核酸的分子杂交技术及其应用.doc

核酸的分子杂交技术及其应用.doc 核酸的分子杂交技术及其应用 1 概 述 核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量特异RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。 在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。作为检测工具用的已知RNA或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。它常常用放射性同位素来标记。 虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。 2 核酸探针的制备 核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法: 2.1 DNA的切口平移 双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶?可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’?3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。常用于在双链DNA上打开切口的酶为胰DNA酶?。由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备 832比活度大于10计数/(分.μg)的P标记的DNA探针。 2.2 单链DNA探针的制备 与传统的双链探针相比，单链探针由于不存在互补链，因此可以消除由探针的两条链重退火形成无效杂交体的可能。最常用的是以M13噬菌体载体合成单链DNA探针的方法。其主要原理是用人工合成的寡核苷酸引物(其序列与载体上固定区段的序列相互补。可从生物试剂公司直接购买)与来自重组M13噬菌体的单链DNA退火，然后以此寡核苷酸作为引物在大肠杆菌DNA聚合酶?Klenow大片段催化下合成互补的放射性标记DNA。 2.3 单链RNA探针的制备 首先将感兴趣的DNA序列克隆到带有SP6噬菌体或T7及T3 噬菌体的启动子的重组载体质粒中。由于这些重组质粒带有的强启动子能被噬菌体的依赖DNA的RNA聚合酶所识别。因此，当把线状质粒与适当的依赖DNA的RNA聚合酶及4种rNTP(核糖核苷三磷酸)在体外混合并温育时，就可在噬菌体启动子处开始合成RNA。 单链RNA探针除具有单链DNA探针的优点之外，还具有:?合成效果高(模板可反复被转录);?用DNA酶?处理就可容易除去RNA探针中的模板DNA，而无需用凝胶电泳纯化;?RNA杂交体稳定性高，所以探针在杂交反应中产生的信号较DNA探针强，等优点。 3 杂交膜的准备 核酸的分子杂交可分成液相杂交和固相杂交两大类。液相杂交是将待检测的核酸样品和同位素标记的杂交探针同时溶于杂交液中进行反应，然后分离杂交双链和未参加反应的探针，用仪器计数并通过计数杂交结果。固相杂交是把欲检测的核酸样品先结合到某种固相支持物上，再与溶解于溶液中的杂交探针进行反应，杂交结果可用仪器进行检测，但大多数情况下直接进行放射自显影，然后根据自显影图谱分析杂交结果。目前，固相杂交技术的发展较快，而且应用范围更为广泛。 目前使用最多的固相支持物是硝酸纤维素(NC)膜。它对单链DNA有较强的吸附作用。RNA经过一些特殊变性剂处理后，也能较容易地结合到NC膜上。下面介绍固相杂交反应中常用的几种将核酸样品转移到膜上的方法。 3.1 点印迹的直接点样法(Dot blotting) 这是一种能快速而且简便地检测样品中微量核酸的常用技术。其方法主要是将待测样品直接在NC膜上，然后进行杂交检测。其主要过程包括膜的处理、点样、变性、中和、干燥固定以及变性剂去除(检测RNA法)等。 3.2 DNA转移(Southern blotting) 用于点印迹的DNA直接点样法具简单、快速、灵敏度高等优点，但不能确定特异DNA序列的大小和定位。1975年Southern氏建立了吸附转移法硝酸纤维素膜杂交。其主要原理是利用滤纸对水的毛细管吸附作用，将经限制酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离的的DNA片段转移到固相杂交膜上，此时的DNA片段还保留着原来凝胶中的分布图式。然后再用探针进行杂交。 3.3 RNA转移(Northern blotting) 这是在Southern blot的基础上发展的RNA固相杂交技术，其因两技术相类似而得名。其方法与Southernblot一样。但RNA需先经乙二醛等变性剂处理后，再于合适的条件下电泳，这样便能使充分变性的RNA像变性DNA一样直接转移到NC膜上。固定之后除去变性剂，再进行杂交，可大大提高杂交的敏感性，每条区带所需的RNA量可从500pg降低到1pg以下。 此外，由于有时需要分离的核酸样品分子量很小，用琼脂糖凝胶不能达到要求的分辨率。这种情况下往往需要聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行分离，而由于这种胶的孔经较小，用前述的吸印转移法转移速度缓慢，易造成转移不完全。为了解决之一问，发展了电泳 转移法。即以电泳的方法使分离后的待测核酸样品从凝胶转移到NC膜或DBM纸等固相支持物上，再进行杂交。 3.4 用于原位杂交的菌落转移 在基因克隆操作中，为了在众多转化菌落中筛选带有目的基因的重组克隆，常用的方法是用标记的探针通过原位杂交找出带有互补序列的目的基因。主要步骤包括长好菌落、制膜、NC膜上菌落的裂解及膜上核酸的固定等。 