台灣藻類生物技術與產業發展之契機 - 國立中山大學．海下

台灣藻類生物技術與產業發展之契機 - 國立中山大學．海下 台灣藻類生物技術與產業發展之契機 (海藻之新開發技術與應用) 李澤民 國立中山大學 海洋生物研究所 教授兼海洋科學院副院長 周德珍 私立輔英科技大學 生物科技系 副教授 方孟德 工研院 研究員 藻類概述 藻類 (algae) 係泛指一群不具根、莖、葉、花、果實等器官分化,具葉綠素而可行光合作用之植務,因高等植物 (higher plant) 具器官分化,藻類又稱為低等植物,以為區分。 藻類體制因肉眼可見否,可分為細微藻類 (microalgae) 及大型藻類 (macroalgae),因棲地之差異又可概分為淡水藻類 (freshwater algae) 及海水藻類 (marine algae)。事實上,藻類可在高山雪地、高溫 (如溫泉)、土壤、沙漠、極地等惡劣環境被發現。 藻類涵蓋了原核生物界、原生生物界和植物界3個界。原核生物界中的藻類有藍綠藻和一些原核綠藻。屬於原生生物界中的藻類有裸藻門、甲藻門(或稱渦鞭毛藻)、隱藻門、金黃藻門(包括矽藻等浮游藻)、紅藻門、綠藻門和褐藻門。而生殖構造複雜的輪藻門則屬於植物界。屬於大型藻者一般僅有紅藻門、綠藻門和褐藻門等為大型肉眼可顯而易見之固著 1 性藻類。此類大型藻幾乎99%以上之種類棲息於海水環境中,故大型藻多以海藻稱之。另外有些肉眼可見的固著性藍綠藻和少數之矽藻嚴格而言,應該亦屬於大型藻的範圍。雖然藻的分類仍有爭議,但約可將藻類分成十個門:藍綠藻門 (Cyanophyta) -部分為大型海藻(共8種),淡水產為多。原綠藻門 (Prochlorophyta) 及綠藻門 (Chlorophyta)–浮游藻與大型海藻均有,約一半為海水產,是藻類中種類最為繁多的一個門。輪藻門 (Charophyta) –75%為淡水產。裸藻門 (Euglenophyta) –即眼蟲不具細胞壁,有葉綠素a,多為海水產(60%)。金黃藻門 (Chrysophyta) –含矽藻 (diatoms)。甲藻門(Pyrrhophyta)–渦鞭毛藻 (dinoflagellates) (含夜光蟲),某些為赤潮種類,93%為海水產。隱藻門 (Cryptophyta)–某些為赤潮(甚至褐潮)種類。褐藻門 (Phaeophyta) -99%為海水產之海藻。紅藻門 (Rhodophyta)–98%為海水產之海藻。存在台灣之大型藻約有490種 (藍綠藻8種,綠藻120種,褐藻100種,紅藻270種),同時也是台灣對藻類開發的優勢,多樣性藻類有利於對藻類的篩選,並加以培植。 地球因藻類出現,進行光合作用,吸收二氧化碳,製造有機物,同時利用水而釋放出氧氣,經35億年而有今日之大量氧氣含量存在大氣層,繼而出現利用氧之生物大量衍生,成為當下地球之優勢生物。歷經數億年之環境變遷,藻類之型態及生化代謝,極度變異,種類眾多,是具極高生物多樣性之物種。 藻類之於生態,因其為生產者 (producer),負責吸收太陽能,提供生態等基礎能量與有機物,重要性不可言喻。藻類為人類所利用,起源於遠古,在歷史記載者,如中國食用之海帶 (Laminaria spp.) 及其它大型海藻,可追朔於商周,利用至今,已成為世界重要之經濟利用的藻種,提供人類豐富營養,亦見用於疾病治療,如缺碘造成之甲狀腺疾病,可用富含碘之海帶進行食療。西方世界對於藻類應用,亦廣見各地,如馬尾藻 (Sargassum spp.)、墨角藻 (Fucus spp.) 等用於陸生植物栽種之土壤改良或牲畜之飼料添加,碘之提煉於大型褐藻並施於甲狀腺疾病疾病治療是西方單方藥物應用之典型例子。 近年來,日本紫菜食品 (Porphyra) 為世界各地喜好,已成為重要經濟藻類,貿易量極大。人類食衣住行之所需為多醣體 (polysaccharide),多半來自大型海藻之洋菜藻 (agarophyte)及褐藻(phaeophyfe),洋菜膠 (agar)、卡拉膠 (carrageenan) 及褐藻酸 (alginate) 等無法人工合成之多醣類,廣泛使用於醫藥、寵物飼料、建築用料及工業潤滑劑之添加物。 2 中國醫學開發過程,藻類亦為藥材之一,如石花菜等,是食療藥材之一,鷓鴣菜對於蛔蟲之防治亦為明顯例子。 綜合上述,藻類已成為人類日常生活及工業應用不可或缺之材料,重要程度,不可忽視。藻類緣於眾多營養製造及氧氣產生的角色,列為未來的太空食物。近年,因為生物技術及化學分析之長足進展,又由藻類分離純化各項有用物質及作為生產有用物質之精進發展,藻類成為未來生物應用及研究材料,更是令人驚嘆, 生物技術 (biotechnology) 是一項以生物為主體所進行物質生長及發育改造的方法。早期之發酵 (fermentation),即為人類進行之生物技術。