头孢菌素C酶裂解的进展与产生7_ACA产黄顶孢霉菌株的构建

国外医药抗生素分册 , � ��� � , �仑� ‘ �卜 沙 ,‘甲 , ‘甲晒尹协口叼, 、� 口喃夕仙, 气 · � � � � 霉综述和编译 霉匆小小小承爪承率小广 头抱菌素�酶裂解的进展与产生�一��� 产黄顶抱霉菌株的构建 虞 , 匡 综述 �上海 第三制 药厂 , 上海 � 产黄顶抱霉 �� � 动�� ��� 翻“。�� � �� ! � � �� �’� 二”产生的头抱菌素� ���� � , 经过化 学裂解 , 形成的母核 �一� � � , 成 为 许 多半 合成头抱菌素的起始原料。 自 从�� 世纪�� 年 代初开始探索���酞化酶产生菌以来 , 假单 胞菌菌株�� � � 一� 的� � 一�� � � 酞化 酶 工 作 �� � � � � , 为� ��酞化酶的获得 �� � ! �打下了 基础 � 虽然迄今报道的� ��酞化酶 , 还不能 像青霉素酞化酶那样应用于工业 生产 〔‘, , 但 随着产黄顶泡霉中基因转化系 的 逐 渐 完善 �� � � � � � � � � , 近来矶贝隆夫等 �� � � �� 首先 报告了构建产黄顶抱霉的 卜� � � 产 生 菌 株 〔“〕, 稍后小松谦一 �� � � � �也独立地发表了 类似的工作即 , 对工业生产则更富有吸引力 。 他们都 以此为作了综述 〔� �’〕。 本文 归纳了 这方面工作的 国外进展 。 一 、 头抱菌案�醉裂解的进展 ��� � 位酞胺键的化学裂解 , 采用偕亚 胺醚法 , 需用甲硅烷基化保护剂 及 五 氯 化 磷 、 二氯 甲烷 。 � ��酶裂解方法 �图 �� 包括 � 两步酶法 �微生物 � 一氨基酸氧化酶与� � 一�� �� 酸 化 酶� � 一步化学与一步酶法 �用化学方法制备 �, 化学裂解法 �� � 。矛介、州吮 � 二· � 酶法�� �二�� �� 经由� ��� � � � �� 酞化酶法 赔酸 基酸氧化酶 �产于 � ��� � � � �。臼� � � � 一� � � � 酸化醉 日� �� �� 丁丫� 、 �少� 、广 �日之��� 学氮汗、卜乍�七职济� ��门�沪��月� ��之日 �� �� 一 ��� 琦 �‘�丢�上,扮 产 。。,八、升”、一 丫日 ‘〔尹良尹�� 夕灿� � �“�‘� 印 ‘们� “、尹悦呀分 �’」� � �、 � 一十�人 �� �日 � ‘一�人�� � 酸化酶 单胞菌� �一� �人 �� 人�� 卜� ��, 。�否�占,加 � 品了 困 � 头抱菌素�转变成� � �� 的三种方法 � �。 化学 裂 解 法 , � 。 ��� 一步化学、 一步酶法�化学尸 酶法 � , ��� 二 步酶法 , � 。 ���酞化酶法 一 � � � 松田等�� � � �� 的� � �� 菌 株栩 , 除 了产 生� �一 � � � � 酞化酶 �� 以外 , 还产 生 少量 能够直接作用于� �� , 形 成 �一� �� 的� �� 酷化酶 ��� 。 虽此酶的底物专一 性 较 � 广 , 但 以� ��作底物时 , 相对活性只相当于� � � �� �� 的 � � 。 �对� ��的亲和性低 , � � � � � � � , �一� �� 对反应有抑制作用 , 高浓 度���的转化率仅� � � �图 � �〔� , 。 �司�一。已已�丈曰�卜钾��口 � �一�� �� , 再使用� �一� � � � 酞化酶 � , 使用 � ��酞化酶的一步酶法 。 � � �年 日本旭 化成公司 成功地使一步化学与一步酶法应用 于� 一� � � 的工业化生产 。 � ��酞化 酶 则尚 处于研究阶段 。 �一 � 化学 �酶 � � � 一 � � � � 酸 化酶 �法 制 取� 一� � � 〔� 〕 日本旭化成公司于 � � � �年完成了工业化 的化学 �酶法制取 �一� � � 的工艺。 