[doc] 附睾肉毒碱

[doc]附睾肉毒碱附睾肉毒碱f弓一苎例融皿附睾肉毒同济医科大学计划生育研究所碱占.萼蓑摘要肉毒碱是衡量附睾功能的重要指标.内毒碱的谢定方法有多种,现以酶法最为常用,并且以Ra/:rlsay法更可靠.附睾不合成内毒碱,但它勰从血液中摄取肉毒碱,而后经附睾上皮细胞浓缩并将其转运至附睾液中.精子利用附睾液中的肉毒碱参与精子细胞内长链脂肪酸的B氧化.附睾肉毒碱与精子成熟密切相关.附睾肉毒碱受体内雄激素的词节,尚受干扰附睾功能的诸多因常的影响.因此,检测分析附睾肉毒碱的水平对附睾功能的实验研究H及临床诊断均具有重要的意义.肉毒碱(Camitine)广泛存在于大自然中,是一种Y一氨基日一羟基丁酸的三甲基衍生物.近十多年来,人们发现:哺乳类动物附睾组织中具有非常丰富的肉毒碱,并且其单位体积的含量明显高于其它器官组织….目前,肉毒碱已成为衡量附睾功能的重要指标,在男性生育与节育的研究中发挥着重要作用.现就附睾肉毒碱的研究进展作一综述.一,附毫肉毒碱测定的方法肉毒碱的测定方法有多种,按检测目的不同,可作具体选择.附睾肉毒碱多进行定量分析,可从精液,附睾液或附睾组织匀浆中测得,所用的测定方法均以酶分析法最为常用.此法灵敏度高,特异性强.现常用的有两种1.埃尔曼试剂法(简称DTNB法)…?山东滨_州医学院计螂生育研究字在职研究生(上接203页)ehniGL.Long—actingContraceptiver)elivervySystems,Philadelphia:HarpenandRow?1e4:89SjdmanKReta1.JM唧hfScl,1981;7:277-2891OIndJanComteilofMedicaiResearcheta1.Contraception.1991id{4):d09-41711HellerJeta1.ContrareptDdivSyst,1983I{:43—5312PakerR.Controlle~Relearseof13iolog~eatlYActiveAgents.MenloPark;California:Me-mbranTechnogyandRes,~rach.In.1984:89国外医学计划生育丹册1992年第11眷第4飙19pittCGeta.JApoiPo[ymSci.1981I26:3779—378714HttCGeta1.Biomateria[.1981I2:215—22015WoodwardSCeta1.JDiomedMaterRes.198,5,1目:S7一{“18PittCGeta】.JBiomedMaterRes.1盯9I13:97-50717PittCGeta1.USPatent1179;4:148.871.18OrysJeta1.AmJObstttGyneco!.1e83I145[3):609—60519Hal1PE.WH0AanualReport.1988,10720DamevPDeta1.AmJObstetGyneco[.1Ci8g1160:1292—1295(修回日期:1992年7月)27埃尔曼试剂的化学名称为5,5”-二硫双(2一硝基苯甲酸)(DTNB).它与硫氢基辅酶A作用后能产生黄色的终产物:5一硫2一硝基苯甲酸.后者可用分光光度计测试,其(I)肉毒碱乙酰辅酶ACarnifineAc,CoA吸收光谱为412nM.下面是DTNB法的基本原理.将待测的标本离心(3000转/is分)处理,然后取其上清液进行下列反应;内毒碱乙酰转移冀(CAT)乙酰内毒碱+硫氢基辅酶AAcetytcarnitineCoASH,CO0一.…i二二一s一?/CO?O-+Sk--CoA》..一!一Q—N0一?”—,C002.Ramsay法此法首先由Ramsay提出.其基本原理为肉毒碱与乙酰辅酶A,在肉毒碱乙酰转移酶(CAT)作用下,生成还原的辅酶A.还原性辅酶A与4,4一二硫代双毗啶(4,4”-DTDP)作用产生最终产物4一吡啶二硫化物(4-DPS).