[doc格式] 高铁肌红蛋白还原酶活力测定方法的优化
高铁肌红蛋白还原酶活力测定方法的优化
第12期(总第157期)农产品加工’学刊
2008年l2月AcademicPeriodicalofFarmProductsProeessing
No.12
Dec.
文章编号:1671—9646(2008)12—0004—04
高铁肌红蛋白还原酶活力测定方法的优化
白凤霞,戴瑞彤,孔保华
(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨150030;2.中国农业大学食品科学与营养学院,北京100083)
摘要:高铁肌红蛋白还原酶是和肉色相关的一类酶,它可以阻抗引起肉品褐变的高铁肌红蛋白的生成,从而延长肉
品货架期.对高铁肌红蛋白还原酶活力的测定方法进行优化,结果表明,在测定高铁肌红蛋白还原酶活力的标准反
应物中,酶粗提液的添加量为0.3mL,以牛心为
,高铁肌红蛋白的添加量为0.1mL,以牛背最长肌为材料,高
铁肌红蛋白的添加量为O.05mL,NADH的添加量均为0.2mL;测定酶反应的最适温度为25?,保温时间为25min.
在酶标准反应物中,只有NADH是必须的起始物质,以前报道过的电子传递体K,Fe(CN)并非必须反应物质,但它和
底物高铁肌红蛋白和EDTA都有增强酶活力的作用.
关键词:高铁肌红蛋白;高铁肌红蛋白还原酶活力;酶活力测定方法
中图分类号:Q55文献标志码:A
TheMethodsfortheDeterminationofMetmyoglobinReductaseActivity
BaiFengxia,.DaiRuitong~,KongBaohua
(1.CollegeofFoodScience,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,Heilongjiang150030,China;
2.CollegeofScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China)
Abstract:Themetmyoglobinreductasecanresisttheformationofthemetmyoglobinwhichinducedthebrowningofmeatand
extendtheshelflifeofmeat.Themethodsforthedeterminationofmetmyoglobinreductaseactivitywerestudiedandtheresult
suggested:theoptimumconditionswerethatthecontentofenzymeextract:0.3mL,theamountofmetmyoglobinfrombeef
heart:0.1mL;theamountofmetmyoglobinfromlongissimusmuscleofbeef:0.05mL,theadditionofNADH:0.2mL;
theoptimaltemperatureforthereaction:25oC,theholdingtime:25min.Inthestandardreactants,NADHwasnecessary
fnrthereaction,K4Fe(CN)6aselectron~ansfermediatorisnotnecessary;butK4Fe(CN)6,metmyoglobinandEDTAcould
improvethemetmyoglobinreductaseactivity.
Keywor~sI(MMb);metmyoglobinreductaseactivity(MRA);methodsforth
edeterminationofenzymeactivity
0引言
高铁肌红蛋白还原酶是肌肉中存在的可以还原高
铁肌红蛋白(MMb)的一类酶,它与肉色的关系是
国内外研究的热点.
肉色的褐变是氧合肌红蛋白氧化生成MMb所造
成的,而肌细胞内部的高铁肌红蛋白还原酶可以起到
阻抗MMb积累的作用,从而稳定肉色.国内外已经
对此类酶做了相当多的研究,但是由于测定酶活力方
法的不一致,导致很多研究结果不统一.
Stewart等人(1965年)【l】最早用铁氰化钾作为氧
化剂来测定高铁肌红蛋白还原酶活力(MRA),但此
方法测定结果不稳定.
Watts等人(1966年)[21在此基础上,通过使用
亚硝酸钠氧化肌肉色素,但是在无氧条件下肌肉中存
在的其他的还原系统可以把氧化的肌红蛋白还原.
Ledward(1972年)嘲发现一种创新的方法,不用人
工合成的化学氧化剂,利用低氧分压条件下的氧化肌
红蛋白,创造了有氧还原法,但是此方法可能使肌红
蛋白氧化不完全,而且费时.于是Lee等人
(1981年)提出了测定总的还原活性的方法,但是
这种方法的意义和性质是不清楚的,而且用到三氯乙
酸,显然测定的不是特异性的MRA.文献【5】,[6】,
[7]报道了用次甲基蓝测定MRA的方法,但次甲基蓝
能通过抑制吡啶核苷酸的氧化和还原而影响总的还原
酶活力.文献[8】,【9】报道的对MRA方法进行适当修
正,得出现在通常用的测定酶活力的方法,但此方法
没有很好地表述其适用条件.本文通过对测定MRA
过程的各个条件进行优化,从而为更好地研究高铁肌
红蛋白还原酶与肉色稳定性的关系奠定一定的基础.
