角质酶的研究进展

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2009, December 25; 25(12): 1829-1837 journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@im.ac.cn © 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved Received: September 15, 2009; Accepted: November 10, 2009 Supported by: National Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 20625619), Program for New Century Excellent Talents in University (No. NCET-05-0488), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2009AA02Z204), Key Technology Research and Development Program of Jiangsu Province, China (No. SBE200900022). Corresponding author: Jian Chen. Tel: +86-510-85918309; Fax: +86-510-85918309; E-mail: jchen@jiangnan.edu.cn 国家杰出青年基金 (No. 20625619), 教育部新世纪优秀人才支持 (No. NCET-05-0488), 国家高技术研究发展计划 (863 计划 )(No. 2009AA02Z204), 江苏省科技支撑计划(No. SBE200900022)资助。 综 述 角质酶的研究进展 李江华 1, 刘龙 1, 陈晟 2, 堵国成 1,3, 陈坚 1, 2 1 江南大学生物工程学院, 无锡 214122 2 江南大学 食品科学技术国家重点实验室, 无锡 214122 3 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122 摘 要: 角质酶(EC 3.1.1.74)是一种可以降解角质并产生大量脂肪酸单体的水解酶。角质酶是一种多功能酶, 可水解可 溶性酯、不溶性甘油三酯和各种聚酯, 同时还能催化酸与醇的酯化、脂肪酸盐与醇的转酯化反应, 因此在食品工业、化 工工业等诸多领域都具有广泛的应用。近年来研究发现, 角质酶可实现棉纤维的生物精练和合成纤维的生物改性, 是推 动纺织工业清洁生产的关键酶制剂。 关键词 : 角质酶 , 角质 , 棉纤维的生物精练 Advances in cutinase research Jianghua Li1, Long Liu1, Sheng Chen2, Guocheng Du1,3, and Jian Chen1,2 1 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 2 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 3 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China Abstract: Cutinase (EC 3.1.1.74) is a kind of hydrolase capable of catalyzing the cleavage of ester bonds of cutin to release fatty acids. Cutinase displayed hydrolytic activity not only toward cutin but also a variety of soluble synthetic esters, insoluble triglycerides and polyesters. Besides its hydrolytic activity, cutinase also showed synthetic activity and transester activity. Therefore, cutinase was evaluated as a versatile lipolytic enzyme used in food and chemical industry. Recently, it is found that cutinase has potential use in cotton bio-scouring and synthetic fibers modification. Cutinase is the most important enzyme in clean production of textile industry. Keywords: cutinase, cutin, cotton bio-scouring 角质酶是一种可以降解角质并产生大量脂肪酸 单体的水解酶, 是α/β 水解酶家族中分子量较小的 成员[1-2]。