近年,因分子生物學 (molecular biology) 之進步,隨之而起的DNA修飾,遺傳變異等工作日益盛行,加上蛋白質體 (proteomics) 及代謝體 (metabolomics) 之濫觴,生物技術應用漸成熟,其在於藻類之使用發展更加受重視。 藻類之栽培改進更新,本為生物技術之一。微細藻類,如小球藻 (Chlorella spp.),目前是全球保健食品的重要產品。台灣的小球藻產量佔全球率第一,多出口到日本及香港等東方人社會,近年亦為西方人重視而市場逐步擴張,總產值達24億美元,年產量為1200噸,世界佔有率約為48%。早年,經台大農化系教授蘇遠志博士由日本引進Chlorella ellipoidea及C. pyrenoidosa, 研發戶外池之培養方式,開起臺灣小球藻養殖之產業化。 藻類生物技術及其在產業的應用 藻類生物技術的產業應用,包羅萬象,本文就若干重要方向,介紹讀者與聞。 一、保健食品與藥用: 目前,已知地球約有32,000種微細藻類,但僅有少數為人類所利用,較具產業規範者,如小球藻及螺旋藻 (Spiruliua),其他如杜氏藻 (Dunaliella)、紅球藻 (Haematococcus) 及紫球藻 (Porphyridium) 等亦有量產,但規範及經濟效益尚不如小球藻及螺旋藻。 微細藻類開發為保健食品及藥用,必頇考慮1、有效成分及含量,其醫藥效果之實驗證明,2、其它可能有害之成分,3、穩定供應及栽培環境之選擇,4、細胞生長及生物量, 3 及5、專利之申請。 a、小球藻 (Chlorella) 小球藻為一種單細胞的藻類植物,細胞大小約為2-10μm,頇600倍以上的顯微鏡方可看見。具高蛋白質,含有氨基酸,蛋白質,維生素及礦物質,與螺旋藻 (屬於藍綠藻,cyanophyta) 為當今最廣泛使用之保健食品應用的微細藻類,為歐、美、日等國常使用之營養補充品。在商業上,綠藻科 (Chlorophyceae) 中的小球綠株 (Chlorella sp.) 最常被採用且適用於淡水、混營培養 (mixotrophy),其中又以普通小球藻 (C. vulgaris) 最常用,次為橢圓形小綠藻 (C. ellipsoidea) 及台灣原生品種的澱粉核綠藻 (C. pyrenoidosa)。 小球藻的分類地位為 綠藻植物門Cholrophyta - 綠藻綱Cholrophyceae - 綠藻目Cholrococcales - 氈藻科Oocystaceae - 綠藻屬Chlorella。 C. sorokiniana 為近年常見之品系,如市售之引藻片。 小球藻萃取物具有降血清膽固醇、抗氧化、促進脂肪代謝、預防動脈硬化之效果、減緩胃腸發炎症狀、促進免疫活性、預防細菌感染與腫瘤細胞發生的功能。 小球藻細胞具有一種被稱為綠藻生長因子 (Chlorella growth factor;CGF) 的物質,是從水萃取液中所分離出的一種物質,可使小球藻在12-20小時由一個細胞分裂為4個細胞的動力,同時有促進兒童及動物帅生物之生長的能力,又稱綠藻精。目前之資料顯示每100公克輕重的小球藻約含有4-5公克的綠藻精,即約佔5%。 b、螺旋藻 (Spirulina) 螺旋藻為一種原核藻類,屬於藍綠藻之一。原生地為鹼性鹽湖。在1921年,非洲查德湖畔發現,是當地土著的食物。墨西哥的阿茲提人也以螺旋藻為蛋白質食物。1963年,才開始人工養殖之研發。 螺旋藻含有蛋白質(佔乾重60%)、維生素B12和β-胡蘿蔔素含量高、富含人類生長發育所需的礦物質、必需胺基酸和脂肪酸,特別是γ-次亞麻油酸 (GLA),為西方國家之營養添加物質。近年,證據顯示螺旋藻具有醫藥功能,可以降低血以膽固醇含量;預防癌症及延緩病情、營造腸胃中健康的乳酸桿菌群、減輕汞及藥物對於腎的毒性、γ-次亞麻油酸可刺激前列腺素作用、藻藍蛋白(C - phycocyanin) 可提高免疫系統、具輻射保護功能、可以提高鐵的吸收。目前已知,螺旋藻萃取物能抑制HIV-1病毒影響人體T-細胞及週邊血管單 4 核細胞複製。螺旋藻除了人類自身使用外,近年也應用於動物飼料的添加物,對於增進魚、牛、豬的成長率與飼料轉換率有顯著效果。 c、栽培技術 常見之栽培方式有: 1、開放的室外池塘式的養殖,2、密封的室外光反應器養殖 (如管狀光反應器及螺旋管光反應器),3、密封的室內光反應器養殖,及4、密封的室內發酵槽養殖 (以acetate或其它有機碳為生長的碳源,而非以二氧化碳或碳酸根的無機碳為生長的碳源)。各有其優缺點,頇視當地環境及選擇之材料為考慮。 引用自Chisti (2007) Biotechnology Advances 25: 294-306 5 引用自Chisti (2007) Biotechnology Advances 25: 294-306 利用室外池塘式的養殖有最主要的優點兩個:成本較低及使用太陽能。