医学论文-浙江汉族Rh DEL表型的分子机理研究

医学论文-浙江汉族Rh DEL型的分子机理研究 浙江汉族Rh DEL表型的分子机理研究 作者:陈安心， 吴俊杰， 徐凤娟， 张丽英， 倪映华， 傅启华 【摘要】 为了研究浙江汉族Rh DEL表型的分子机理，用吸收放散的血清学方 法鉴定Rh DEL表型，然后用RHD基因特异的聚合酶链反应-序列特异性 (PCR- SSP, polymerase chain reaction- sequence specific prime)和序列分析方 法鉴定DEL表型RHD基因的10个外显子和外显子,内含子连接区域可能的变 异。结果表明:在122例浙江汉族Rh阴性血型中共检测到35例DEL表型个 体，其中RhCCdee、 RhCcdee 和RhCcdEe表型分别有6例(17.14%)、28例 (80.00%)和1例(2.86%)。序列分析发现，Rh DEL表型个体的第9外显子 都有1227G>A突变。D杂合性试验发现，有29例(RhCcdee，28例; RhCcdEe，1例)存在RHD基因的缺失，有6例(RhCCdee)不存在RHD基因的 缺失。结论: RHD 1227A是浙江汉族Rh DEL表型个体的重要遗传标记。 【关键词】 Rh DEL表型; RHD 1227A等位基因; 浙江汉族 Molecular Basis of Rh DEL Phenotype in Zhejiang Han Population AbstractThis study was purposed to investigate the molecular basis of Rh DEL phenotype. Rh DEL phenotypes were identified by a serologic adsorption-elution method, the nucleotide sequences of ten RHD exons and exon-intron boundary regions were evaluated by a RHD gene-specific PCR-SSP (PCR-SSP, polymerase chain reaction- sequence specific primer) and sequencing. The results showed that out of 122 random Rh negative donors 35 Rh DEL phenotypes were identified through serologic method, including 6 RhCCdee(17.14%), 28 RhCcdee(80.00%), and 1RhCcdEe(2.86%). Sequence analysis indicated that all DEL phenotypes harbored a RHD 1227 G>A mutation in exon 9. D zygosity test revealed that 29 DEL phenotypes (28 RhCcdee and 1 RhCcdEe)had one RHD gene deleted , and 6 DEL phenotypes (6 RhCCdee) had homogenous RHD gene. It is concluded that RHD 1227A is an important genetic marker for Rh DEL phenotype in Zhejiang Han population. Key wordsRh DEL phenotype; RHD 1227A allele; Zhejiang Han population 位于人类染色体1p34-36的RHD基因和RHCE基因分别编码Rh血型系统的 抗原RhD和RhC/c、RhE/e，其中D抗原在输血医学和产科学中的意义最为显 著。一般称D抗原阴性的为Rh阴性血型，D抗原阳性的为Rh阳性血型。在中 国人群中约有-0.5,的个体是Rh阴性血型,1,，用吸收放散方法还可以从约20,的Rh阴性个体中检出一种极弱表达的D抗原，称为DEL抗原,2-6,。有关DEL表型的分子机理研究结果各地并不一致，且大部分报道集中在中国台湾人群,2-5,，国内只有有关深圳地区DEL表型的分子机理的研究,6，7,。最近的研究发现，DEL表型的血液输注给Rh阴性患者会产生抗D，因此对DEL抗原的免疫原性应该予以重视,8,。本研究对浙江汉族DEL表型做了血清学鉴定，并用序列分析方法对其分子机理进行了研究。 材料和方法 对象 在浙江省居住或者工作的无亲缘关系Rh阴性汉族献血员122名。 Rh表型血清学鉴定 RhD表型鉴定采用常规的盐水平板法，使用加拿大 Dominion公司生产的IgM和IgG混合的抗D试剂。RhC、Rhc、RhE和Rhe鉴定采用盐水试管法，试剂为Dominion公司生产的相应单克隆抗体。RhDEL表型采用吸收放散(氯仿)的方法鉴定，具体步骤见参考文献,9,。 RHD基因序列分析 参照参考文献,10,，根据RHD和RHCE基因内含子序列的差异设计10组特异扩增包括RHD 基因外显子及其侧翼序列的PCR-SSP引物(表1)。