母乳蛋白质组学研究_王静(可编辑)
chinadairynet 中国乳品工业
rpgychinajournalnetcn
母乳蛋白质组学研究
1 2 2 2 1 1
王静 王利红 高艳 张成岗 邹丽萍 王航雁
中国人民解放军总医院小儿内科北京 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京
1 100853 2
100850
摘 要建立并
一种去除母乳中高丰度蛋白的
富集低丰度蛋白通过蛋
白质组学技术探索母乳中的重要活性蛋白 选取了30
个不同等电点及分子量区域的孤立蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定 通
过Mascot搜索引擎检索UniProt数据库 确定蛋白质信
息 结果表明母乳中的 种高丰度蛋白均得到一定程度的去除并通过蛋白质
组学技术鉴定出 个蛋白发现母乳中低丰度的蛋白如
4
29
补体 的片段维生素 结合蛋白 家族等
C3 D A NDRG
关键词母乳多克隆抗体制备高丰度蛋白免疫亲和层析蛋白质组
中图分类号 文献标识码 文章编号
TS2521 A 1001-2230 2009 01-0004-06
Proteomics analysis of brest milk
1 2 2 2 1 1
WANG Jing WANG Li-hong GAO Yan ZHANG Cheng-gang ZOU Li-ping WENG Hang-yan
1Department of Pediatrics Chinese PLA General Hospital Beijing 100853China
2Department of Neurobiology Institute of Radiation Medicine Beijing 100850China
AbstractWe established and evaluated a method for removing high-abundance proteins in breast milk The method enables enrichment of
low-abundance proteins and study of important proteins in breast milk by proteomicsThirty protein spots in the 2-D gel were identified with
MALDI-TOF-MS The peptide mass fingerprints were analyzed by Mascot searching in the UniProt database to identify the proteins In our
study four high-abundance proteins in breast milk were removed with different efficiencies Furthermore 29 proteins were identified in our
study including complement fragments chain A of vitamin D binding protein and NDRG3 Therefore our study established a novel method
for the enrichment of low-abundance proteins in breast milk and identified novel low-abundance proteins
Key words breast milk polyclonal antibody high-abundance proteins immuno-affinity chromatography proteomics
[4]
血浆
蛋白质组
所面临的挑战相同由于标本上
0 引 言
样量
的限制低丰度蛋白检出率低而很多低丰度蛋
母乳作为婴儿理想的天然食物 除了蛋白质脂
白很可能正是信号转导和生物调控等生命活动中的
肪碳水化合物矿物质微量元素等为婴儿生长发 关键蛋白 目前除去高丰度蛋白富集低丰度蛋白是
育提供能量与营养物质外还含有丰富的生物活性物 解决研究瓶颈的主要策略
质在增强婴儿抗感染能力促进组织器官发育建立 本研究将母乳样品中的全部蛋白作为混合抗原
自身免疫系统乃至调节婴儿社会行为等多方面发挥 免疫动物制备多克隆抗体通过免疫亲和层析技术将
着重要的生物学功能其中包括占母乳总蛋白量20 所制备的抗混合抗原的抗体进行结合并洗脱达到除
40 的酪蛋白乳铁蛋白免疫球蛋白细胞因子生长 去部分高丰度蛋白富集低丰度蛋白的目的进行进
[1 2]
因子激素和酶类等 已有学者采用利用蛋白质组
一步蛋白质组学研究
[3]
学技术路线来探索母乳中尚未报道的蛋白 与国际
, 材 料
收稿日期
2008-05-20
1(1 试剂与仪器
基金项目北京市自然科学基金项目7053080
作者简介王静 1976- 女主治医师研究方向为母乳对婴儿发育的 福氏佐剂CNBr- 活化的Sepharose 4B Protein
层析
影响 AG agarose Western Blotting Luminol Reagent
年第 卷第 期总第 期
4 2009 37 1 2 18
Research Papers 研究
预装柱抗人酪蛋白单克隆抗体抗人乳铁蛋白单克 干式电转仪转至醋酸纤维素膜上质量分数为 脱脂
5
隆抗体 抗人白蛋白单克隆抗体及抗人 抗体辣 奶粉的 封闭过夜 再分别以含抗人酪蛋白单克隆
IgA TBS
根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体 其他试剂为国产
抗体 ? 抗人乳铁蛋白单克隆抗体 ?