角质酶来源很广, 存在于植物花粉和多种 微生物中[3]。角质酶最初由植物致病菌中分离得到, 并被证实是致病菌感染植物的重要工具 [4-6]; 之后 , 花粉中角质酶的存在被认为和花粉穿越包围柱头的 角质层进行授粉有关[7-8]。目前为止, 已有大量角质 酶得到鉴定。 1830 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech December 25, 2009 Vol.25 No.12 Journals.im.ac.cn 在棉织物染整加工中, 为了使棉纤维获得优良 的润湿性, 需要在前处理过程中去除具有疏水性的 棉纤维表皮层—角质层。角质酶具有类似于脂肪酶 的催化活性, 但脂肪酶必须在油水界面上才有催化 活性, 而角质酶不需要。此外, 角质酶对以聚合形式 存在的底物具有较高的酶活性, 特别适合棉纤维角 质层的降解。近几年还发现, 角质酶可用于化纤面 料的表面修饰。因此将角质酶应用于纺织工业清洁 生产技术是未来发展方向。 1 角质酶的来源和性质研究 1.1 角质酶的来源 按照来源, 角质酶可分为真菌角质酶、细菌角质 酶和花粉角质酶, 其中研究最为广泛的是真菌角质 酶。真菌角质酶主要来源于 Fusarium[4,9]、Monilinia[10]、 Botrytis[11]、Aspergillus[12-13]等属。细菌角质酶主要来 源于 Streptomyces[14]、Pseudomonas[15]、Thermobifida[16] 等属。其中研究较多的是镰胞菌 Fusarium solani pisi 角质酶。 1.2 角质酶的性质研究 通过亲和色谱和离子交换色谱等各种分离纯化 手段, 大量角质酶得到了分离纯化, 并且其生化性 质也得到了具体的研究[17]。 角质酶的分子量普遍较小, 真菌角质酶的分子 量一般为 22~26 kD。但是灰霉菌 Botrytis cinerea角 质酶和炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides角质酶 的分子量偏大, 分别为 40.8 kD[11]和 40 kD[18]; 而 Monilinia fructicola 中的 2 个角质酶的分子量偏小, 分别为 18.2 kD和 20.8 kD。细菌角质酶的分子量较 真菌角质酶略大, 其中假单胞 Pseudomonas putida 和放线菌 T. fusca 角质酶的分子量均为 30 kD。 真菌角质酶的最适温度较低 , 为 30°C~40°C, 细菌角质酶的最适温度高于真菌角质酶 , 为 40°C~60°C。角质酶的最适 pH偏碱性, 通常为 8~10, 在 pH 低于 7 时酶活性急剧下降; 但苹果黑星菌 Venturia inaequalis 角质酶的最适 pH 偏酸性 , 为 5~6[19]。 大多数角质酶可水解各种可溶性酯、不溶性甘 油三酯、天然聚酯角质、合成聚酯聚对苯二甲酸乙 二酯(PET)、聚丙烯腈(PAN)、尼龙 6.6 等[20-21]。对 于大多数细菌和真菌角质酶, 水解对硝基苯酯类底 物时符合米氏方程, 并且随着底物链长的增加, Km 值增加。 1.3 角质酶的结构研究 在 众 多 真 菌 角 质 酶 中 , Colletotrichum gloeosporioides 角质酶的三级结构(3dcn)和 E600 抑 制剂复合体结构(3dd5)已通过 X-衍射得到解 析[22]; F. solani pisi角质酶的三级结构(1cex) [23]、突 变体结构以及抑制剂结合体的晶体结构也已得到全 面解析[3, 24-31]。 角质酶的三级结构同源性很高, F. solani pisi角 质酶是由 197个氨基酸构成的紧凑型单结构域分子, 属于α/β水解酶(图 1)。结构中心由 5 个平行的 β 折 叠组成, 两边各由 2~3 个α螺旋包围, 催化三角由 S120-H188-D175构成[32], 活性中心位于整个结构的 顶端 , 并暴露于溶剂中 , 没有盖子结构遮挡 , 因此 没有界面活化现象[33-34]; F. solani pisi角质酶有两对 二硫键。F. solani pisi角质酶和共价抑制剂 n-二乙基 对硝基苯磷酸酯 (E600)复合体的三级结构显示 , Q121和 S42形成氧洞结构用以稳定中间过渡态的构 象, 其中 S42 通过侧链稳定氧洞构象; 环状结构(氨 基酸 80~87、180~188)中含有大量的疏水氨基酸 (L81、G82、 A85、 L86、P87、L182、I183和 V184), 因此是底物结合位点的重要组成部分[26,30], 角质酶 和底物的结合不需要主链构象的变化, 而依靠亲脂 性侧链氨基酸(L81、L182)的重新定位即能完成。 图 1 F. solani pisi 角质酶的三级结构图 Fig. 1 Structure of F. solani pisi cutinase. 