双萤光素酶分析实验操作步骤双荧光报告基因检测系统简明操作步骤
试剂准备:
磷酸盐缓冲液(PBS)
PBS 缓冲液,10X (每升)
11.5g Na2HPO4
2g KH2PO4
80g NaCl
2g KCl
溶于1 升无菌去离子水中。1XPBS的pH应为7.4.
1. 制备被动裂解缓冲液1×PLB:将1 倍体积的5×Passive Lysis Buffer(PLB)加到4 倍体积的蒸馏水中。混合均匀。储存在4℃(≤1 个月)。建议每次使用前配制新鲜的1XPLB。5XPLB 应储存在-20℃。
2.LARⅡ:用Luciferas...
双荧光
基因
系统简明操作步骤
试剂准备:
磷酸盐缓冲液(PBS)
PBS 缓冲液,10X (每升)
11.5g Na2HPO4
2g KH2PO4
80g NaCl
2g KCl
溶于1 升无菌去离子水中。1XPBS的pH应为7.4.
1. 制备被动裂解缓冲液1×PLB:将1 倍体积的5×Passive Lysis Buffer(PLB)加到4 倍体积的蒸馏水中。混合均匀。储存在4℃(≤1 个月)。建议每次使用前配制新鲜的1XPLB。5XPLB 应储存在-20℃。
2.LARⅡ:用Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶解冻干粉Luciferase Assay Substrate。存于-20℃(≤1 个月)或-70℃(≤1 年)。
3.Stop & Glo 试剂:
a. 取2.1ml 50×Stop & Glo? Substrate 加到105ml的Stop&Glo? Buffer。在提供的棕色Stop&Glo? Reagent 瓶中,振摇10 秒。在-20℃存15 天。
b.若配制少量的1×Stop & Glo? Reagent:将一定量的50×Stop & Glo? Substrate 加入到所需要量的Stop & Glo? Buffer 中,使终浓度成为1 倍浓度。
(例如,加0.2ml的50×Stop & Glo? Substrate到10ml 的Stop & Glo? 缓冲液中,制成1×Stop & Glo? Reagent 溶液。)
细胞裂解
1.除去培养细胞中的培养基。
2.用1×PBS 清洗培养细胞。去掉清洗液。
3.按推荐体积(见下表)将1×PLB 加入到培养孔中。
第3步中使用的1×PLB体积
被动裂解主动裂解
培养板1×PLB 平板大小1×PLB
6 孔500ul 100×200mm 1ml
12 孔250ul 60×15mm 400ul
24 孔100ul 35×12mm 200ul
48 孔65ul 6 孔250ul
96 孔20ul 12 孔100ul
4.被动裂解:在室温轻缓晃动培养板15 分钟,把裂解液
转移到检测试管中。
结果检测
a.检测96孔板中的样品:
开始之前:
设置自动进样器1 和 2 分别分装100ul 的LARII 和Stop&Glo?试剂。
测量时,使用1-2 秒延迟和5-10 秒读数。(在萤光发光仪上(Luminometer)之内)
1、加入≤ 20ul PLB裂解液/孔
2、加入100ul LARII
3、检测萤火虫萤光素酶
4、加入100ul Stop&Glo? 试剂
5、检测海肾萤光素酶的活性
6、其它孔如此循环操作。
b.用手动或配有单自动进样器的萤光发光仪进行检测:
1、事先在检测管中加入100ul LARII
2、转移20ul PLB 裂解液到检测管中,混合。
3、检测萤火虫萤光素酶的活性
4、向检测管中加入100ul Stop&Glo? Reagent
5、检测海肾萤光素酶活性
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