收稿日期:2008—09—19
基金项目:国家自然科学基金项目(30771523).
作者简介:白凤霞(1982一),女,河北人,在读硕士,研究方向:畜产品科学.
为通讯作者:戴瑞彤(1966一),女,博士,副教授,研究方向:畜产品科学.E—mail:dairuitong@gmail.o0m.
2008年第l2期白凤霞,等:高铁肌红蛋白还原酶活力测定方法的优化?5?
1材料与方法
1.1材料和设备
1.1.1材料来源
牛心,牛背最长肌,均购自北京御香苑市场.将
屠宰lh内取出的肉样用冰盒保存,带回实验室,去
掉筋膜,立即处理,制备高铁肌红蛋白还原酶粗提
液.牛心制备样称为A样,牛背最长肌样称为B样.
肌红蛋白,NADH,购自Sigma公司;磷酸二氢
钠,磷酸氢二钠,Tris,HCI,EDTA,高铁氰化钾,
亚铁氰化钾等,购自蓝弋试剂公司,均为
纯.
1.1.2主要试验设备
高速组织捣碎机,万分之一电子天平,酸度计,
高速冷冻离心机,超低温冰箱,移液器,恒温水浴
锅,紫外分光光度计.
1.2方法
1.2.1样品处理方法
参考文献【8]介绍的方法,略有改动.每个样品
取l0g加入20mL冰的磷酸盐缓冲液(PB,浓度为
2.0mmoUL,pH值7.0),4?下,经组织捣碎机处理
1min,再用高速组织分散器连续均质处理1min,均
质液在4?下,转速10000r/min下离心20min,上
清液经中速定性滤纸过滤除去脂肪,滤液中氧合肌红
蛋白用稍过量的高铁氰化钾氧化后,再用冰磷酸盐缓
冲液(PB,浓度为2.0mmol/L,pH值7.O),4?下
透析(透析袋截留分子量为14000Da,进口)24h,
期间换液3次,主要是除去过量的高铁氰化钾.透析
完毕后,在4?,转速12000r/min下离心20min,
取上清液作为高铁肌红蛋白还原酶的粗提酶液.
1.2.2酶活力的测定方法嘲
配置标准反应物,反应温度为25?,空白对照
以水代替NADH,其他组分不变.
高铁肌红蛋白还原酶活力测定的反应物组分见
表1.
表1高铁肌红蛋白还原酶活力测定的反应物组分
反应由加入NADH而起始,用紫外分光光度计
在波长580nm下进行扫描,每10s记录吸光值.
MetMb与MbO:的吸光值在580nm时差异最大,两
者的摩尔消光系数为12×101/(mol?cm).通过比较反
应前后(在反应线性阶段)吸光值的变化,便可计算
出MetMb的还原酶活力.1个酶活力单位定义为:
1U=InmolMetMbreduced/min,高铁肌红蛋白还原
酶比活力表示为反应线性阶段每1mg蛋白所具有的
活力单位(U/mg),每个样品的酶活力测定重复
2次,取平均值.由于本文实验的样品都是同一批次
同时测定的样品,酶粗提液中的总蛋白含量是相同
的,为了简化步骤,就直接用反应线性阶段的
吸光值/时间值/t)来表示酶活力的变化情况.
1.2.3实验分组
(1)确定酶标准反应物,进行6组实验.
高铁肌红蛋白还原酶测定过程中添加的标准反应
物见表2.
表2高铁肌红蛋白还原酶测定过程中添加的标准反应物
注:A代表牛心提取液,B代表牛背最长肌提取液.
(2)高铁肌红蛋白还原酶粗提液的提取条件:
缓冲液种类:磷酸盐缓冲液(PB),s一_一Hcl;
缓冲液浓度:1.0,2.0,5.0,10,20mmol/L;
缓冲液pH值:6.0,6.5,7.0,7.5,8.0.
(3)标准反应物中各物质的添加量:
Emzymeextract:0.0,0.1,0.2,0.3,0.4,
0.5mL;
MetMb:0.0,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4mL;
NADH:A样0.0,0.05,0.1,0.15,0.2,0.25mL;
B样0.0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL.
(4)酶反应的最适温度以及保温时间:
反应温度:5,15,25,35,45,55oC;
保温时间:0,5,l0,15,20,25,30min.
1.2.4数据分析
所得数据用SPSS软件(8.0版)进行极差分析.