螺旋藻,目前大部分以室外養殖方法居多,主因是台灣南部日照充足,溫到高且較穩定,適合螺旋藻養殖產業發展,如南寶國際生物科技股份公司。 二、轉殖基因藻類或藻類生物反應器 藻類對於周遭環境之反應敏銳,內部生化代謝之調整常快於或異於高等陸生植物,例如藻類對於水體中極低濃度營養塩具極高的利用性,會以吸付能力高的運轉子 (high-affinity transporter) 吸收極低量之元素,以幫助並持續細胞活性及其生長發育之進行,進而有利於其在惡劣環境下的存活能力,及與其它生物之競爭能力。所以,藻類具有許多可以應付外界環境變化之基因,可以提供作物改良耐逆境之能力或增進其生產力。例如,1999年,美國科學家即曾將耐熱之小球藻:Chlorella sorokiniana:之氨代謝酵素GDH:glutamine dehydrogenase:的基因成功地轉殖:transformation:到小麥 (wheat),並且可以提高小麥對於氨氮之肥料利用效率,不但植株生長更快,同時具有更多之穀粒產量。因 6 此轉殖小球藻GDH之小麥,除了節省氨氮之施用,並減少氮肥污染環境及土壤酸化之衝擊,各項成本耗費可以降低。這是眾多轉殖藻類基困於高等陸生植物,促進其生產效率,提昇耐逆境能力之成功例子。另一個例子是將藻類合成海藻醣:mannitol:酵素之基因轉殖到陸生植物以提高作物對滲透壓逆境:如缺水及高塩:之抵抗能力,亦已成功獲得耐缺水逆境之作物。 藻類的生長速度快於陸生植物,微細藻類生長之生物量為一般陸生植物生物量之數十倍之上,大型海藻更可達陸生植物之數十到數百倍之高,且生長期間極短,由數天到數週,即有可觀之生物量,所以科學家對於以微細藻類或大型藻類做為生產人類無法製造之天然物的生物反應器:bioreactor:極感興趣。 事實上,大型海藻之紅藻種類,有一類是可以堆積大量多醣體於細胞壁,此稱為洋菜藻 (agarophyte)。這些洋菜藻所產生的多醣體,是人類日常生活所需,且為重要之工業原料,因為無法由人工合成,所以目前僅可由洋菜藻取得。人類為獲取此類原物料,由種類的選育、栽培環境選擇及改良等,即為廣義生物技術之應用,成功地生產洋菜藻。 人類所需洋菜藻產生的多醣體大約分為兩大類,洋菜膠:agar-agar:及卡拉膠:carrageenan:。由大型紅藻之洋菜藻獲的洋菜膠及卡拉膠,供應全球,,,以上之多醣體原料,陸生植物所產之多醣體原料約為50%。所以,可見洋菜藻產生的多醣體對於當今人類之重要。 台灣臨近之菲律賓因地處熱熱且具極長之海岸線,岸邊淺緩,適宜生產卡拉膠之麒麟菜:Euchema:生長,是全世界最大之卡拉膠原料生產國,佔全球供應量之,,,以上。菲律賓在傳統之遺傳育種及選拔方面,投入極大之人力及物力,常用於卡拉膠生產之種類有Euchuma denticulatum:產品各為spinosum:用於Itdo卡拉膠 : -carrageenan: 生產,用於kappa卡拉膠:K-carrageenan:種類為Euchema cottonii 或Kappaphycus alvarezii:生產之產品各為cottonii:,此種kappa卡拉膠應用範圍較Ieta-卡拉膠為廣,是菲律賓卡拉膠主要生產種類。其餘生產卡拉膠的國家集中於南亞,如印尼及馬來西亞等。 石花菜 (Gelidium) 與龍鬚菜 (Gracilaria) 之多醣體為agar-agar,石花菜agar-agar 可提練價高之agarose,供科學及醫藥用途。agar-agar 經特殊酵素分解及修飾,可以產生具 7 抗癌及抗病毒之成份。 台灣東北角之石花菜為當地主要經濟大型海藻,均為野生,經由採摘,水洗及日曬脫色後,成為石花菜條或再以熱水抽取洋菜膠製成為洋菜凍條販售,或再製成石花菜凍,為夏季美妙品冰,盛行當地。日本人或臺灣其它地區常到當地採購,加工或抽取agarose。當地居民採摘之石花菜包括日本石花菜 :Gelidium japonicum (Harvey) Okamura:、安曼斯石花菜 :Gelidium amansii (J.V. Lamouroux) J.V. Lamouroux:及細翼枝菜:Pterocladiella capillacea: (圖1),產期為3月-10月,由1996-2003年產量之季節變化可看出每年3、4月開始採摘,至5、6月達最高產量後逐漸下降至9月或10月,總產量在1996-1999年有逐漸上升的趨勢,至1999年達33公噸,隨後2000-2002年雖產量稍降,但產值持平,至2003年達過去七年之高峰,產量達165公噸,產值達四千八百二十二萬:資料來源:行政院農委會漁業署85-92年漁業年報: (圖2)。 