已知人干细胞生长因子具有两种形式，包括全长分子hSCGF以及在Ca2+依赖糖识别结构域(calcium-dependent carbohydrate recognition domain，CRD)内缺失 78氨基酸的截短型分子hSCGFβ。hSCGFβ的造血刺激活性具有严格的种属特异 性。本研究目的在于探讨hSCGF能否协同刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖。为克服 hSCGF的cDNA GC含量较高的困难，本研究以两步PCR的方法从人胎肝cDNA文库(Clontech)中成功克隆hSCGF cDNA，进而将hSCGF成熟肽编码序列亚克隆于原核表达载体pGEX4T-2中，融合表达。研究结果表明，通过低温诱导 (28?)，重组表达产物主要以可溶蛋白的形式存在于裂解上清中，利用亲和层析纯化融合表达蛋白。对重组蛋白的造血刺激活性表明，不同于截短型分子 hSCGFβ，全长分子hSCGF能够刺激小鼠骨髓粒/单系造血祖细胞增殖。结论: hSCGF CRD不直接结合受体，可能具有其他生物学功能。 【关键词】 cDNA克隆 Cloning，Expression and Purification of Human Stem Cell Growth Factor cDNA and Its Species-specificity in Hematopoiesis Abstract Stem cell growth factor (SCGF) is an early-acting hematopoitic cytokine that has two isoforms including hSCGF with full length molecules and hSCGFβ，78 amino acids of which lost in the conserved calcium-dependent carbohydrate-recognition domain (CRD).It has been demonstrated that hSCGFβ is strictly species-specific in regulating he-matopoiesis.This study was aimed to explore whether human SCGF can exert synergistic stimulatory effect on heterogenous murine CFU-GM progenitor.Firstly，hSCGF cDNA was amplified from human fetal liver cDNA library by using two-step PCR.The hSCGF mature peptide coding sequence was subsequently placed at downstream of glutathione S-transferase (GST) sequence in GST gene fusion expression vector. The results indicated that there existed an additional 60 kD protein pared with mock BL21 when the cells hosting rebinant plasmid were induced with IPTG at 37?.SDS-PAGE analysis demonstrated that the GST-hSCGF fusion protein mainly existed in insoluble form.When induced at low temperature (28?)，the rebinant protein was mostly soluble.The GST-fusion rebinant protein was subsequently purified by using affinity chromatography.The clonogenic assay revealed that，unlike hSCGFβ，hSCGF had the granulocyte/ macrophage promoting activity (GPA) for murine bone marrow GM progenitor. It is concluded that，in contrast to human SCGFβ，the intact molecular hSCGF may have no species specificity，implying that CRD domain in human SCGFβ does not directly bind to corresponding SCGF receptor，but may have certain biological function. Key words human stem cell growth factor; CRD region; cDNA clone; fusion expression; hematopoietic species specificity 细胞因子在造血过程中起到十分重要的调控作用,1，2,。