2结果与分析
2.1不同标准反应物对酶活力的影响
添加不同标准反应物对酶活力的影响见图1.
由图1可见,与第1组添加了全部的反应物相
比,不加底物高铁肌红蛋白的第2组样中,A样酶活
力没有显着性差异(p>0.05),而B样却显着降低
(p<0.05),说明酶粗提液本身就含有底物高铁肌红蛋
白,在不加底物的情况下也可以很好地反应,但是牛
背最长肌样(即B样)可能是由于底物浓度较小,
所以酶活力显着降低.不加EDTA的第3组样和第1组
农产品加工?学刊2008年第l2期
妲
罐
123456
实验组
?一A样;豳一B样
图1添加不同标准反应物对酶活力的影响
相比,A样活力下降比B样多,但差异均不显着
(p>0.05).不加K4Fe(CN)6的第4组样品和第l组相
比,活力稍有下降但差异不显着(p>0.05),说明
K4Fe(CN)在反应过程中起电子传递作用,但它并不
是反应必需的物质.第5组不加酶粗提液和第6组不
加NADH的样品酶活力均为0,说明NADH是反应
的起始物质,是必不可少的,同时说明粗提液中确实
存在高铁肌红蛋白还原酶.
2.2高铁肌红蛋白还原酶粗提液提取条件对酶活力
的影响
2.2.1缓冲液种类以及pH值对酶活力的影响
缓冲液种类以及pH值对酶活力的影响见图2.
6.06.57.07.58.O
pH值
?一PB:踊一Tris—HC1
图2缓冲液种类以及pH值对酶活力的影响
由图2可见,用磷酸盐缓冲液提取的粗提酶液的
酶活力要大于用Tris—HC1提取的酶液,且在pH值
7.0时达到最大值,而用s—HCI提取的酶液在pH
值8.0时的酶活力达到最大值,表明高铁肌红蛋白还
原酶液提取过程用pH值7.0的磷酸盐缓冲液的效果
较好.
2-2.2缓冲液种类以及缓冲液浓度对酶活力的影响
缓冲液种类及其浓度对酶活力的影响见图3.
由图3可见,用磷酸盐缓冲液提取的粗提酶液的
酶活力要大于用Tris—HCI提取的酶液,结果与图2一
致,而且PB浓度为2.0mmol/L时的酶活力达到最
IZ5l02O
浓度C/mmol?L-’
?一PB:圈一Tfis—HCI
图3缓冲液种类及其浓度对酶活力的影响
大,用Tris—HCI提取的酶液在其浓度为
1.0mmol/Lt~的酶活力达到最大值,表明高铁肌红蛋
白还原酶液提取过程用浓度为2.0mmol/L的磷酸盐缓
冲液的效果较好.
2.3标准反应物中各物质的添加量
2.3.1Enzymeextract添加量
Enzymeextract添加量对酶活力的影响见图4.
Enzymeextract添加量/mL
?一A样;-i-一B样
图4Enzymeextract添加量对酶活力的影响
由图4可见,A样和B样均是随着酶提取液添
加量的增多逐渐增大,但是添加量超过0.3mL后酶
活力没有显着性差异,表明酶反应中酶粗提液的添加
量为0.3mL较合适.
2.3.2MetMb添加量
MetMb添加量对酶活力的影响见图5.
MetMb添加量/mL
?一A样;-i-一B样
图5MetMb添加量对酶活力的影响
765432lO???????吣
OOOOOOOO
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妲龌
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蝗龌
2008年第12期白凤霞,等:高铁肌红蛋白还原酶活力测定方法的优
化.7.
由图5可见,随着MetMb添加量的增大,酶活2.4.2保温时间
力先增大后减小,这可能是由于底物浓度太大反而抑
制了酶的活力.A样酶活力在MetMb添加量为
0.1mL,B样酶活力在MetMb添加量为0.05mL时达
到最大值,确定酶反应中MetMb的添加量A样为
0.1mL,B样为0.05mL.
2.3.3NADH添加量的确定
NADH添加量对酶活力的影响见图6.
翅
谣
NADH添加量/mL
0.oo35
O.0o3O
n
0.0020
0.0015
0.0010龌
0.0005
0.0000
NADH添加量,mL
?一A样;一?一一B样
图6NADH添加量对酶活力的影响
由图6可见,随着NADH添加量的增大,酶活
力先升高后下降,这说明NADH是不可缺少的反应
的起始物,但它有最适量,超过这个量酶活力不再上
升反而下降.