日本石花菜 安曼司石花菜 細翼枝菜 圖1、石花菜。 180 160A. Production 140 120 8 100 80 60 40Production (ton/year) 20 050000B. Value45000 40000/year)335000 30000 25000 20000 15000 Value ($NTx1010000 5000 0 19961997199819992000200120022003 Year 圖2、1996-2003年石花菜產量及產值之變化。 本研究室為增進石花菜之經濟價值,採取當地常見之俗名為小花的細翼枝菜:Pterodadiella capillacoa:,俗名為鳳尾的安曼司石花葉:Gelidium amansii:及俗名為大花的日本石花葉:Gelidium japonium:,之新鮮藻體 (原色) 與日曬後之藻體:白色:,進行水萃取及酒精萃取後,發現具有高抗氧化力及抗神經腫瘤細胞生長之能力,:見圖:。 龍鬚菜 (Gracilaria spp.) 屬紅藻類龍鬚菜目龍鬚菜科,是台灣目前最具規模之主要養殖經濟海藻。一般靠孢子行無性生殖和配子行有性生殖,交互循環的行世代交替繁殖。而因藻體各部分都能吸收養分,故養殖時主要是採取已成植物體型的果孢子體。養殖方式以台灣西南沿海之魚塭為主,多與虱目魚混養,養殖以菊花龍鬚菜(G. coforvoides)及大莖龍鬚菜(G. gigas)為主。雲林縣口湖鄉的下湖口漁業生產養殖區,因為海水污染尚不嚴重,專門培育龍鬚菜的生產,養殖區占地達300公頃,加上附近養殖區占地共達1,800公頃,每週約有150到200公噸以上的產量,產地面積廣闊,產量大。 龍鬚菜利用有1、食用:由於海藻普遍含有多種人體必須的氨基酸、蛋白質、醣類、類胡蘿蔔素、維生素:B1、B2、B12、C:及礦物質:如碘、鉀、鎂、鐵、硒等:,而脂肪質 9 含量卻極低:0.2~2,左右:,是平衡營養的健康食品。2、工業用:洋菜 :Agar:,微生物培養基、食品工業:果凍、果醬、澱粉代用品、食品罐頭之穩定劑、凝膠劑:、紡織工業、造紙、釀酒之澄清劑、超微切片輔助劑、分析研究:電泳:、醫藥:胃腸不適、膠囊製作等:。3、藥用:治甲狀腺腫、水腫、泌尿器病、防潰瘍、藥丸糖衣、提煉洋菜。4、飼料:九孔養殖的重要餌料。 本研究室與臺大客座專家招衡教授共同以蚊幼生之篩選具殺蟲的藻類,雲林縣口湖鄉龍鬚菜具有顯著效果,若能持續研發,對於臺灣唯一可以人工養殖的龍鬚菜養殖產業將有助益,期許政府能加以重視,花開第二春。 龍鬚菜 轉殖大型海藻成為生產人類所需之醫療物質為目前歐美及中國大陸致力發展之技術,主要著眼於大型海藻生長速度極快,生物量大。唯在開放海域或半開放海洋養殖設施培育轉殖海藻,對於環境及生態可能有所衝擊,且頇考慮防範措施之成本與管控之效率。若能在合理且安全之環境,經由環境風險安全評估無虞下,轉殖大型海藻為生物反應器是一種高效率的人工反應器之一。 轉殖大型海藻之技術瓶頸,目前的資料顯示應有下列:,、頇熟悉能在人工環境完成?轉殖之海藻的生活史,以利於獲得單套轉殖或同型轉殖體:homologus transformant:等遠傳工作進行,順利獲取顯性之現型植株,,、必頇建立高效率之轉殖系統及篩選指標,以辨識轉殖成功之植株,,、必頇建立若干生活史階段之無菌狀態,,、必頇確保轉殖大型海藻在密封或不可外流之栽培環境正常生長培育,,、必頇保持這些遺傳品系,持續加強培養條件之探討,及其它性狀是否發生改變。 10 中國大陸位於青島之中國海洋科學研究所,秦松教授領導的研發團隊在,,,,年發表期刊論文,說明他們已成功利用粒力槍:bombardment:方式將帶有生產抗,型肝炎病毒抗體的基因成功放置於海帶配子體世代之配子:gamete:的基因體組,並經由雌雄配子交配為合子,試圖達成顯性表現之轉殖株,同時也利用雌配子轉殖後,所誘發之孤雌生殖:parthenogenesis:發育為植株,再將環境調整,使其進入配子世代,產生配子,再互相接合,將其單套遺傳物倍數化為雙套遺傳物質,以形成同位置之同形配子的雙套植株。經由上述兩種途經,秦教授成功地在被稱為亞洲海中森林 (Asia Kelp) 的海帶表現出抗,型肝炎病毒抗體,其表現量以可溶性蛋白質含量為分母之計算基礎,可達,.,,,,是轉殖菸草生產方式之,.,,,的,倍。所以,在生產效益及海帶生物量高之雙重考慮下,海帶為生物反應器是較陸生作物為佳。目前,此項技術已申請歐美專利。紫菜:Porphoyra:之轉殖也成功地由美國科學家宣稱,唯尚未完全公諸於世。 