Mio等,3,1998年分离得到人干细胞生长因子(human stem cell growth factor，hSCGF)全长cDNA。该因子由323氨基酸组成，C端含有 1 个保守的 Ca2+ 依赖糖识别结构域 ( calcium dependent carbohydrate recognition domain，CRD)，因此属于C型凝集素(C-type lectin)超家族成员。hSCGF的另一命名为LSLCL，其基因已被定位于人染色体19q13.3，由4个外显子和3个内含子组成,4,。已知人干细胞生长因子具有两种形式，全长分子hSCGF和在CRD结构域内缺失78氨基酸的截短型分子hSCGFβ,5,。研究表明，截短分子hSCGFβ除具有协同刺激造血活性之外，还能协同VEGF诱导AC133阳性细胞向内皮细胞分化,5，6,。hSCGFβ的造血刺激活性具有严格的种属特异性，而全长分子hSCGF的同源性分析表明，人源hSCGF与鼠源的mSCGF在氨基酸水平上具有85.1%同源性，91%的氨基酸相似。为进一步探讨hSCGFβ的这种种属特异性是否与CRD结构域内部分缺失有关，本研究检测全长分子hSCGF能否协同刺激小鼠粒/单系祖细胞增殖。初步研究结果表明，hSCGF可以作用于小鼠骨髓粒/单系造血祖细胞。 和方法 材料 LA Taq DNA聚合酶(with GC buffer)购自大连宝生物工程公司。T载体pGEM-T easy 为Promega 公司产品。DNA连接酶，CIP(小牛肠碱性磷酸酶)以及各种限制性内切酶分别购自LTI、Promega及大连宝生物工程公司。原核融合表达载体质粒pGEX-4T2及宿主菌BL21(DE3)均为本院陆承荣博士惠赠。亲和层析柱GSTrap FF 购自Amersham Pharmarcia 公司。 hSCGF cDNA克隆及鉴定 引物 上游: 5′ CGCGAATTCGCCACCATGGAGGCAGCCTGGCTTTT 3′;下游: 5′ CGCGGATCC CTATTAGAAGGGGAACTCGCAGACGTAGTA 3′。 PCR 反应: 30 μl体系含PCR3 μl(1 μg)，2×GC buffer I (TaKaRa)15 μl，dNTP (2.5 mmol/l each) 3 μl，上，下游引 物各 1.5 μl，LA Taq DNA聚合酶 1.5 U，dd H2O补足至30 μl。模板95?变性2分钟，开始PCR循环: 95? 20秒，72? 2分钟，共30个 循环，然后72? 保温5分钟。 PCR产物克隆与鉴定 PCR产物回收后，连接于pGEM-T easy转化于受体菌，单酶切鉴定重组质粒，由大连宝生物工程有限公司测序。 hSCGF成熟肽编码序列的扩增及融合表达载体质粒的构建 引物 上游: 5′ GGATCCGGTCACGGTGCTCGTGGTGCTGAACGTGAGTGGGAGGGA 3′ 其中斜体下划线部分为BamH I 识别位点。从后面的GGT开始为去掉了信号肽的hSCGF成熟肽编码序列。下游: 5′ GGATCCCTATTAGAAGGGGAACTCGCAGACGTAGTA 3′ 其中斜体下划线部分为BamH I 识别位点，后面黑体为两个串联的终止密码子，相应于有义链TAATGA 。PCR 反应参数同前。回收PCR产物，与T载体连接，构建中间质粒pTsMT。测序后以BamH I切出0.9 kb 左右大小的成熟肽编码序列DNA片段，亚克隆于融合表达载体pGEX-4T2(Pharmacia)相应位点，构建融合表达质粒，命名为pGSC 。 重组表达 重组质粒pGSC转化BL21(DE3)感受态细菌。挑单菌落37?震荡培养。培养物分别以1/100稀释接种于液体LB(Amp+)，37?震荡培养至OD600约0.8。分别加诱导物IPTG至0. 1、0. 5、 1.0、 1.5和2.0 mmol/L 。继续于37?，235 rpm震荡培养2小时，SDS-PAGE分析诱导表达结果。 重组蛋白存在形式的分析 取37?诱导表达产物超声破碎菌体离心收集上清，将沉淀重悬于PBS。分别取上清及沉淀以SDS-PAGE分析重组蛋白存在形式。 低温诱导表达及诱导表达重组蛋白存在形式的分析 具体方法同前，将诱导温度改为28?。 重组蛋白纯化 4?离心收集200 ml 28?诱导培养物，重悬于10 ml PBS(pH 7.3，含PMSF)中。超声破碎后离心，收集上清存于4?备用。层析柱GSTrap FF以PBS(pH 7.3)充分平衡，将存于4?的菌体破碎、离心上清以0.5 ml/min的速度上样，之后以PBS(pH 7.3)0.5 ml/min的速度洗柱至基线。以浓度为15 mmol/L的还原型谷胱甘肽(GSH，溶于50 mmol/L Tris.HCl，pH 8.0)洗脱重组蛋白。SDS-PAGE分析纯化结果。 融合蛋白协同刺激造血活性的初步分析 以Ficoll( 1.083 mg/ml，Sigma)常规法分离10周龄BALB/c小鼠骨髓单个核细胞，进行半固体集落培养。实验分为rmGM-CSF (5 ng/ml)组、rhSCGF组和混合组。各组设3个重复，置于37?、5% CO 天，然后计数，大于50个细胞计为1个集落。 2、饱和湿度条件下培养7