实质 是该工艺集将近 �� 年 研 究 成果的大成 , 其 基础包括 � �� 东洋酿造工作 者分 离得� �� � � � � 酞化酶产生菌�不� � 一 � , 经过 诱变育 种获得活力提高�� 倍的� � 一�� 菌株 , 应用于 酶的制备 � �� 旭化成工作者完成酶 的 固定 化与酶反应器的制备 � �� 旭化成工作 者 完 成了以化学氧化法从���高收率地制备� �· �� � � � �� 旭化成工作者在� ��产 生 菌株 的育种工作中 , 使� ��发酵单位较初期提高 了� �倍 , 获得了硫酸盐利用能力 强 的 突 变 株 , 发酵培养基中不用甲硫氨酸。 在该工艺中 , 发酵所得的� ��不必经过 分离与精制 , 滤液经无菌过滤 , 采用乙醛酸、 � � 千 � 、 毗吮或 甲基毗咤 , 使滤液 中 的� �� 直接氧化成� � 一 � � � � , � �一 �� � � 于部分 精 制后 , 通过� �一 � � � �酞化酶反应器 , 水 解液中的 � 一� � � 经脱色精制 , 等电点结晶 。 整个过程在温和的温度及� � 值条件下进行 。 � �一 �� � � 酞化酶固定于阴离子交换树 脂上 , 以戊二醛作交联剂 , 以�� � �柱为例 , 酶反应的单批时间共 � 小时 , 反应佩度先 �� ℃ , 于反应速度下降则增至 �� ℃ , 一天使用 � 次 。 使用�� 次 , 酶活力保持 良好 。 � ��转变成 酮 基� ��的 反 应 收 率 约 �� � , � � 一� � � � 经酶水解 得 � 一 � � � 收 率 约� � � 。 �二 � ���既化晦 自从青霉素酞 化酶 成 功 地 应 用 于 � � � �� 工艺生 产 以来 , 在将近�� 年的时间 里 , 还没有找到满意的���酞化酶 。 � 。 假单胞 菌的� ��酸化酶 � � 。� , �一一� 二】� 。 � 一 。 � � 一 。 � � 一。 一 � 一 、 � 名� � �盯�队卜卜�� � �� � � � � �� 图 � ���酞 化酶反 应 过程 �酶 � 细 胞 提 取 液 � � � � � � �, � 。 l m ol / L 磷 酸缓 冲液(pH S .0) , 渝℃ ) 矶贝等 ‘1 9 9 1) 从土壤中分离的缺陷假单 胞菌(尸:. 山。‘加ta )V 22 菌株 , 也能产生l型 般的C P C 酞化酶 。 去酞化酶作用的 最 适pH 值为8.7 , 与S E 83 菌株的酶相同 。 不同pH 值 的酶活性: pH S.0(约50 % ) 、 7 . 0 ( 约25 ;‘) 、 6 . 0 ( 约10 % )〔4 , 。 2 。 其它微生物 的C P C 酸化晦 巨大芽抱杆菌的C P C 酷化酶基因也已克 隆 〔3 , 。 ( 三) G L 一了A C A 醚化晦和 C P C 配 化 晦 基因 的克隆 克隆假单胞菌G K 16 菌株 的G L 一 7 A C A 酞化酶基因时 , 松田等(1985)〔7〕将该菌的总 D N A , 以Pstl 部分 酶 解 , 获 4 ~ 9 k b的 片 断 , 质粒pA K K I建 自7.35kb 片 断 与pBR 的P stl位点。 大肠 杆 菌C 600(pA K K i) 8的表达效率低。 以后经 过 4 轮 亚 克 隆 , 将 了、 3 5 k b 片断酶切 , 使与启动 子 相联 结的片 断减小 。 由2. 45k b片断建成 的质粒 pA K K U 护 , 大肠杆菌C 60 。(p A K K U B l) 的表达效 率显著提高。 松田等(1987)〔“’克 隆 SE 53前株的 酞化 酶基因时 , 该菌的 总D N A 用B g/l及B “皿H l 部分酶解 , 收集 4 ~ 9 k b 片断 。 衍生自pB R 325 的质粒pSK l2( 房内酞胺水解酶基因已失 活) , 经 Ba m H I切割 、 去磷酸后与上 述 片断 联结 , 转化至大肠杆菌M C lo61 , 在 筛 选约 10 000个菌落中 , 获 9 个阳性克隆: 三 个 获 4.skbBg汪 片断插入 , 称为 质 粒pA M K I , 含acy l基因 . 编码G L 一7 A C A 酸化酶; 6 个 获6kbBg江片 断插入 , 称为质 粒pA M K 3 , 含。 c 了万基因 , 编码 C P C 酚化酶 。 