引用自秦松教授之文章 (Trends in Plant Science) 微細藻類基因轉殖系統在小球藻,衣藻:Chlamydomonas spp.:,矽藻:diatom:等已相當成功,常用之方法有電穿孔法 :electroporation:、農桿菌感染法 11 :Agrobacterium-mediated DNA transformation:、玻璃株穿孔法:glass bead-mediated poration:、原生質體:protoplast:、粒子鎗:bombardment:、及EGTA/Ca基因轉殖法等。目前,利用上述方法,科學家已成功地將外來有用物質生產相關基因置入遺傳基因組,達成代代相傳之穩定轉殖株。台灣私立輔英科技大學生物技術系周德珍教授已成功將抗腸病毒抗體之表現基因轉殖於台灣嘉義水稻田獲得之小球藻T-89品系,生產抗體已達產業化階段。這個研發成果,代表台灣已有能力進行微細藻類之轉殖。寄望未來繼續此項技術之連串研發土作,朝建立專一性轉殖載體及誘導型戴體的技術發展,幫助台灣建立微細藻類轉殖帄台。 三、藻類作為生質能源開發及生物技術的應用 能源:energy:為未來世界各國競爭之重要資源,現今石化能源:fossil energy:將在不久未來枯竭,加上石化能源之石油利用,尤其運輸及火力發電,造成大量二氧化碳排放,並伴隨其它污染,是當今地球溫室效應的主因。所以,如何在未來開發經濟性之再生能源:renewable energy:,讓能源乾淨被使用,成為各國發展之課題。台灣屬於,,,能源物質輸入型國家,更是應提早因應,建立長期研發小姐,列為國家發展重點,務實執行,方能立足未來。 衡諸各項可能,台灣頇建立能源多樣化,防止失衡及失控之能源發展,因此在能源研發初期,宜多方向進行之,再擇若干項進階發展know-how,掌握關鍵。微藻作為油脂生產之生物材料或大型海藻細胞壁作為酒精發酵材料,為其中方向之一。以下簡述發展歷史,現階段成果及未來發展。 藻類因光能之利用而將二氧化碳轉換為有機碳,進而衍出許多產物,如多醣體之細胞壁成分,或儲存為油脂,或成為澱粉。所以,如何促進藻類產生更多油脂或細胞壁,必頇先取得無機碳源利用率高之藻類或利用生物技術及基因轉殖創造高利用無機碳之品?成為第一步之關鍵。 藻類通常以細胞外及細胞內存在之carbonic anhydrase將溶於水中之HCO轉換成3 12 CO,由細胞外擴散到細胞內,或直接在細胞內將HCO轉換成CO,造成暗反應進行之232 葉綠體:真核藻類:或細胞質:原核藻類:的Rubisco可以將RuBp:,碳醣:與CO連2接?,進行Calvin循環,形成有機碳:即醣類:再提供為,骨架,轉換為油脂化合物或多醣體等物質。另一方法,即利用膜上之HCO-transporter將量多之HCO-CO之工作。或332者,少數種類會利用PEPCase上HCO先轉換為有機酸或有機碳,此有機碳再釋放出CO,32使細胞質內CO氣體增加,有利Calvin循環境進行。這些機轉稱為二氧化碳濃縮機制:CO 22concentration mechanism,CCM:。台灣在這個階段之研發尚不多見,期許未來年輕學者投入此項研究工作。 CO可被藻類存放利用,所以業界及科學家期望藻類可以吸收工業生產所釋放之大量2 CO。這是個非常好的構思,唯應注意CO溶解所造成之水體酸化所引起?類無法生長或22 生物量不高之負面效應,至於人類既要減碳又要生產有用物質之雙重收獲造成無法生產有效成份之後果。因此,日本或歐美科學家極力尋找耐酸且無機碳利用率高:光合作用效率高:之藻類尤其是淡水藻,已成功獲得可生存於CO含量達,,,之水體的藻種,可惜的2 是這些種類均非目前具人類所需存放成份之種類。雖然如此,因為台灣的棲地多樣性高,收即可耐高CO含量之藻種,機率高,所以台灣仍可以努力。 2 藻類在生質能源應用的第二階段是選擇利用之標的物。一般而言,微細藻類作為生質能的用途可分為:無氧分解藻類產生甲烷或乙醇、由其累積油脂製造生質柴油及光合產氫。早在1980年代即有人從事微細藻類作為再生性生質能之開發,因為當時成本考量,未成為可開發的能源來源之一。由於目前因石化能源即將耗盡所帶來的高油價,使得微細藻類作為再生性生質能之成本,已相等或甚至更低成本於石化能源而獲全世界之注意。台灣雖已知此一趨勢,但對於如何開發及利用微細藻類作為再生性生質能的方式,仍未能深入了解。生質能在美國的發展史要回溯到1978年美國能源部所策劃的水生生物計畫(Aquatic Species Program),此計畫主要目的是篩選美國地區約3000種藻類中產油率高的品種,結果約有300種被設為目標,主要是以綠藻及矽藻為主,然而研究發展並非如此順利,由於無法得到大量的生質柴油(biodiesel),因此無法取得計畫經費被迫停止,此計畫從1980-1996年美國國家能源部即不再進行生質柴油生產研發,轉向由藻類生產其他能源,但民間機構卻開起另 13 一波由藻類生成燃油的研究大戰,截至目前為止由藻類開發生質柴油的研究與發展已經過約30年,更加確定藻類在生質柴油研究上的重要性。 