1 2000
1 2000
分析纯 固相 梯度等电聚焦仪 抗人
白蛋白单克隆抗体 ? 及抗人 抗体 ?
pH IPGphor IEF System 1 1000 IgA 1
垂直板电泳仪 质 的
缓冲液中室温孵育 用 缓
Ettan DALT Six MALDI-TOF-MS 1000 TBS-T
15 h TBS-T
谱仪 冲液洗涤5 min 4
次分别放入辣根过氧化物酶标记
母乳的采集 的羊抗鼠抗
体 ? 的 缓冲液室温孵育
1(2 1 3000 TBS-T 1 h
收集 位产后 母亲的初乳 采集样本前
缓冲液洗涤 次最后用化学发光试剂
10 25 d 5 mL TBS-T 5 min 4
用酒精棉球消毒乳头及收集者的手人工挤压法将乳 对膜进行发光反应并感光于柯达 光片上显影
X
汁直接挤入消毒的试管内在4 ? 2 000 g离心20 min 2(5
双向电泳
避开上层的脂质层吸取乳清部分将 份样本混合
将母乳蛋白样本超滤离心
10
10 ku Microcon YM-
法测定蛋白质量浓度分装并冻存于 冰箱 浓缩脱盐 法测定蛋白质量浓度确定上
BCA -70 ? 3 Bradford
中待检 样量 体
积 胶
750 μg 450 μL 24 cm pH 3-10NL IPG
实验动物 条 重水
化 随后等电聚焦总电压时间积为
1(3 20 ? 14
h
月龄左右的雌性日本大耳白兔 只 体重约 平衡胶条第二向 电泳将胶条移
3 3 2 70 kVh
SDS-PAGE
由本院动物中心提供 至 聚丙
烯酰胺凝胶上端 电泳条件设置为恒定电
25 kg 12
流20 mA胶30 min
后改为恒定电流30 mA胶
2 方 法
电泳至指示剂溴酚
蓝前沿达胶底线 考马斯亮蓝染
2(1 母乳多克隆抗体的制备 色扫描
胶图
母乳样本经完全福氏佐剂乳化后 终质量浓度
2(6 质谱鉴定
皮下多点注射免疫日本大耳白兔 免疫剂量 胶内酶切切取双向电泳胶上蛋白点 2 大
4gL
1,2mm
只 免疫前取兔耳血留作正常血清对照 在初 小置离心管中加入 脱色液浸泡并振荡重
125mg 100 μL
次免疫后的第 周分别以等量的抗原与非完全福 复此步骤至蓝色褪尽真空干燥加入 胰蛋白酶
4 6 8
15μL
氏佐剂乳化进行加强免疫 并于加强免疫后第 取
10d 酶解液 放置
待被胶块吸收后补充酶解
4 ? 30
min
耳血间接ELISA法测定抗体效价当抗体效价达到105 缓冲液使胶完全浸没 孵育 过夜 向胶块中
37 ? 16 h
以上时从动物颈动脉放血分离血清 加入
肽提取液 水浴 收集上清再加
100 μL I 40 ? 1 h
2(2 母乳多克隆抗体的纯化 入 肽提取液 水浴 收集上清合并上
100 μL II 30 ? 1 h
将Protein AG agarose 装柱 操作步骤按
清真空干燥 采用MALDI-TOF-MS质谱仪肽质量
进行将收集的抗母乳蛋白的兔血清在纯化柱中孵育
指纹谱鉴定蛋白采用Mascot搜索引擎检索UniProt数
30 min 先后以浓度为100 mmolL 及10 mmolL 的 据库检索参数如表 所示
1
Tris-Cl pH 80 洗涤最后用浓度为100 mmolL甘氨 表 蛋白点数据库检索参数
1
酸 pH 30 洗脱分管收集洗脱液经SDS-PAGE 电 Type of
search 检索类型 Peptide Mass Fingerprint 肽质量指纹谱
泳将含有抗体的洗脱液合并 Database数据库 NCBInr
2(3 母乳的免疫亲和层析 Taxonomy物种 Homosapiens human 人
参照说明书操作步骤 将纯化后的母乳多克隆抗 Enzyme酶 Trypsin胰蛋白酶