初始克 隆 的p A M K I 、 p A M K 3 , 于 表达 时 酶 活 性皆低 。 a c 几基因亚克隆时 , p A M K 3 中的 6k b B g江片断 , 经酶切 减 小 , 与质粒 FE X ooZ中laeU V 与联 结 (B ao H I及Sa ll位 点) , 获质粒pE X A 211 , 大肠杆菌 M C IO61 (pE X A 211) 表达的C P C 酞化酶 水 平 , 比处 于四环素抗性基因启动子控制的 大 肠 杆 菌 M C 106z(p A 入立K 3 )提高约20倍 (表 1 ) 。 表1 G K招菌株G L一 7 A C A 决 化酶基因 与SE 83菌株 ac y l!及 aCy l基因的 克降与表达〔‘ ’ 7 , p A M K I 亚 克 隆 时 , 4 . sk b B g 趣 片 断 经酶切减小 , 克隆至 pA C Y C 18峨, 获 质 粒 pE X G S, 表达时G L 一7 A C A 酞化酶的水平 , 较P A M K z提高约 22倍(表 i )。 4 . G L 一7 A C A 乱化晦与C P C 既化酶的分 子生物学 G K 一16 菌株的G L 一7 A C A 酞 化 酶基因 (A ) , S E 83 菌 株 的 G L 一7 A C A 酸化酶基因 (C ) , S E s 3 菌株的C P C 酞化酶基因 (B )中 , 都包括小 、 大两个亚单位 。 基因A 中 , 在小 亚单位前还有信号肤序列 , 相似于大肠杆菌 的青霉素G 酞化酶基因 (D )。 基因A 、 B 都是 小亚单位在前 , 基因C 则相反 、 大 亚单位在 前 , 而与巨大牙饱杆菌的C P C 酞化酶基因相 似。 基因的翻译产物 , 推想先形成包括信号 肤在内的多肤 , 然后去信号肤 , 形成前体 , 再由前体形成小 、 大分子量不同的亚单位 , 最后联结成活性型式的酶分子 。 基因A 、 B 、 C 、 D 产物的 比较见 图 3“用 , G L 一 7 A C A 酞化酶 酶活性(10一 ’u / m g 菌体 干重 ) 大肠杆菌C 600 (P A K K I) 大肠杆 菌(pA K K U B I) P s · 印.G K z6 C PC 酞化酶<:ev贾) 二 、 7 一人C 九产生菌株的构滋 ’ ( 一) 藤泥 药品 工业公 司 1987年矶贝等发表了能应用于产黄顶抱 霉基因转化的质粒 pC Y G g了。 为了构建产黄 顶泡霉的 7一 A C A 产生菌株 , 分禽了产生C P c 酸化酶的缺陷假单胞菌V 22 菌株 , 并 克隆了 该基因‘, , 。 另外又克隆了 茄 病 镰刀霉 (尸. 50 1助幻M 一0 71 8 菌 株 的 D 一氨 基 酸 氧 化 酶 (D A O )基因娜 , 此菌的D A O 活性与变异三 角酵母 (T r匆ono户: 15 o a , ‘a6 ‘If) 相当 。 此外 还克隆了才. e 人r少:。g e ,‘:,。 A T C C 1 1 5 5 0菌 株碱性蛋 白酶 (A 工P) 基因〔“, , 利用此基因的 控制单位 , 作为C P C 酞化 酶 基因 、 D A O 墓 因的表达之用 , 整个工作化费约 7.5年 。 茄病镰刀霉M 一。了18 菌株D A O 基 因的克 隆 , 寡核 阵酸探针根据精制D A O 的 无色杆 菌蛋自酶I处理片断 , 肤A P 一3 、 A P 一9 及 A P 一6 的58个氨基酸残基信息 。 提取得的。 R N A , 建立cD N A 库 , 以 上述探针 进 行 筛 选 , 获 一了.0乙介0 ,1.1 酶活性(U /二 l O D 60 0 K 10一 , 大肠杆菌 M C zo61 rp A M K 3) 大肠杆菌 M C zo6z‘p E X A Z zz ) G L 一7 A C A 酞化酶(acy l) 大肠杆菌(P A M K I) 大肠杆菌(pE X G S) 一 4 0 4 P e n id llin G a e y la s e . ( E . 印11) 碱 . ! 记套咨 :08A 、 备 辱 557AAM一A · E . . . . . . . . A · A 一T · S N . . . . . . . . . . . . . . 