目前可作為生質燃料的藻類原料包括:富含醣類的海藻、富含油脂的微藻及光合產氫藻類。大型海藻作為能源原料主要係將其所含的豐富纖維素(多醣類),利用醱酵過程產生甲烷或酒精,早在1968年,美國Howard Wilcox曾進行巨藻之培養研究,並規劃建置開放式的海洋農場來生產甲烷等產品,但是後來農場遭受海浪破壞而停止。直到1974年,美國天然氣協會、能源部與奇異公司,合作接手Howard Wilcox之海洋農場研究計畫,主要目標除了開發海藻栽植與收成技術外,同時嘗試以厭氧發酵法,將海藻轉換為甲烷,不過該海洋農場再次遭受海浪破壞而終止。近年,日本及丹麥等國目前嘗試收集海岸邊所沖上來的石蓴作為原料,一方面可以解決環境問題,又可以作為再生能源,可謂一舉兩得。在國內,農委會水產試驗所近年也鎖定大型海藻龍鬚菜及馬尾藻,利用其豐富的多醣成分提煉生質酒精。國內龍鬚菜產量在95年約有5950噸產量,而每公斤約可生產15%的酒精,雖與日本技術相當,不過轉化效率不足造成生產成本偏高,未來找出最佳的裂解海藻多醣的酵素將是技術突破的重點。由於以纖維素製造乙醇,仍需許多科學研究的配合,包括利用高效能的基因定序與運算尋找多樣的纖維素酶,整合相關技術以決定哪種酵素在發酵時能有活性表現與作用,並決定哪種新陳代謝分子會影響酵素的表現,且不同微生物對由纖維素製造乙醇有著不同的優勢,需藉由基因工程進行整合以發揮最大的效能。此外,生質乙醇的另一個問題是水份不易去除,而現行交通工具燃料引擎要使用乙醇燃料仍需進一步改裝,而利用微藻油脂所製成的生質柴油就沒有這些問題。至於藻類光合產氫主要由綠藻或藍藻類經光能將水分解成氫氣,由於產氫酵素對氧敏感當光合作用產生氧氣後很快即停止產氫。目前研究人員正嘗試以基因工程方法移除其對氧敏感的不利特性,另外亦可將耐氧細菌的產氫酵素移入藍藻,使其可在微量氧環境下產氫,但目前均在測試階段。 誠如前述,微細藻類累積油脂是因為微細藻類利用光能的光合作用能力先製造有機碳,再將有機碳轉換為油脂,累積於細胞,其效率高於產油作物 (oil crop)。由於實驗室保存養殖的藻種在大池培養常不具競爭優勢,因此找尋適當 (具高油脂累能力) 的藻種或利用基因改造技術改善藻種,是目前國內許多研究單位正積極努力的方向。單細胞生物均可 14 合成少量油脂來維持其細胞膜的構造和其生物機能,少數油質性微生物體內之油脂含量可達乾重之20%以上,扮演著能量儲存之功能,藻類在充分的光照及氮源缺乏的環境下,可以累積體內之油脂含量。油脂之合成是發生於光合作用之暗反應中,經由Calvin cycle,利用從光反應所產生之ATP及NADPH之能量與還原力,將二氧化碳固定,形成丙酮酸(pyruvate),之後轉成油脂合成之前驅物acetyl-CoA,油脂的合成則為前驅物acetyl-CoA經由一連串作用與反應,可簡略分成三部分: 1. acetyl-CoA經不可逆carboxylation利用acetyl-CoA carboxylase (ACCase) 轉變成malonyl-CoA。 2. malonyl-coA和acyl carrier protein重複結合聚集在與FA synthase ( FAS) 形成complex,合成長鏈acyl chain連續加入兩碳單位形成16:0-ACP。 3. 16:0-ACP延長及去飽和形成18:0-ACP及18:1-ACP重新合成的脂肪酸再送往cytosolic pool進行酯化轉變成acyl-CoA,此合成需ATP參與及acyl-CoA synthetase作用,植物將合成好的脂肪酸送往endoplasmic reticulum以glycerol作為骨架併入形成油脂的途徑稱為Kennedy pathway (圖3)。 圖3、Kennedy pathway。 15 水試所東港分所的蘇惠美研究員對於可商業生產的藻種,除成功建立藻類種源庫外,如何將藻類用於餌料、保健食品及油脂合成的用途有深入分析與見解。蘇惠美研究員認為: 可商業生產的藻種,多有特殊的成長條件,如螺旋藻喜歡在鹼性的環境中生長,而杜氏藻需要高鹽的環境,而商業生產之小球藻則是選定的藻株必需勤接種採收,否則產量非常不穩定,但也因此增加了很高的操作成本,必需仰賴大量的人工或精密儀器設計,故迄今能大規模養殖的藻種並不多,目前已知能商業生產的微藻種類不到十種,養殖的微藻包括有小球藻、螺旋藻、紅藻、杜氏藻、寇氏隱甲藻,主要作為保健食品。