由图6可知,A样和B样的酶活力均在NADH
的添加量为0.2mL时达到最大值,于是确定NADH
的添加量为0.2mL.
2.4酶反应的最适温度以及保温时间
2.4.1反应温度
酶反应的最适温度对酶活力的影响见图7.
妲
谧
反应温度?
?一A样;?一B样
图7酶反应的最适温度对酶活力的影响
由图7可见,随着酶反应温度的升高,试样酶活
力在15?时下降,此温度可能是酶的抑制温度,到
55?时出现絮状的蛋白沉淀,酶活力已经完全丧失,
在25?时试样酶活力均达到最大值,确定酶反应的
最适温度是25?.
酶反应的保温时间对酶活力的影响见图8.
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婕
蹴
保温时I司t/min
?一A样;--l-一B样
图8酶反应的保温时间对酶活力的影响
由图8可见,保温时间对酶活力的影响不是很
大,由于酶活力在其测定过程中存在很大的偶然性,
出现如图8所示的结果,即A样酶活力在保温25min
时达到了最大值,而B样酶活力在保温30min时达
到最大值,但是在保温时间为0时差异不显着
>0.05),为了保持实验的一致性,于是确定酶反应
过程中的保温时间为25min.
3结论
(1)A样的酶活力均大于B样的酶活力,说明
从动物不同部位取得样品的酶活力是不同的,牛心的
酶活力要显着高于牛背最长肌的酶活力.在测定高铁
肌红蛋白还原酶活力的标准反应物中,只有NADH是
必须的起始物质,以前报道过的电子传递体
K4Fe(CN)并非是必须的,但它和底物高铁肌红蛋白
及EDTA都有增强酶活的作用.
(2)在提取高铁肌红蛋白还原酶的过程中,用浓
度为2mmo1]L的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液;在测
定酶活力的最终反应物中,酶粗提液的添加量为
0-3mL,高铁肌红蛋白的添加量为:牛心0.1mL,牛
背最长肌为0.05mL,NADH的添加量均为0.2mL;
测定酶反应的最适温度为25?,保温时间为25min.
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(下转第10页)
农产品加工?学刊2008年第l2期
从表2看出,小米中必需氨基酸(除色氨酸外)
占蛋白质的42.03%,多数必需氨基酸的AAS值均大
于100,能满足人体的需求,所缺乏的仅是赖氨酸和
苏氨酸.与优质鸡蛋蛋白质比较,除色氨酸外的必需
氨基酸指数EAAI为76.22,高于其他粮食
(65.0973.62).色氨酸虽未测定,但文献【7】报道它
在小米中的含量为O.198%.由此可见,小米是一种
优质蛋白质来源食品.
2-3小米中第一限制氨基酸与氮含量之间的关系
为了与文献的研究结果相比较,将小米的蛋白质
除以系数6.25,换算成氮的百分含量.以氮的百分含
量为横坐标,以蛋白质中赖氨酸含量的百分含量为纵
坐标,小米蛋白质中赖氨酸和氮含量的关系曲线见
图1.
,
叫唧
如
蹶
S
导
蜓
皿
嘲
氮含量/%
图1小米蛋白质中赖氨酸和氮含量的关系曲线
由图1看出,蛋白质中赖氨酸与氮含量之间呈负
线性关系,其回归方程为:
y:一0.8323X+3.7112.R=一0.6502.
若已知小米中氮含量,可用此式粗略估算出蛋白
质的赖氨酸含量,了解赖氨酸缺乏的程度.通过强化
赖氨酸钠盐或与赖氨酸含量高的豆类等食物搭配使
用,可提高小米的生物利用率.
3结论
(1)小米蛋白质的干基平均值为12.91%,变幅
为11.02%,15.97%,分布标准差为1.08,相对标准偏
差为8.36%.
‘(2)氨基酸含量分析表明,小米蛋白质中谷氨酸
平均含量最高为3.10%,占小米蛋白质组成中含量的
23.98%,占亮氨酸,丙氨酸和天门冬氨酸等4种氨
基酸之和蛋白质平均值的51.82%,这些比例较大的
氨基酸不属于人体的必需氨基酸.人体的必需氨基酸
(除色氨酸外)占蛋白质的42.03%,必需氨基酸指数
EAAI为76.22,高于其他粮食;多数必需氨基酸的
AAS值均大于100,能满足人体的需求.
(3)已知小米中的氮含量,通过蛋白质中赖氨酸
与氮含量回归方程,可以估算出其蛋白质赖氨酸的含
量,采取强化或与食物搭配使用措施,可提高小米的
生物利用率.
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