甲. R (S ) S 一 S U B U N I T 卜SU BU N IT G L 一 7 ^ C A a e y l a s 砂 <生 I礼 V 169A A 5 2乞A A (尸‘‘u d 们阴。刀 a ‘ s P . G K 1 6 ) M 一A oE . .. . .. 口G o S N . . . . . . . . . . 曰. . 目. . P (S ) S 一 S U B U N I T L 一S U B U N I T N l .S C P C a e y 护百亡“ J o m o 几 a ‘ 16 e s 昆sEa3z 239AAM .............. GS一S U B U N I T 5 3 5 A A , , , . , . . . . . . . . . . . 人 L 一S U B U N I T A e y l a s e l (P J e u J ~ 栩 3P. SE83) 367A 、 l , 9 ; A 、 M 日巴翻日生口峨 想. . . . 日日. . D .T T . . . . . . . . . I . 1 S U I二t下N l‘1 ’ S 一S U B U N I T 图3 青 霉素酞化酶与头抱菌素酞化 酶 的基 因产物推测 箭头代表形成的部位 , S : 信号肤序列 , A A : 氨基酸 D A O 的 。D N A 、 互 补D N A 中包括的1 186 硷 基 , O R F 编码 361 个氨基酸 , 表达质粒pC F S 31 5于大肠杆菌JM 105 中表达 , 产生 的 D A O 达可溶性总蛋白的8% 〔田 。 产黄顶抱霉A 印 基 因 的 克 隆 , 于建立 cD N A 库后 , 以从纯化酶制备的抗 血清 , 供 A lp cD N A 筛选 。 获 得 的 A lp cD N A , 作 P C R 扩增 , 互补D N A 构成的表达质粒pE X 一 2 ￡· c ea l U e : i a l Y N N 2 7 ( p E X 一 2 ) 产生的A lp 相当于纯化酶 0.22拌g / m l〔8 〕。 7 一A C A 生物合成操 丛子构建时““’, 建 成的质粒pH D V n 中C P C 酞化酶基因 、 D A O 基因 , 皆使用上述 A lp基因的控制单位。 以 潮霉素B 抗性基因(H m 勺 作 为 显 性选择标 记 , H m R 也使用A lp基因的控制单位 : 启动 子 了核昔酸序列 一 6 14 至 一 38 ) 、 终止子 (核昔 酸序列 一 7 4 至 + 839 )。 在上述构建过程中, 先建 成 具 有H m R 基 因的表达质粒pC Y G 一H B 一 51 , 具有A lp基 因控制单位的质粒pC Y G E B 一2 。再衍生得具 有酥化酶基因的表达 质 粒 pH B V I , 或具有 D A O 基因的表达质粒pH BD 3。 质粒pH D V ll 建自pliB V I , 含D A O 基 因 的 pC F S 315与 pC Y G 一 E B 一 2 。 p H D V l l 、 p H B V I 、 p H B D 3 转化至 C P C 工业菌株B C Zii6 , 挑取平 板含25拼g / m l 、 5 0 雌/m1 潮霉素B 的生长菌落 , 再移至 50召g / m l 潮霉素 B平板 , 挑选稳定的转化子 , B C 2 1 1 6 菌株的转化率显著低于 野 生 型 菌株A T C C 11550。 B C 2 1 1 6 转化子的H m B 抗性稳定 , S o u · t he r n 结果判定存在 多 重插入 , 发酵试 验中头抱菌素的总效价 , 显 著 低 于 亲株 , C P C 水平为6.9~ 8.7m g/m l不等 , 三类转化 子所产的预期抗生素(7一 A C A 等)仅 相 当于 所产C PC 的3% 左右。 p H D V i i 转 化 子 H m 16 5、 H m 1 7 s 只产 7一A C A , 达一4 5 ~ 1 5 0拼g / m l。 