其中杜氏藻(Dunaliella)的細胞中,含有高達 14, 的β胡蘿蔔素,具有很強的抗氧化能力,目前主要用在保健的素材上,全球年產量約有 1,200 公噸,由於杜氏藻具有高經濟價值,且喜歡在高鹽度的條件下生長,而部份文獻亦指出在適當條件下油脂可以累積達50%,作為生質能源藻亦有其潛力,因此,未來亦可以作為深層海水培育的目標藻種之一。而戶外的試驗產量較高的藻種,大多是水產養殖常用的餌藻。根據東港水試所收集的45株微藻,在相同實驗室條件養殖,有11株含油量20%以上,從藻產量與油脂量計算之每公升油脂生產量,有5株藻較高為0.09-0.10 g/L,分佈於2個屬 (擬球藻與等鞭金藻),其近似種N. atomus在美國水生生 22物計畫中,產量為24.5 g/m/d,油含量16%,I. galbana產量稍高為28.1 g/m/d,油含量22%。等鞭金藻類富含DHA,但對溫度敏感且易被食藻生物吃掉,在戶外穩定養殖較困難。東港水試所在戶外養殖擬球藻多年,目前該株可適應高溫且半連續式培養可維持數月。擬球藻富含EPA,可舒緩血壓、心跳及抑制膽固醇,防止血栓及心肌梗塞,是很好的食物,但藻體僅2-5微米,收穫成本較高。另外,亦有研究使用葡萄藻做為碳水化合物的來源。這物種約有75,的乾重是天然碳水化合物,且適於存活在鹹水中。但是這物種每兩日分裂繁殖一次,雖不算過慢,但僅及其他許多藻類繁殖速率的 10 ~ 15 分之一而已。因此,若要進行符合經濟效益的量產,必頇篩選或用基因工程製造出繁殖快速且碳水化合物含量高的品種。 藻類養殖的培養環境因子對於藻類的細胞生長、油脂種類與含量及脂肪酸分佈等皆有不同的影響,影響藻類的培養因子包括:光照、二氧化碳、溫度、營養鹽、鹽度及pH值等。 16 自營性生長的藻類需充足的光照以行光合作用,由文獻的結果顯示光合作用效率一般在 -2-1 1700-2000 µmol photon m s達到飽和 ,然而過度的光強度則會抑制光合作用效率。除了光照強度問題外,藻類在光照下的光合作用及非光照下的呼吸作用間之週期循環亦可能影響藻類的生長,不過由文獻的結果顯示在實驗室培養下,連續照光養殖比12小時亮及12小時暗的養殖條件下藻類生長較好。由於無論使用那一種養殖設施,僅在水層表面數公分藻體可以吸收到充足光照,因此國外目前許多公司使用的直徑約1.2cm並隨光傾斜的密閉管可以有最大的產量,密閉式光反應器較能克服光照不足與雜藻感染的問題,但設備昂貴且工程技術門檻較高。藻類行光合作用時除了光源之外,亦需要溶於水中之無機碳作為碳源, - 2--由於藻類無法直接利用 HCO和 CO,而HCO之利用則因藻種及培養條件而異,故水333 中溶解二氧化碳是最常用於藻類培養的無機碳源。在藻類培養過程中適量的通入二氧化碳可有效提升生長速率,然而若加入過量則可能降低pH值,抑制藻類的生長,因此除了可以調整二氧化碳及空氣進氣比例外,亦可以於藻類培養基中加入緩衝溶液,以控制pH值在最適當的生長條件。另外,調控二氧化碳的通氣量亦會影響藻類的脂肪酸分佈,研究顯示Pavlova lutheri的研究發現,二化碳通氣量較高可以提升藻類的油脂含量,但會降低多元不飽和脂肪酸含量。 溫度亦是影響藻類生長的環境因子,美國過去曾在新墨西哥州戶外培養藻類,因溫度低使整體產量僅為最高產量的五分之一,其中季節造成溫度的變動使得夏季產量為18 22g/m/d,冬天僅剩3 g/m/d。由於溫度的上升會導致二氧化碳之溶解度下降,並且提升呼吸作用,造成淨光合作用效率降低。相關研究顯示當培養時度超過攝氏30度時藻類的生長明顯變差,油脂含量亦隨溫度上升而下降,在低溫培養時,油脂中的多元不飽和脂肪酸比例會提高。另外,營養鹽的缺乏會導致細胞代謝以及光合作用中間產物之異常,藻體中氮佔了乾重的7-10%,氮是構成蛋白質、氨基酸、酵素、輔酵素、葉綠素和細胞膜等重要化合的必需成份,文獻指出,碳氮比會影響藻類油脂含量,在過量的碳源和氮源不足的環境下,會使得藻類累積油脂,然而有些藻類如杜氏藻在氮源不足的環境下卻是累積碳水化合物。鹽度對於藻類生長、油脂含量、脂肪酸組成都有影響,例如當鹽度增加時等邊金藻及擬球藻的油脂含量會上升,鹽度亦會影響藻類之EPA、DHA及類胡蘿蔔素含量等。 17 具高油脂成分之微細藻種,常見者如下表一所列。根據Dr.Chisti在Biotechnology Advancos:2007:25:294-306在有關以微細藻類生產生質柴油的論述文章,比較不同植物及藻類生產油脂之所需面積比較;指出微細藻類是最有效率的植物,遠高於棕櫚樹,資料如表二。 表一、微細藻類之總油脂含量。 引用自Chisti (2007) Biotechnology Advances 25: 294-306 表二、美國之生質柴油生產植物效益比較。 