用紫外分光光度计(波长为324nM)测试4-DPS.所得值按4一DPS的消光系数(19.8×10.mo]/em)求出肉毒碱的浓度(nmo]/m1).经改良的Ramsay法,选用2O分钟作为反应时间,加快了测定速度,其测定范围为2~10nmol/ml,回收率很高,变异系数为2.3%.Hinton在评价这两种酶分析法后,认为Ramsay法比较好,因为DTNB法的DTNB对CAT有抑制作用,在某种程度上影响了它的准确性.二,附毫肉毒碱的来源及代谢人体肉毒碱有两方面的来源_5]:一是饮食,L一肉毒碱以瘦肉和乳制品中含量最高,而蔬菜,谷类和水果中几乎不含肉毒碱二是体内生物合成.肉毒碱的四碳链来自赖氨酸,甲基来自蛋氨酸.由于肉毒碱的生物合成需要五种酶,而这些酶又需要维生紊c,Z,6烟酸(Vpp),维生素B.和铁作为辅助因子.故当这四种微量营养素缺乏时,肉毒碱的生物合成也将受损.其台成部位主要是肝,脑和肾,而肌肉中约有98的肉毒碱必须从血液中摄取I.肉毒碱分布于体内多种组织,特是肌肉组织.原以为它在心肌中含量最高.现已查明哺乳类动物附睾中的肉毒碱浓度比其它组织都高,例如大鼠附睾尾液中高达50nmol/m1,约比血液中高1000倍[】】.众多的研究表明,来自血液的放射性肉毒碱在附睾处积聚活跃,以此判定附睾本身不合成肉毒碱.附睾尾液高浓度的肉毒碱是附睾头部上皮细胞从血液中摄取,然后将其浓缩而成的.肉毒碱参与脂肪酸氧化过程,它可转运长链脂肪酰一辅酶A进入线粒体内膜进行氧化.因此,肉毒碱首先必须作为细胞的物而进入细胞内才能发挥作用.很多种不同细胞(肌肉,附睾上皮和精子等)的膜上含有肉毒碱的特殊转运载体.这种载体以主动转运方式将肉毒碱逆浓度差运送至细胞内,致使细胞内,外肉毒碱的浓度相差10,100倍同时,不同细胞摄取与释放肉毒碱的速率上的差异也与细胞膜载体有关f..该胃外医学计盘4生育丹册195’2年第11卷第4期载体含有肉毒碱乙酰转移酶系统,催化肉毒碱与乙酰肉毒碱的相互转化】.确切的转运机制尚待进一步阐明.精子内含有高浓度的内毒碱_1.附睾肉毒碱的代谢主要表现在精子细胞内内毒碱的代谢.未成熟精子从附睾液中摄取内毒碱】.在肉毒碱乙酰转移酶的催化下,被摄取来的肉毒碱乙酰化.肉毒碱一内毒碱乙酰转移酶系统对精子细胞内乙酰辅酶A浓度的骤变起缓冲作用.故有人认为肉毒碱的乙酰化对精子的脂肪代谢,特别是精子的成熟尤为重要…】.乙酰化的肉毒碱又可在细胞内乙酰内毒碱转移酶的催化下转化成肉毒碱.附睾内大量的肉毒碱可以原形随精液排出.三,肉毒碱与附睾功篷附睾肉毒碱的含量很高,这与附睾自身的重吸收及浓缩功能有关.值得重视的是,肉毒碱是精子成熟所必需的物质条件.因此,肉毒碱的水平不仅直接反映出附睾的功能状态,而且还反映着精子的成熟程度.1.肉毒碱与精于成熟密切相关精子在附睾内成熟大致有下列四方面的改变;?抛弃胞浆的多余成分,核蛋白结合更加紧密,精子的前向运动增多.?精子细胞内的脂类氧化作为重要柏内原性能量来源.?SH基逐步氧化成二硫键,使精子结构更加稳定.?精子膜表面负电荷增多,含唾液酸的糖蛋白附着于精子表面,使其处于”去能状态”.所有这些变化均离不开脂类氧化并以此作为能量来源.脂类氧化为附睾内精于成熟和存活奠定了基础,而肉毒碱又是精子细胞脂肪酿和辅酶A代谢的一个重要辅助园子.因此.肉毒碱对精子的成熟具有非常重要的促进作用.有人发现,精子在附睾中获得运动能力的部位正是肉毒碱浓度明显增高的部位.实验也表明,内毒碱对提高附睾头部不成熟精子的潜在活力以及使成熟精子保持制动状态是必不可少的.巨外医学计赳生育分珊1902年第l1眷筚4期2.肉毒碱与附睾分泌和吸收功能相关附睾上皮具有分泌功能,所分泌的物质系精子成熟所必需,包括:甘油磷酸胆碱【,含唾液酸的糖蛋白】,内毒碱,a一糖苷酶.和某些阴离子】.肉毒碱的分泌不同于其它物质,因为它不能在附睾上皮细胞内合成.此外,肉毒碱分泌的主要部位是附睾头部.现已明了,大部分睾网液在睾丸输出管及附睾头部被重吸收.其中钠水的重吸收对维持附睾液渗透压尤为重要,同时也直接关系到内毒碱的浓缩.