转化子 H m i7了- 产生7一 A C A ( 2 0 拜g / m l ) 和 G L 一7 A C A ( 1 5 5 “g / m l) ; p H B V z转化子只产7A C A (10 ~ 55 那g / m l) ; p H B D 3 转 化 子 只 产 G L一 7 A C A ( 1 2 5 一 ]4 5拼g / m l) 。 根据上述结果 , 矶贝等认为 转 化子H m 165及H m 17s中 , G L 一7 A C A 的 产生 , 是7一 一 4 0 5 . A C A 生物合成的 限 速 步骤 , 希望采取减弱 产黄顶抱霉15一5 菌株中应 用 的 表达质 产黄顶抱霉的触酶活性的战略 , 以便提高7一 粒 , 以H m R基因的表达作为显性选择标记 , A C A 产量 。 此外 , C P C 酸化酶 以 C P C 为底 H m R基因使用产黄顶抱霉的A C T 基 因的控 物时 , 活性只相当于G L 一7 A C A 的2 % 一5% , 制单位 。 C P C 酞化酶基因 , 则使用产黄顶抱霉 反应的最适pH 为9 , 而C P C 发酵 液 的pH 值 磷酸甘油激酶基因的启动子及终止子 。 建成 为5.5~ 6 .5 , 发酵终了 时 达到7 , 于pH 7时 的质 粒 pSA C Y Z 含C P C 酞化酶基因的一个 的酶活性只相当于最适pH 时 的 25 % , 则这 拷贝 , 质粒 pM A C Y Z则含4个 拷 贝 。 质 粒 些也将是限制因素。 p M A C Y Z 转化子的 C P C 酸化酶产量 , 达可 (二) 旭 化成公 司 溶性蛋白的2 % 。 于矶贝等 (19 91 )〔们的文章发表不久 , 小 产黄顶抱霉 15 一5 菌株的 p S A C Y Z及 松谦一(19 91 )〔幻也发表了构建产黄顶抱霉的 pM A C Y Z转 化 子 发 酵 液 中 7一A C A 的 积 7一 A C A 产生菌株的综述 。 有关C P C 酸 化 酶 累及C P C 产生见表2o 基因的立隆工作 , 见前节 。 表 2 产黄顶抱舞转化子的7一 A C A 产生〔3〕—一 . ” 11,l’ 己声c酞化酶 ’ } ’c P C ( 、g少J’l )” { 俪应瘫瓜1了一一夭一天一一天 一天印一转 化 子产黄顶抱霉15 一 51 5 一5 ( P S A C Y Z ) z 1 5 一 5 ( P S A C Y Z ) 2 1 5 一 5 ( P M A C Y Z ) 1 1 5 一 5 ( P M A C Y Z ) 2 1 5 一5 ( p M A C Y Z ) 3 N 。 D 。 2 6 4 8 N 。 D 。 N 。 D 。 。 2 。 5 l 2 2 0 2 5 2 7 6 1 2 6 7 0 1 1 7 0 1 1 1 4 1 8 一 9 3 9 。 9 4 0 一 3 8 1 。 5 2 7 1 6 1 1 4 5 1 5 7 一 3 7一A C A 的 生成量与C PC 酸 化酶活 性相对应 , 产生的7一A C A , 以发酵6夭计最 高相当于C P C 的3% , 延长至 7 天 , 7 一 A C A 虽可继续增长 , 但C P C 则下降 。 此外在发酵液中 , 虽大部分C P C 酞化酶 存在于胞内 , 上清液中 也 可 检 测得微弱的 活性 。 三 、 结束语 C P C 的酶裂解 , 经过将近 3l) 年的研究 , C P C 酞化酶还没有达到青霉素酞化酶的技术 经济指标 。 要获得符合大 工 业 生 产要求的 C P C 酞化酶 , 尚需不断探索与研究 。 虽然通过 基 因 操 作 , 将 D A O 基因 , C P C 酞化酶基因克隆至产黄顶抱霉 , 并实现 了发酵液中少量7一A C A 的积聚 , 但 离 开工 业化还有许多工作要做 , 首先要有良好的修 饰C PC 酸化酶作后盾 , 在现有基础上的转化 子改良工作 , 当然已经在进行 , 但可能也不 是一墩即成 , 只 有使工业菌株产生的7一A C A 在数量上替代C P C 时 , 才能真正成功 。 小松 谦一在他的综述结尾中表达了 “希 望 更多的 研究者参予这个领域”的愿望 。 