18 引用自Chisti (2007) Biotechnology Advances 25: 294-306 本研究室為了瞭解臺灣本土藻種之油脂累積能力,今年開始利用小球藻 (Chlorella sorokiniana T-89) (圖4A) 及擬球藻:Nannochlorpsis oculata:(海生館盧重光博士提供) (圖4B) 觀察其油脂累積情形,以專門與中性油脂:三酸甘油脂,Triagcylglycerol;TG或TAG:作用之螢光染劑尼羅紅:Nile red:進行之,發現小球藻在生長期晚期或缺氮情形會有大量油脂累積:見圖5及6:,數量顯著增加且含量增高 (圖6黃色螢光量高於圖5之營養鹽充足環境生長者)。所以,只要在適當條件下,藻類細胞可以累積油脂。擬球藻在生長期晚期也會有大量油脂累積:圖7:。 A. 小球藻 T-89 B. 擬球藻 (海生館盧重光博士提供) 19 圖4 A.小球藻 T-89 (Chlorella sorokiniana T-89), B.擬球藻 (Nannochloropsis oculata) ‘Nile Red’ yellow fluorescence Light microscopic observation 圖5、Chlorella sorokiniana T-89 營養鹽充足環境生長之中性脂肪細胞數量及含量。 ‘Nile Red’ yellow fluorescence Light microscopic observation 圖6、Chlorella sorokiniana T-89 缺氮下之中性脂肪細胞細胞數量及含量。 ‘Nile Red’ yellow fluorescence Light microscopic observation 20 圖7、Nannochloropsis oculata營養鹽充足環境生長之中性脂肪細胞數量及含量。 目前,藻類細胞累積油脂的方式大概可以分為,大類:一是生長期間即具有大量油脂含量之藻類,二是,階段方法,先進行大量生長,取得生物量最大化,再以環境之變更,誘導油脂累積,此階段稱為誘導期。環境變更方式,包括缺營養塩:如缺氮,缺磷,缺硫,缺鐵或缺矽等:極端溫度,提高塩度,改變光照量等,最常使用手段為缺營養塩之誘導模式,省成本。 藻類二階段之累積油脂的機轉,被認為是因為在缺營養塩下,藻類會減少光合作產物形成儲存性醣類,而且將這些光合作用產物轉向油脂之合成,並以三酸甘油的中性脂肪儲存於油滴構造。目前已有研究,篩選出較少澱粉之藻類:突變方式篩選而得:,期許可以証實油脂合成加速並堆積與澱粉較少合成有關係。若能突破,人類可更進一步調控或增進藻類油脂含量。 一般認為藻類油脂之合成之關鍵在於:,、脂肪酸合成,,、脂防酸:多為C14:0以下之碳鏈脂肪酸:由葉綠體向外輸送到細胞質的速度,,、脂肪酸之碳鏈加長及不飽和化,,、三酸甘油脂之合成,,、具蛋白質之油滴膜形成 (圖8)。所以,藻類是否堆積大量油脂,是由光合作用,油脂合成運送及沈積於油滴,再加上澱粉是否累積合成與外界環境影響等綜合表現之結果,因此多數科學家認為藻類是以一群基因控制油脂累績,也據此推論,藻種是主要關鍵,不同種類間的遺傳物質及基因表現差異可能是提高油脂合成與累積的重點。對於此點,如何收集種類,建立種原庫及篩選帄台,分析栽培環境,是臺灣應該建立的長期發展方向。另一方面,已有國外科學家組成研發團隊試圖由基因體、蛋白質體及代謝體學著手全面性解析藻類累積油脂之機轉及最適環境組合。作者呼籲台灣之產官學應及早組成團隊進行研發,跟上國際競爭腳步,取得智財權,成為地稠人狹台灣利基。 藻類除油脂之利用外,尚可用之於酒精之產生;酒精可以,方式產生於藻類,一是以 21 藻類之較少或幾乎無木質專之細胞壁及多醣體,作為酒精醱酵之原料,二是直接合成酒精,分泌到培養液而收集之,這種方式比細菌及真菌發酵省成本,即不用外加醣類而是以藻類光合作用產物由細胞內之代謝改變而自行合成酒精,但瓶頸是酒精產生量極低,且日後必頇耗大量能源蒸餾酒精,不符再生能源之原意,成本仍高。 四、未來展望與企圖 緣於台灣面海,棲地涵蓋高山及深海,分布由亞熱帶至高溫之熱帶,造就藻類資源豐富,具多種特性。藻類種源庫是生物技術發展的根基,也是藻類產業的要求,雖然國內在蘇惠美博士多年努下已有雛型,然人力及設備之不足,限制藻類種源庫應有之制度化,如建立種源之遺傳特性的圖譜系統,也限制擴展收集種類之規模,本文作者建請應由政府出資邀集產學共同設立具規模之藻類種源庫,健全台灣藻類利用及產業之基礎。藻類產業發展,應結合台灣之各界專家學者,分階段進行研發,如第一階段以5-10年時間,設為基礎研究時期,建立種源及各藻種之基本遺傳、生理特性與生長條件的資料; 第二階段由第一階段之中期加入,設定為生技應用導向,量化及產業化可利用之藻種。期望在此關鍵,台灣能在藻類生技的產業發展持續,尤其是油脂生產及機能性脂肪酸開發。 22 圖8、油滴之構造。 23