体与CNBr-活化的Sepharose 4B偶联并装柱柱体积为
Modifications修饰 Carbamidomethyl C 半胱氨酸碘乙酰胺化
15 mL 基于抗原与抗体结合的特异性母乳经045 μm
Oxidation M 氧化
Mass values 肽段值 Monoisotopic单同位素峰
的滤纸加压过滤用纯水稀释至15 ml 约8mg 室温下
Protein mass蛋白质量 Unrestricted不限
在层析柱内孵育30 min过柱收集过柱液以15 mL浓
Peptide mass
tolerance 03u
度为100 mmolL的Tris-HCl洗涤出大部分未与抗体结
可接受的肽段质量误差
合的母乳蛋白 收集此段洗涤液作为去除高丰度蛋白
Peptide charge state 1
的母乳再充分洗涤层析柱后用浓度为200 mmolL 的
肽段电荷
甘氨酸 pH 20 洗脱与抗体上结合的蛋白分管收集 Missed Cleavages 1
洗脱液平衡及再生亲和层析柱将收集到的样本进行 允许漏切的酶切位点数
SDS-PAGE 电泳合并含有洗脱蛋白的洗脱液
3 结 果
2(4 Western-blot法对免疫亲和层析效果验证
将母乳与免疫亲和层析收集到的非特异洗脱液 3(1 抗母乳蛋白多克隆抗体的制备纯化
5
去高丰度蛋白后的母乳 进行 电泳经半 于免疫第 周后测定兔抗血清效价已达 以上
SDS-PAGE 8
10
Vol37 No1 2009 total 218 5
研究报告Research Papers
收集抗血清过Protein AG agarose亲和柱纯化 抗血 组结果中均有显影考虑为非特异性条带尽管如
清经纯化后出现明显的IgG 55 ku 的重链带和24 ku 的 此该条带也有减弱趋势仍能提示乳铁蛋白有所
轻链带 见图 去除
1
分泌型 分
子量为 [6] 箭头所指的特
3 IgA
7880 ku
异性条带消失提示
分泌型 被有效去除
IgA
人血清白蛋白
是血浆中的高丰度蛋白 占血浆
4
蛋白的5070 [7] 蛋
白分子量为67 ku 本研究用人
血清白蛋白抗体跟踪了母乳中血清白蛋白被屏蔽的
效果结果显示箭头所指的约66 ku处及31 ku处的条
带有消失考虑
处为白蛋白条带 处的条带
66 ku
31 ku
可能为白蛋白的片段 因此提示血清白蛋白的成分有
所去除
多克隆抗体纯化前 多克隆抗体纯化后
1- 2-
图 母乳的多克隆抗体纯化前后的比较
1 SDS-PAGE
3(2 母乳样品的免疫亲和层析
图 为母乳免疫亲和层析的 电泳结
2 SDS-PAGE
果 图 中每孔上样量 银染
2 4 μL
泳道为母乳亲和层析前后的比较可观察到
2 4 4
泳道中高丰度蛋白有所减少而在具有相同上样体积
的情况下一些新的条带显现出来 图中左箭头标注
泳道中可观察到在 及 左右有明显的高
710 80 60 30 ku
酪蛋白 乳铁蛋白 分泌型 白蛋白
A B
C IgA D
丰度蛋白洗脱下来
图3 Western-blot结果的比较
3(4 母乳双向电泳胶图
图 为母乳双向
电泳图谱 图 中考马斯亮蓝染
4 4
色 图中所
24 cm pH 3-10NL IPG 12 SDS-PAGE
标数字序号130蛋
白点为所鉴定蛋白点
图2 SDS-PAGE 电泳结果
图 中 为 为母乳 为母乳经孵育过
2 1 Marker 2 3
柱收集到的柱体积液 为洗涤液洗下的未与抗体结
4
合的母乳蛋白 去高丰度蛋白后的母乳5为洗脱液
管 为洗脱液 管 为洗脱液 管 为洗脱液
? 6 ? 7 ? 8 ?
管 为洗脱液 管 为洗脱液 管
9 ? 10 ?