此外 , 旭化成公司的化学 /酶 法 制取7- A C A 的工艺 , 虽然报告了 已于19 78年实现工 业化 , 但可能限于条件与C P C化学裂解工艺 没有对比的技术经济分析数据 。 ’ 依松本邦男 (1980 )〔‘。〕报道从发酵液开始计 7一A C A 总收 率达30 % ;至1989年则总收率可望继续提高 。 随着时间的推移 , C P C 的 酶 裂 解 与7- A C A 产生菌的构建必然会实现人们的 美 好 (下转第4G9页 ) · 4 0 9 . 脱 乙酞一A C A 作为B L 07 2酞化酶的底 物稍好 于G l一7 A C A ( 附表)。 由于与细胞 有关 的醋 薄活性的存在 , 所以由G l一7 A C A 所 形 成的 一些产物是按照 脱 乙酞一7 A C A 测 定的 。 在 脱 乙酞和脱乙酞氧衍生物中不存在敏感的醋 部分 。 如在筛选中利用这些化合物则是一个 有利条件 , 因为酷酶活性不致干扰产物的形 成。 筛选中利用脱 乙酞或脱乙酞氧衍生物的 另一个有利条件是 它们有 增强 的化 学稳定 性。 附表显示 , G 卜脱乙 酸一7 A C A 和G 卜7 A D C A 的稳定性分别为G l一 7 A C A 的 5 倍和 24倍 。 G 卜7 A C A 酞化酶活性可靠性 的补充证 据是 , 以上所形成的三种产物(7一 A C A 、 7 - A D C A 和脱 乙酞7一A C A )均 对头 抱 菌素酶 的水解敏感 。 附表 含 GI 一7 A C A 酞化酶的 BL O 72 细胞的底物特异性“ 底 物 相 对 罄化 酶 活 性 化学分解速率 (% h 一 ’) G I 一7 A D C A G 卜脱 乙酸一 7 A C A G 卜7A C A C P C 100 99 72‘ 4 0 。 1 7 0 。 9 1 4 一 l 5 . 2 a 将 B L o72 的全发醉液同 10 9/L 浓度的 G 卜7A C A 、 G l 一 脱 乙酞 一 7 A C A 、 G I 一 7 A D C A 或 C P C 一起于 37 ℃ 温 育4h. G 卜7A D C A 反应最迅速 , 4 h 后转 化率 10 % 。 这种比率 系反应速率 归一化而得 。 底物 的化 学 ‘非 酶促) 分解速率 在 pH S和37 ℃同祥条件下获得 b 由子酿酶的存在 , 所形成的23 % 产物是 脱乙酸 一7 A C A 由于声波破碎和冻结融化处理都不会提 高完整细胞悬液中酞化酶活性的表达 , 所以 认为酞化酶是位于周质 内或另一个易 接近 G l一7 A C A 的部位 。 对B L o72 正进行更深入的研究 , 其 突变 株的 中试规模发酵业 已进行 。 希望这种酸化 酶将在发展经济性的转化C P C 成为 7一A C A 的工业生产方面所迈出的一步。 廖 福荣编 泽 ( 上接第。。5页 ) 期望 , 问题是还要作出什么样的努力以及努 5 力多久? 参 考 文 献 虞 懊. 国外医药抗生 素分册 , 1 9 9 叭 11( 1) : 14 Isog a i T et aL B io l T eeh n o l, 1 9 0 1 , 9 , 1 8 8 小 松谦一 尺 了才廿 了 夕 久 己 了 夕 犷 久 卜 , 1 9 9 1 ; 4 9 ( 6 ) : 6 1 2 矶贝纯夫 et al . 化学 巴生物 , 均91 ; 29 (4) : 2 19 都某胜昭 。t a l . 日本农 艺化学会志 , 1 9 5 9 多 6 3 : 1 8 4 7 M a 亡s u d a A e t a l。 J B a e t e r j o i , 2 9 8 7 , 1 6 9 : 5 8 1 5 M a t s u d 几 A e t a l 一 J B a e t e r i o l , z , 5 5 ; 2 6 3 : 1 2 2 2 I s o g a 主 T e 亡 a l. J B i o c五e m , 丈9 9 0 ; 2 0 5 : 1 0 6 3 Is o g a i T e t a i. A g r i C h e m , r 9 9 里; 5 5 r 4 7 1 a o 松本邦男。 发酵 巴工业 , 2 9 5 0 , 3 8 : 2 j 6