胆固醇测定实验讲义

实验12 直接皂化-比色法测定鸡蛋中胆固醇含量 一、原理 当固醇类化合物与酸作用时,可脱水并发生聚合反应,产生颜色物质。因此可先对食品样品进行皂化和提取,用硫磷铁试剂作为显色剂,测定食品中胆固醇的含量。 在样品的冰乙酸提取液中加磷硫铁试剂,胆固醇与试剂反应产生紫红色化合物,颜色的深浅与胆固醇的量成正比,可用分光光度计在波长560nm?处测定。 二、实验仪器及试材 1.仪器:分光光度计、水浴锅 2.试剂:本实验用水均需用蒸馏水或去离子水。试剂纯度均为分析纯。 (1)石油醚(沸点30-60℃)、无水乙醇、冰乙酸。 (2)50%氢氧化钾溶液:称取50g氢氧化钾,用蒸馏水溶解,并稀释至100mL。 (3)25%氯化钠溶液:称取25g氯化钠,用蒸馏水溶解,并稀释至100mL。 (4)10% 三氯化铁溶液:将10g FeCl3·6 H2O溶于磷酸中,定容至100 mL,储于棕色瓶中,冷藏保存。 (5)磷硫铁试剂:取10% 三氯化铁溶液1.5mL于100mL棕色容量瓶内,加浓硫酸定容至刻度。 (6)胆固醇储液:准确称取胆固醇100mg,溶于冰乙酸中,定容至100mL。 (7)胆固醇标准溶液:临用前将储液用冰乙酸稀释10倍。 三、实验方法与步骤 1.样品胆固醇提取 准确称取充分混匀的鸡蛋约0.20g于25mL具塞比色管中,加入0.5mL50%氢氧化钾溶液和4.5mL无水乙醇,振荡混匀,在80℃恒温水浴中皂化20min。皂化时每隔5min振摇一次使皂化完全。皂化完毕,取出比色管,冷却。加入 3mL 25%氯化钠溶液后再加入10mL石油醚,盖紧玻璃塞,振摇1min,静置分层。 取上层石油醚液1mL,置于25mL具塞比色管内,在65℃水浴中让石油醚自然挥发干,加入4mL冰乙酸,轻摇使胆固醇溶解,待测。 2.样品和标准胆固醇含量测定 另取两支25mL具塞比色管,一支(空白管)加入4mL冰乙酸,一支(标准管)加入1mL胆固醇标准溶液(0.1mg/mL)和3mL冰乙酸。包括样品管,各 管分别加入2mL磷硫铁试剂,混匀,25℃放置20min后在560nm波长下比色。以空白管调零,测得吸光度。 四、计算 鸡蛋胆固醇(mg/100g)= A 样/A 标╳ 0.025mg/mL╳4mL╳10mL/1mL╳100/M 样 g = A样/A标╳100/M样(mg/100g)五、实验注意事项 浓硫酸、强碱溶液具有腐蚀性,小心操作。 六、思考题: 1.举例说明胆固醇测定的其它方法。 2.实验中样品皂化的作用是什么?