3(3 Western-blot法对免疫亲和层析的验证
图 为母乳免疫亲和层析前后的 结
3 Western-blot
果的比较 图 中 为母乳 为经免疫亲和层析除去
3 a b
高丰度蛋白的母乳箭头所指的显影条带均在亲和层
析后的样本中消失或减弱 图中
图 母
乳双向电泳图谱
4
1 酪蛋白分子量约为3040 ku[2] 箭头所指条带
正位于此分子量区 提示酪蛋白在一定程度上被去 3(5 母乳蛋白质谱鉴定
除 切取 个蛋白点
进行质谱鉴定有 个蛋白点的
30
29
乳铁蛋白分子量约为 [2] 箭头所指条带 肽
指纹谱在数据库中检索到蛋白如表 所示
2 79 ku 2
符合其分子量范围经亲和层析后条带消失但其 其中 号蛋白点鉴定为 结合蛋白 链其肽
27 VD A
下方约 处的条带也很清晰 由于这 组使用不
指纹谱见图 所示 数据库检索分值如图 所示 图
66 ku 4 5 6 6
同的抗体分别与转至膜上的蛋白结合 该条带在
中获 分大于 分有意义
4 93 66 P 005
年第 卷第 期总第 期
6 2009 37 1 2 18
Research Papers 研究报告
表
质谱鉴定结果
2
蛋白 匹配 NCBInr 蛋白名称 分子量 匹配
编号 分值 编号 ku 序列数
1 186 gi2104522 Lactoferrin Incomplete at NH2 end 53615 13
2 193 gi386855 Lactoferrin 31418 12
3 155 gi2104522 Lactoferrin Incomplete at NH2 end 53615 14
4 122 gi20151212 Chain B Crystal Structure Of A
Domain-Opened Mutant R121d of The Human Lactoferrin 37533 9
N-Lobe Refined From A
Merohedrally- Twinned Crystal Form
5 121 gi20151212 Chain B Crystal Structure Of A
Domain-Opened Mutant R121d of The Human Lactoferrin 37533 9
N-Lobe Refined From A
Merohedrally- Twinned Crystal Form
6 154 gi2104522 Lactoferrin Incomplete at NH2 end 53615 12
7 140 gi20151212 Chain B Crystal Structure of A
Domain-Opened Mutant R121d of The Human Lactoferrin 37533 12
N-Lobe Refined From A
Merohedrally- Twinned Crystal Form
8 149 gi386855 Lactoferrin
31418 11
9 159 gi640200 Lactoferrin Copper And Oxalate Form 77899 16
10 155 gi4699853 Chain A Structure of Human Apolactoferrin At 20 A Resolution 77941 17
11 130 gi2104522 Lactoferrin Incomplete at NH2 end
53615 9
12 113 gi4699853 Chain A Structure of Human Apolactoferrin At 20 A Resolution 77941 10
13 148 gi386855 lactoferrin 31418 12
14 53 gi119596519 NDRG family member 3 isoform CRA_e 18299 4
15 106 gi146387599 Chain A Solution Structure of Human
Secretory Component 65388 8
16 243 gi178345 alloalbumin Venezia 71177 21
17 74 gi20151211 Chain A Crystal Structure of A
Domain-Opened Mutant R121d of The Human Lactoferrin 37533 8
N-Lobe Refined From A
Merohedrally- Twinned Crystal Form
18 164 gi28948741 Chain A Crystal Structure of Human
Seminal Lactoferrin At 34 A Resolution 77928 16
19 94 gi453155 keratin 9 62178 11
20 106 gi4699853 Chain A Structure of Human
Apolactoferrin At 20 A Resolution 77941
9
21 133 gi386855 lactoferrin 31418 9
23 79 gi20151211 Chain A Crystal Structure of A
Domain-Opened Mutant R121d of The Human Lactoferrin 37533 7
N-Lobe Refined From A
Merohedrally- Twinned Crystal Form
24 57 gi78101271 Chain C Human Complement Component
C3c 40204 6
25 50 gi400044 Immunoglobulin J chain 16041 4