李江华等: 角质酶的研究进展 1831 Journals.im.ac.cn 2 角质酶的制备及分子改造研究 2.1 角质酶的基因及克隆表达 目前大量真菌角质酶的基因已得到鉴定, 通过 序列比对发现, 真菌角质酶基因同源性较高, 基因 中都存在 GXSXG 保守序列(通常为 GYSQG)[35-36], 催化三角由 S-H-D组成(图 2)。并且通过序列发 现, 真菌角质酶至少含有一个蛋白激酶磷酸化位点, 通常含有两对二硫键, 构成二硫键的 4 个半胱氨酸 位于 N端和催化三角 S-H-D附近。酪氨酸、苯丙氨 酸和色氨酸在 C 端保守, 这些氨基酸的存在和糖的 结合有关[ 37-38]。 F. solani Pisi角质酶的基因已在 Saccharomyces cerevisiae、Aspergillus awamari和 Pichia pastoris等 中成功表达[39-41]。 Trichoderma harzianum角质酶的基因也成功表 达于 Pichia pastoris中[42]。 2.2 角质酶的分子改造研究 Maarten等[29]对经典真菌角质酶 F. solani pisi角 质 酶 进 行 了 大 量 的 定 点 突 变 , 以 确 定 各 图 2 真菌角质酶序列比对 Fig. 2 Sequence alignment of fungal cutinase. The GXSXG motif is boxed, ▲ is the catalytic triad. 1832 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech December 25, 2009 Vol.25 No.12 Journals.im.ac.cn 个氨基酸残基对活性的影响(表 1)。研究表明, 角质 酶的活性不仅和催化三角 S120-H188-D175有关, 还 和氧洞结构、二硫键的形成和底物结合位点有关 , 对 S42 和氧洞周围氨基酸进行定点突变后, 酶活大 幅度的下降[29,43]; 二硫键的破坏也严重影响酶的构 象和活力[44]; 底物结合位点的改变极大影响酶催化 效率。 在对角质酶的重要氨基酸进行分析的基础上 , 研究者对 F. solani pisi 角质酶进行分子改造使其性 质得以改善。 在底物结合位点处(40~52 位氨基酸、73~91 位 氨基酸和 171~191 位氨基酸)进行改造, 将亲水性氨 基酸突变为疏水性氨基酸(T179Y、L189F), 以提高 对橄榄油等疏水性底物的催化活性; 底物结合位点 (178~186 位氨基酸)上的氨基酸残基主要和甘油三 酯 Sn-1 和 Sn-2 链发生反应, 核磁共振结果显示, Sn-1 和 Sn-2 链相对于 Sn-3链更柔韧, 更接近于结构 表面, 而角质酶表面疏水性的增加破坏了 Sn-1 和 Sn-2 链与酶的相互作用[45-47], 因此降低 178~186 位 氨基酸残基的疏水性可增加对短链底物的活力[25,27]; 抑制剂复合体的晶体结构显示, 甘油三酯 Sn-3 链位 于 A85 附近, 体积较大的芳香族氨基酸的存在增加 了酶和相邻碳链的作用 , 因此可容纳更多的碳原 子[48], 因此进行 A85F 突变使底物的链长特异性发 生改变, Sn-3 位 6 个碳原子的甘油三酯成为最适底 物, Sn-2和 Sn-1位的链长特异性没有发生改变。 同时研究发现, 对结构表面带电氨基酸进行改 造可增加角质酶在阴离子表面活性剂中的稳定性[49]; 通过在基因中引入糖基化位点可使角质酶在 Saccharomyces cerevisiae和Aspergillus awamori中更 好地表达[50-51]。 2.3 角质酶的生产 以 Saccharomyces cerevisiae为宿主菌生产重组 F. solani pisi角质酶, 结合膨胀床吸附系统进行提取 表 1 F. solan pisi 角质酶定点突变结果 Table 1 Site-directed mutagenesis result of F. solan pisi cutinase Mutation site Amino acid substitution Relative enzyme activity (%) Mutation site Amino acid substitution Relative enzyme activity (%) R 17 Asn, Glu 31, 34 L 114 Y 20 T 18 V 90 S 120 A 0 T 19 V 35 D134 S 37 I 24 S 4 T 144 C 54 G 26 A 32 L 151 R 29 A 29 S 64 R 156 E, L, K 79, 71, 115 A 33 S 74 N 161 D 63 Y 38 F 62 A 164 R 41 S 42 A 0 T 167 L 54 T 45 A, K 98, 74 K 168 L 83 T 50 V 25 N 172 K 45 S 54 E, K, W 34, 96, 89 T 173 K 119 W 69 Y 12 T 179 Y 131 R 78 N, L 34, 49 L 182 W 19 A 79 G 50 I 183 F 25 T 80 D 32 A 185 L 96 D 83 S 62 L 189 F 109 N 84 A, D, L 5,0,5 G 192 Q 44 A 85 F, W 136,109 A 195 S 38 R 88 A 39 R 196 E, L, K 45, 44, 38 S 92 R 50 A 199 C 0 R 96 N 57 E 201 K 54 M 98 C 35 I 204 K 66 L 99 K 78 R 208 A 64 D 111 N 39 李江华等: 角质酶的研究进展 1833 Journals.im.ac.cn 是目前角质酶生产中最为高产高效的方法 [52]。 