4 固相杂交反应 核酸样品经直接点样或转移到NC膜上并经真空干燥后，即进行杂交反应。在杂交液中，NC膜上变性核酸样品与变性后的标记探针在一定条件下形成杂交双链，然后通过仪器计数或放射自显影判定结果。主要步骤如下。 4.1 预杂交 目的在于消除NC膜对探针的非特异性结合，降低杂交背景。将膜在2×SSC中浸泡2分钟。然后将膜放入盛有预杂交液,6×SSC、0.05×BLOTTO(1×BLOTTO:5%脱脂奶粉。含0.02%叠氮钠),的杂交管中，于68?杂交炉中温育1,2hr。 324.2 杂交 将P标记的双链DNA探针100?加热5分钟变性，迅速置冰浴中冷却。然后加入预杂交液中混匀，于68?下杂交16,18小时。 4.3 洗膜 将膜置于大体积2×SSC和0.1%SDS溶液中，于室温下轻轻振摇5分钟，反复2次。又于68?下用1×SSC和0.1%SDS溶液洗2次，约1,1.5小时。 4.4 放射自显影 将膜在纸巾上凉干，用Saron膜(或冰箱保鲜膜和微波炉用膜)将NC膜做成一夹心包装，用放射性墨水制作的圆点标签在Saron膜上作几个不对称的标记。然后置X光片暗盒中，黑暗下加X光片并加增感屏于-20?或-70?下曝光12,16小时。X光底片经显影、定影及冲洗后，利用放射性墨水留下的标记对准NC膜与底片的位置，并与凝胶电泳相片或菌落主板相对比，鉴定阳性核酸带或菌落。 5 分子杂交技术的应用 Southern印迹技术用来检查DNA样品中是否存在有某个特定的基因，特异性非常高，而且还可知道其大小及酶切位点的分布，尽管其操作比较复杂;Northern印迹技术则用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录;点印迹则仅需要一滴液体的样品，就可快捷地检查出其中是否有某个基因，但不能检出基因的大小或重复的程度;菌落原位杂交技术则是基因克隆中，从众多克隆中快速筛选出阳性克隆的最常用的一种方法。 V.Davis(1990)通过病毒基因组的随机引物逆转录制备了IBDV的互补DNA探针。在点印迹中，探针不能区分病毒的疫苗株、田间株以及突变株，但在很严格的条件下也可获得一些特异性。V.Vakharia用按澳大利亚IBDV序列合成的引物以及pGEM系统，制备了已知起始位点的克隆。将从Delaware E株、Grayson株和STC毒株获得的RNA从琼脂糖凝胶转移到膜上并用放射性标记的探针检查。只需1小时的放射自显影。但探针不能区分病毒的不同毒株。 他用非放射性的地高辛配基系统也获得了好的杂交结果。 Shaohua Zhao等(1990)通过将滑液膜支原体(MS)的WVU1853株克隆到质粒载体pUC18上，并用大肠杆菌转化，构建了MS的基因文库。在点印迹中，4个转化的克隆与放射性磷标记的MS染色体DNA杂交，但与MGS6株的染色体DNA则没有杂交。在Southern印迹中，所有氯化铯纯提的重组质粒克隆都含有2个长度在1.0,2.3kbp的MSDNA片段。用4个重组质粒制备的探针在点印迹中与MS的WVU1853株和9个田间株均可杂交，但与MG及禽支原体其它15个种均无杂交。 M.L.Khan等已制成用来区分MG致病株和疫苗株的DNA探针。对于MG感染的快速诊断，他将株和种特异性的DNA探针直接应用在田间样品的点印迹检测上。将1毫升的样品培养液吸到膜上，然后用探针检查。株特异性的探针具有与MG疫苗株相同的、长度为6kbp的基因序列，它能特异性地检出经MGF株苗免疫的鸡群。种特异性的探针含有1个9kbp的插入片段，它可检测出所有的MG，而与其它的鸟类支原体则无交叉杂交。 M.Jenkins用Southern印迹来研究球虫的基因表达、基因的基因组构成以及它们在球虫不同种的分布。能特异性地鉴别球虫特定的发育阶段的探针也已制备。此外，还研制出了以诊断为目的、具有种特异性的其它探针。 K.S.Henderson等(1990)通过点印迹法，用cDNA探针来检测感染鸡体内的IBDV抗原，并用琼脂扩散试验和免疫荧光试验来作比较。 结果用后两种方法在接种病毒2天后即可从鸡的组织中检出病毒抗原，检出的持续时间分别为3天和4天。而用点印迹法在接种病毒后1天即可检出病毒抗原并且在整个试验期里(24天)均可检出。这表明点印迹法比其它两种方法都敏感。 K.P.Snipes等(1990)应用REA及Southern印迹法可将分离自火鸡的多杀性巴氏杆菌的疫苗株(M9)和致病株相鉴别，尽管两者在血清型或荚膜型、生化特征、抗药性、全细胞蛋白的PAGE图以及质粒的内容等方面完全相同。为禽霍乱流行病学研究提供很有用的工具。除上述这些应用之外，分子杂交技术还可用于进行细胞原位杂交。此项技术是在保持细胞，甚至单个染色体形态的情况下，检查细胞内某些基因位置的一种有效的分子工具。它在诊断生物学、发育生物学、细胞生物学、遗传学和病理学研究上均得到广泛的应用。原则上它保持了核酸和细胞的形态，用标记的探针与之杂交，最后显影。影响试验的因素包括基因的性质及探针的大小。在包埋的或冰冻的切片中的待检样品用固定剂处理。交联固定剂如甲醛，可降低细胞的渗透性，这样反过来就需要较小的探针才能使之透入细胞，结果就使此方法的灵敏度下降。因此，固定剂及探针的选择是关键。探针可用被荧光标记或与酶联结的放射性核苷酸来标记。原位杂交是一项很难掌握的技术。因为许多的实验条件都很关键。 E.Tanizaki等(1990)用生物素标记的探针与经福尔马林固定的鸡皮肤上皮细胞进行原位杂交，以检查禽痘病毒(FPV)在感染细胞内的分布。结果表明FPV的DNA局限于细胞浆内。 D.Tripathy发展了一种凝胶原位杂交。杂交可接在琼脂糖凝胶上进行，而不需将其转移到固体载体上。由于减少了一个步骤和取消了膜的使用，从而使此方法简单化、缩短了时间，而且减少了经费的使用。