26 50 gi400044 Immunoglobulin J chain 16041 4
27 93 gi18655424 Chain A Crystallographic Analysis
of The Human VD Binding Protein 52780 9
28 150 gi119626083 albumin isoform CRA_t [Homo sapiens] 60211 16
29 156 gi386855 lactoferrin 31418 10
30 84 gi2094891 Human Lactoferrin N-Terminal Lobe
Mutant With Arg 121 Replaced By Glu R121e 37207 6
图6 27号蛋白点Mascot检索UniProt数据库横坐标为得分该蛋
图 号蛋白点肽指纹 横坐标 质量电荷比纵
坐标为峰值 白点获 分大于 分有意义
5 27 MZ
93 66 P 005
Vol37 No1 2009 total 218 7
研究报告Research Papers
Of The Human Lactoferrin N-Lobe Refined From A
4 讨 论
Merohedrally - Twinned Crystal Form 9 号蛋白点为
本研究为去除母乳中高丰度蛋白实验方法的初
号蛋
Lactoferrin Copper And Oxalate Form 10 12 20
步探索建立了母乳多克隆抗体制备及纯化的技术路 白点为Chain A Structure Of Human Apolactoferrin At
线且证明使用这种混合蛋白抗原免疫动物所制备的
号蛋白点为
20 A Resolution 17 21 Chain A Crystal
复合性多克隆抗体能够较为有效地去除母乳中的高 Structure Of A Domain-Opened Mutant R121d Of
丰度蛋白并将去除高丰度蛋白的母乳样本利用蛋白 The Human Lactoferrin N -Lobe Refined From A
质组学技术平台进行研究对所获得的母乳双向电泳 Merohedrally- Twinned Crystal Form 18 号蛋白点为
图谱的部分蛋白质点鉴定发现了母乳中具有生物活 Chain A Crystal Structure Of Human Seminal Lacto-
性的蛋白
号蛋白点为
ferrin At 34 A Resolution 30 Human
早在 世纪 年代就有提取全脑组织的蛋白作
20 70 Lactoferrin N -Terminal Lobe Mutant With Arg 121
[8]
为混合抗原制备组织特异性抗体的报道 但并非为 Replaced By Glu R121e 初乳中含有大量的乳铁蛋
此目的而建立 显然抗体的生成受抗原的免疫原性 白及其片段在成熟乳中其成份明显减少 母乳喂
10
[5]
及免疫量等因素影响 母乳中主要含有酪蛋白分泌 养的婴幼儿的粪便和尿液中可检测出大量的乳铁蛋
型 乳铁蛋白及 乳白蛋白等 种高丰度蛋白已有 白片段 乳铁蛋白可抑制产毒的大肠埃希氏杆菌
IgA α 4
Es-
大量文献表明这 种蛋白都曾被制备出相应抗体证
4 cherichia coli 和弗氏志贺氏杆菌 Shigella flexneri 对肠
明了其免疫原性 且这 种高丰度蛋白在母乳中的质 道上皮吸附与侵袭在婴儿胃肠道发育抵抗病原体
4
量浓度均在100 mgdL以上能确保一定的免疫量 本
感染和损伤修复等方面有重要的生物学作用 在感染
研究通过Western-blot 法对免疫亲和层析效果进行验 早期 如病毒被吸收或扩散的阶段 部分乳铁蛋白在
证结果显示母乳经免疫亲和层析后这 种高丰度蛋
4 胃中的水解产
物可提高婴儿对单纯疱疹病毒巨细胞
白特异性显影条带均有减弱或消失提示所制备的抗 病毒HIV病毒等病毒的抵抗力乳铁蛋白还具有免疫
母乳复合性多克隆抗体中含有这 种高丰度蛋白的抗 调节活性可与细胞上的特异性受体结合使单核细
4
体通过免疫亲和层析可将高丰度蛋白去除 同时从 胞释放的白细胞介素1 IL-1 白细胞介素2 IL-2 白
图 可见 经免疫亲和层析后的母乳 电泳
2 SDS-PAGE 细胞介素6
IL-6 肿瘤坏死因子α TNF-α 及巨噬细
结果中看到新的蛋白条带显现出来提示低丰度蛋白 胞释放的前列腺素 减少 乳铁蛋白还可激活自然杀
E2
得到了富集 以上结果证明了该技术路线的可行性 伤细胞调节补体活性影响凝集素反应并可抑制由
但是也要考虑到抗体的产生是由抗原的免疫原性及 铁催化的过氧化物和过氧化氢形成羟基还可抑制脂
[9]
免疫量等因素决定的 虽然微量的低丰度蛋白产生 多糖介导的中性粒细胞的激活和内毒素诱导的细胞
抗体的可能性小且很难达到有效的效价仍不能排除 [211]
因子释放的过
程
有这些抗体存在的可能同时也会伴有其他蛋白的丢 免疫球蛋白及补体片段 和 号蛋白点
2 25 26
失 不过传统的方法从母乳中分离出各种蛋白成分 为组成分泌型 的单体
Immunoglobulin J chain IgA [12]
[3]
分别免疫动物制备抗体再进行免疫亲和层析 也会 分泌型 可在婴儿的呼吸道 肠道和泌尿生殖道等
IgA
存在分离的抗原不纯多次洗脱过程中蛋白被稀释以
[2]
粘膜表面抵抗
病原体感染 15号蛋白点Chain A So-
及有价值蛋白丢失等问题 lution Structure Of Human Secretory Component 为构
通过以上去除母乳高丰度蛋白的策略对我们所 成分泌型 的分泌型片段 有研究表明其还以自由
IgA
获得的去除高丰度蛋白后的母乳进行蛋白质组学研 片段形式存在 通过研究其片段的三维空间结构揭
究在母乳样本的双向电泳技术上因样本高脂高盐
[13]