Calado 等[52]研究表明通过葡萄糖和半乳糖补料分批 培养, 90 h 发酵结束酶活可达 200 U/mL, 经膨胀床 吸附提取回收率为 96%。但由于酵母培养成本高、生 长周期长的缺点, 至今未有 F. solani pisi角质酶工业 化生产的报道。 3 角质酶的应用研究 角质酶可水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和各 种聚酯, 除了水解反应外, 角质酶还能催化酸与醇 的酯化、一些脂肪酸盐与醇的转酯化反应, 因此角 质酶作为一种多功能酶, 具有诸多的应用领域。 目前研究较多的角质酶的应用领域主要是棉纤 维的生物精练。棉纤维在横截面上, 一般分为 3 层 (图 3): 1) 表皮层, 含有蜡质、角质、胶质与脂肪等 成分, 主要是一层薄膜, 厚度在 0.1 μm 左右, 紧紧 覆盖在纤维上; 2) 初生层, 为细胞的原始胞膜, 亦 称原始皮层, 它包裹着细胞核; 3) 次生层, 它占棉 纤维重量的绝大部分, 主要由纤维素构成[53]。其中 表皮层中的角质层是生长过程中表面油状物质硬化 形成的, 可保护棉花免受雨水侵蚀, 由于其具有极 强的疏水性导致未处理的棉纤维手感和染色性能较 差, 从而成为棉纤维精练加工过程中需要去除的主 要成分之一。 图 3 成熟棉纤维的结构示意图 Fig. 3 Schematic of mature cotton fiber. 角质酶具有脂肪酶的催化活性, 和脂肪酶不同 的是 , 角质酶催化的酯水解可以在均相体系中进 行。而且对于以聚合物形式存在的酯类化合物, 角 质酶的水解能力更强。因此将角质酶用于棉纤维生 物精练, 可以在低温的条件下去除棉纤维表面蜡质 和角质。而且研究还发现角质酶能加快棉纤维中果 胶的酶解速度 , 有助于果胶等杂质的进一步去除 , 从而达到精练目的[54]。 近年来研究表明, 角质酶还可用于聚对苯二甲 酸乙二酯(PET)、尼龙 6.6 和聚丙烯腈(PAN)等合成 纤维的表面改性 , 增加织物吸水性 , 改善手感 , 提 高织物品质[20-21]。上述两工艺目前均采用传统碱处 理工艺, 存在水耗、能耗大、排放废水碱性强、色 度深、COD值高以及对纤维损伤大等弊病。酶精练 工艺作为一种节能降耗、环境友好的纺织品清洁生 产技术, 已成为国内外染整行业发展的新趋势。 除了在纺织工业的应用外, 角质酶还在食品工 业[55]、农业[56]、洗涤剂工业[57]和生物催化[58-59]等领 域中具有广泛的用途。 4 国内研究现状 江南大学自 2001 年承担“863”项目“用于纺 织工业清洁生产的生物催化剂的研究”后, 对角质 酶产生菌的筛选、发酵条件优化、酶的分离纯化及 性质、工程菌的构建与表达、酶分子的改造和酶在 棉精练中应用等方面进行了较系统的研究。 4.1 角质酶产生菌的筛选及发酵条件的优化 从堆肥中以对硝基苯丁酸酯(角质酶的模式底 物)为筛选底物 , 筛选得到一株产角质酶的微生物 , 鉴定为嗜热单孢菌(T. fusca); 研究了嗜热单孢菌的生 理特性和生产角质酶的适宜培养条件, 确定了角质酶 高产菌发酵条件, 角质酶酶活达到 19.8 U/mL[60-64]。 4.2 天然酶的分离纯化和性质 通过 pNPB 水解酶活性 , 嗜热单孢菌(T. fusca)发酵上清液通过硫铵沉淀、疏水色谱、阴离子 交换色谱进行分离纯化, 得到电泳纯的天然角质酶, 对该酶制品进行以角质为底物的角质酶的测定结果 表明其具有角质水解能力; 嗜热单孢菌角质酶具有 较好的热稳定性和酸碱稳定性 , 最适反应温度为 60°C, 最适反应 pH 为 8, 符合纺织工业清洁生产用 角质酶所需特性[65]。 4.3 基因工程菌的构建与初步表达 因生物数据库中已有 T. fusca全基因组序列, 采 用蛋白质组学技术中的肽指纹图谱技术破译角质酶 编码基因。用胰酶水解电泳纯的天然酶条带, 质谱 1834 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech December 25, 2009 Vol.25 No.12 Journals.im.ac.cn 分析水解产物, 将得到的小肽分子量进行数据库查 询, 鉴定其组成的蛋白及编码基因。由于角质酶为 胞外酶, 进行了 N-末端 10个氨基酸测序, 确定了蛋 白质一级结构中的信号肽和成熟酶序列。