当某些干扰因素影响附睾功能时,不可避免地影响着内毒碱的摄取,浓缩与分泌,致使附睾液肉毒碱浓度下降.其病理机制可能在于附睾上皮细胞膜内毒碱载体受损的缘故.总之,通过检测附睾液肉毒碱的水平,将确切地了解到附睾此时的功能状态.3.附睾肉毒碱含量受雄激索水平调节作用于附睾的雄激素有三个方面的来源:一部分来自睾网液,一部分来自血循环,尚宥少量由附睾上皮本身合成.附睾内有特异性5a,双氢睾酮受体.体内雄激索与该受体结合并调节劂睾的?切功能活动,附睾肉毒碱的分泌也不例外.这一点在阉割和跑睾动物用睾酮替代的实验中得到了证实F】.更多的实验表明,附睾摄取内毒碱是雄激素依赖过程,雄激素产生减少也会影响肉毒碱的摄取l】.然而体内雄激素对内毒碱分泌的调节主要通过睾网液雄激素的局部作用,还是通过血循环雄激素的全身作用来实现的尚待实验证实.四,千扰附睾功能的因素对内毒碱水平的影响若干因素对附睾功能具有咀显的影响(如输精管阻塞,输精管结扎,避孕药物和附睾炎症等),表现在附睾液肉毒碱含量的下降.I.输精管阻塞和输精管结扎=77~Lewin等[对50例精子正常者和无精子,少精子患者的精液标本之肉毒碱含量进行了测定.结果表明:?输精管及驸睾皆正常者,精液肉毒碱含量在250~g/m!以上.?输精管及附睾有一种异常者,其含量为10O,2O0g/m1.?输精管及附睾均异常者,其含量则低于100~g/ml.有人观察,输精管结扎侧的附睾液内毒碱显着低于朱结扎侧.说明输精管的阻断能降低附睾功能.2.避孕药物棉酚是常用的而且研究擐多的男用避孕药物.Giridharan等[:以棉酚(30mg/kg/天){鳖胃52天使Wistar雄鼠完全不育,测得附睾尾液之肉毒碱含量降低并有显着意义.他认为,棉酚起先是干扰附睾功能而抗生育的,而且棉酚可能影响了肉毒碱的摄取.Radigue等[则发现给SD雄鼠棉酚(35mg/kg/天)34天能使附睾液肉毒碱减少并引起精子活力及形态学改变.给药17天时,尽管附睾肉毒碱含量正律,但附睾头部有63%的精子内线粒体有空泡形成和溶解现象.他认为,34天”的实验结果不能简单地解释为由附睾液分泌的改变和附睾头糖子或精原细胞早期直接受损所致.因此,棉酚作用的靶器官主要在附睾还是睾丸尚不能定论,但棉酚无疑能降低附睾肉毒碱水平.3.男性生殖道感染Cooper等118分析了362倒男性生殖道不同部位感染对精液肉毒碱含量的影响.他发现,患附睾炎者精液中肉毒碱明显减少,而前列腺炎,尿道炎患者之肉毒碱水平未受影响.说明肉毒碱可作为附睾功能的一个可靠临床参数.五,结束语1.肉毒碱在尉睾内的转运受雄激素调节,救在测得精浆肉毒碱水平下降时,还应结台体内雄激素水平综台分析附睾功能受损的原因.附睾功能受损有时是干扰因素直接2T8作用所致,有时是因睾丸受损继发产生.2.L一内毒碱经静脉注射可在附睾积聚并促进精子成熟,而且体外实验也证实肉毒碱对附睾头部未成熟精子有促进作用j.另外,目前已有使用低剂量L一肉毒碱作为临床药物辅助治疗肉毒碱缺乏性疾病(如心肌病,肌无力等)的报道[..因此,对劣精于症患者使用肉毒碱促进精子成熟亦是值得考虑的治疗方法.总之,肉毒碱作为附睾功能的重要指标的发现及其在实验研究与临床诊断方面的应用,定会在男性生育,节育及不育的研究中作出重大的贡献.参考立越1BieherLL.AnnRevBiochem,1988I57:261—8898Casa,~Retai.Fertiieril,1987I47(2:324—3283RamsayRRefa1.HiockemJ,1987I244:271—2784Hitito[tBTetaI.JReprodFertiI,1979F56:108—11I5FeUerAGeta1.JNetr,1988|118:541-5476SilipraadjNeta1.ainChimAeta,188g,189:9-127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