PCR反应总体积50 μl，含模板DNA 1 μl(25-50 ng)，特异性引物终浓度250 nmol/L，MgCl2 终浓度1.5 mmol/L(TaKaRa公司产品)，dNTP终浓度 200 μmol/L (Promega公司产品)，Taq酶1 U(TaKaRa公司产品)。PCR扩增条件: 95? 预变性5分钟，然后94? 变性30秒、64? (外显子1、2、3、7)，67? (外显子4、6、8、9、10)， 60? (外显子5)退火30秒和72? 延伸1分钟，循环35次，最后72?延伸10分钟。PCR扩增仪为PE2700型(Applied Biosystems公司产品, 美国)。 D杂合性检测 采用Perco等,11,的方法，用特异性引物μ1-s和rnb31 PCR检测Rhesus hybrid box(AJ252313, 4988-7710区域)。如果可以扩增得到2 778 bp的特异性片段，表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失;反之，则不存在Rhesus hybrid box，没有RHD基因的缺失。Table 1. Primers used in specific amplification and sequencing of RHD exons and their flanking regions(略) 结果 从122例Rh阴性随机人群中鉴定出35例DEL表型，其中RhCCdee、 RhCcdee 和RhCcdEe表型分别为6例(17.14%)、28例(80.00%)和1例()，结果见表2。在35例RhDEL表型中，对10例RhDEL表型的RHD基因序列分析发现都有位于外显子9的1227G>A突变，在其余9个外显子和剪接位点未发现突变。对剩余的25例RhDEL外显子9序列发现都有1227G>A突变。正常Rh阳性血型样本RHD基因1227位是G。序列分析图见图1。D杂合性检测表明，35例DEL阳性个体中有29例(RhCcdee，28例; RhCcdEe，1例)可以扩增得到2778 bp的特异性片段，表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失，占总DEL阳性标本的82.86,; 有6例(RhCCdee)不能扩增到2778 bp的片段，表明不存在RHD基因的缺失，占总DEL阳性标本的17.14,。Table 2. DEL phenotype detected among the random Rh negative popoulation(略) 讨论 与欧洲、非洲人群不同，亚洲Rh阴性人群中Rh DEL表型的比例很高，并且各地Rh DEL表型的分子机理不尽一致。欧洲DEL表型的分子机理在于有比较大的多态性。在Wagner等,12,的研究中，15例Rh DEL个体有7例是RHD 885T等位基因引起， 5例是RHD 1227A等位基因引起，3例是RHDIVS3+1A等位基因引起;最近报道的1例DEL表型是由RHD IVS5-38DEL4等位基因引起,8,。在亚洲人群中，假如除去早期分辨率较低的结果，日本3例Rh DEL表型中有2例是RHDIVS1+1A引起，1例是RHD 1227A引起,13,，韩国人群有RHD 1227A和RHD 1222C等位基因引起，分别占Rh阴性人群的15.9,和0.4,,14,。中国台湾人群Rh DEL分子机理主要有外显子9缺失和RHD 1227A 2种,3-5,。中国深圳人群的研究发现，Rh DEL主要由RHD 1227A引起，与3' 非翻译序列无关,6，7,。我们从122例浙江汉族Rh阴性随机人群中用血清学方法检测到35例为DEL阳性，占总人群的28.69,，其中RHCCdee占17.14,，RHCcdee占80.00%，RhCcdEe占2.86%。我们对10例Rh DEL表型RHD基因全序列分析发现都有位于外显子9的1227G>A突变，在其余9个外显子和剪接位点未发现突变。对剩余的25例Rh DEL样本我们采取了Wagner等,12,的研究策略，只分析外显子9序列,发现都有1227G>A突变。这和Lee等,4,及Chang等,5,的研究结果有差异，其原因可能是人群地域不同所致。结合外显子9的序列检测结果和D杂合性检测结果，35例DEL阳性个体中有29例(82.86,)是RHD 1227A半合子，6例(17.14,)是RHD 1227A纯合子。以上结果和Chen等,3,， Shao等,6,的研究结果基本一致，表明浙江汉族Rh DEL表型的分子机理和中国深圳以及部分台湾地区的一致,3，4，6,，由RHD 1227A等位基因引起。运用1227A这个遗传标记，可以设计简便的基因分型方法用于浙江汉族Rh阴性人群中DEL表型的鉴定。RHD基因1227G>A的突变并没有导致编码氨基酸的替换，这可能影响RHD基因的转录，从而影响D抗原的表达，更深的机理有待于进一步的研究。 【参考文献】 1 王晓珠，兰炯采，吴绪华等. 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