将编码角 质酶的基因克隆到载体 pMD18-T 中, 基因测序; 选 择具有 pelB信号肽和 6×组氨酸标签(His-tag)的大肠 杆菌分泌型表达载体 pET20b(+)作为表达载体, 将 角质酶基因亚克隆到该载体 , 并表达于大肠杆菌 BL21(DE3)中。对工程菌的摇瓶发酵过程研究发现, 在发酵初期角质酶大量积累于胞内, 随着发酵时间 的增加, 角质酶被最终分泌到胞外。初步试验表明 工程菌的产酶量至少是 T. fusca产酶量的 10倍[65-66]。 4.4 角质酶在棉精练中的应用 应用角质酶和果胶酶复配进行棉精练试验表明, 该酶使织物的润湿性和白度均有所改善, 且酶对棉 表面角质层和初生胞壁中角质、蜡质具有相对温和 的“选择性刻蚀”作用, 而碱精练对纤维表面杂质具 有一种“无明显选择性剥皮”作用(图 4), 严重影响纤 维强度。和未煮练棉布相比, 角质酶处理后的棉布 吸水性能提高了 60%, 角质酶和果胶酶协同作用棉 布吸水性能提高了 74%, 与碱煮练效果相似。角质 酶煮练可以提高棉纤维着色效果, 并且棉布手感柔 软。酶煮练后废液 pH较低, 对环境不会造成严重污 染[67-70]。 角质酶处理能够去除棉籽壳中的大部分脂肪类 物质、部分果胶质和纤维素等物质。在降解棉籽壳 时, 角质酶与碱性木聚糖酶和碱性果胶酶具有协同 作用, 经角质酶处理后棉籽壳吸附碱性木聚糖酶的 能力提高了 1.28倍。角质酶对棉籽壳的降解具有重 要作用[71]。 5 展望 节能减排是当前国家宏观经济调控的重点, 纺 织工业作为我国工业系统中重点污染源之一, 已成 为关注的焦点。利用生物酶的高度专一性、高效性 和处理条件的温和性, 开发高效、环保、安全和符 合生态纺织品生产要求的精练酶工艺取代传统碱工 艺, 已成为国内外染整行业发展的新趋势, 是纺织 工业完成国家“十一五”节能减排指标的关键环节 之一。角质酶是染整工业清洁生产精练工艺的关键 酶, 它们的研究开发可促进纺织精练工艺的节能、 降耗、减排, 进而推动染整工业全酶工艺的推广以 及生态纺织业的发展。但是目前角质酶还未能在纺 织工业中实际应用, 其主要原因有两点: 1) 现有角 质酶产生菌的产酶水平太低 , 酶的生产成本过高, 因此全球市场都未见有角质酶的商业化产品; 2) 棉纤 维含有多种杂质, 只靠一种酶是不能将其全部分解 的, 必须要多种酶配合起来。但不同的酶的共适条 件不同, 这样会影响酶的协同作用效果。 要解决以上问, 今后必须重点研究角质酶高 产菌的构建技术和发酵优化技术, 以大幅度提高产 酶水平, 从而降低其生产成本。同时还要研究角质 图 4 碱精练(A)和酶精练(B)扫描电镜图 Fig. 4 Scanning electron microscopy images of (A) alkali-scoured cotton and (B) bioscoured cotton. A B 李江华等: 角质酶的研究进展 1835 Journals.im.ac.cn 酶的分子改造技术, 使其更符合生物精练的多酶工 艺。研究各种酶在精练过程中的应用特性、作用机 理和动力学模型, 以最佳处理效果、更强稳定性为 目标, 进行复合酶和酶复配组分的探讨, 以不同规 模进行酶的应用研究, 例如在棉织物精练工艺研究 开发碱性果胶酶、角质酶、纤维素酶、半纤维素酶 等酶的复配技术构建棉织物的绿色生物精练工艺。 REFERENCES [1] Nardini M, Dijkstra BW. Alpha/beta hydrolase fold enzymes: the family keeps growing. Curr Opin Struct Biol, 1999, 9(6): 732−737. [2] Holmquist M. Alpha/Beta-hydrolase fold enzymes: structures, functions and mechanisms. Curr Protein Pept Sci, 2000, 1(2): 209−235. [3] Kolattukudy PE, Purdy RE, Maiti IB. Cutinases from fungi and pollen. Methods Enzymol, 1981, 71: 652−664. [4] Purdy RE, Kolattukudy PE. Hydrolysis of plant cuticle by plant pathogens. Properties of cutinase I, cutinase II, and a nonspecific esterase isolated from Fusarium solani pisi. Biochemistry, 1975, 14(13): 2832−2840. [5] Maiti IB, Kolattukudy PE. Prevention of fungal infection of plants by specific inhibition of cutinase. Science, 1979, 205(4405): 507−508. [6] Shaykh M, Soliday C, Kolattukudy PE. 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