null分子生物学技术在AML规范化诊断中的价值分子生物学技术在AML规范化诊断中的价值陈 苏 宁苏州大学附属第一医院
江苏省血液研究所null急性白血病的分型
AML的诊断技术及进展
AML的细胞和分子遗传学异常
AML的微小残留病检测null2011年美国发病率和死亡率最高的10种肿瘤类型CA Cancer J Clin 2011nullCA Cancer J Clin 20112011年美国血液肿瘤预期发病率和死亡率发病率:淋巴瘤(NHL>HL)>白血病(CLL>AML>ALL>CML)>MM
死亡率:白血病(AML>CLL>ALL>CML)>淋巴瘤(NHL>HL)>MMnull2007年美国各年龄和性别组报告死亡数
排名前五位的 肿瘤类型CA Cancer J Clin 2010中国白血病发病率中国白血病发病率白血病发病率:2.1-6.9/10万
AML(1.85/10万)
ALL (0.69/10万)
CML(0.36/10万)
CLL(0.05/10万)日本白血病发病率2001年全国白血病中心
AML(1.2-2.9/10万)
ALL (0.5-1.5/10万)
CML(0.3-1.1/10万)
CLL(0.1-0.8/10万)null1827年, 法国的Alfred Velpeau 描述第一例白血病
1847 年,Virchow首次提出了“白血病”这个名称
1976年,法、美、英3国7位血液学家以光镜下的形态为主,参照细胞化学染色,制定了FAB分型标准,标志着现代白血病诊断与分型的开端
80年代末至90年代初,随着免疫学、细胞遗传学和分子生物学理论和技术的发展,出现了MICM(形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学)分型
WHO造血和淋巴组织肿瘤分类
(2001, 2008)FAB分型及WHO分类nullFAB:主要建立在形态学基础上
WHO (2001和2008)
骨髓或外周血原始细胞比例≥20%
将一些有明确诊断及预后指导意义的细胞或分子遗传学异常作为诊断和分型的重要标志
将患者诊断之前的疾病状态和治疗措施纳入考量FAB和WHO分类方案的主要区别急性白血病的WHO分型急性白血病的WHO分型急性髓细胞白血病(AML)和相关肿瘤
系列不明的急性白血病( ALAL)
前体淋巴肿瘤
B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤
T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤急性髓细胞白血病(AML)和相关肿瘤 急性髓细胞白血病(AML)和相关肿瘤 伴再现性遗传学异常的AML
伴MDS相关改变的AML
继发于MDS或MDS/MPN
伴有MDS相关细胞遗传学异常
2或3系50%以上的细胞有发育异常
治疗相关性AML
不另作分类的AML
髓细胞肉瘤
Down’s综合征相关髓系增生疾病
母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤伴再现性遗传学异常的AML伴再现性遗传学异常的AMLAML with t(8;21)(q22;q22) RUNX1-RUNX1T1
AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16) CBFB-MYH11
APL with t(15;17)(q22;q12) PML-RARA
AML with t(9;11)(p22;q23) MLLT3-MLL
AML with t(6;9)(p23;q34) DEK-NUP214
AML with inv(3)(q21q26.2) or t(3;3) RPN1-EVI1
AML -M7 with t(1;22)(p13;q13) RBM15-MKL1
? AML with mutated NPM1
? AML with mutated CEBPA通常AML的诊断标准,原始细胞比例>20%,但如果t(8;21)、t(15;17)或inv(16)阳性,则不论原始细胞比例为多少,AML诊断成立null急性髓细胞白血病微分化型 (M0)
急性髓细胞白血病未成熟型 (M1)
急性髓细胞白血病成熟型 (M2)
急性粒单核细胞白血病(M4)
急性单核细胞白血病(M5)
急性红白血病 (M6)
急性巨核细胞白血病(M7)
急性嗜碱粒细胞白血病(ABL)
急性全髓增殖性疾病伴骨髓纤维化不另作分类的AML急性白血病的WHO分型急性白血病的WHO分型急性髓细胞白血病(AML)和相关肿瘤
系列不明的急性白血病( ALAL)
前体淋巴细胞肿瘤
B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤
T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤急性白血病的WHO分型急性白血病的WHO分型急性髓细胞白血病(AML)和相关肿瘤
系列不明的急性白血病( ALAL)
前体淋巴细胞肿瘤
B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤
T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤nullB淋巴母细胞白血病/淋巴瘤
无法分类的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤
伴有再现性遗传学异常的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤
t(9;22)(q34;q11) BCR/ABL
t(v;11q23)如t(4;11) 如MLL/AF4
t(12;21(p12;q32) TEL/AML1
t(1;19)(q23;p13) E2A/PBX1
t(5;14)(q31;q32) IL3-IGH
超二倍体核型
亚二倍体核型
T 淋巴母细胞白血病/淋巴瘤骨髓淋巴母细胞<20%且无髓外肿块,如伴有t(12;21)、 t(1;19)等 B淋巴母细胞白血病特征性的细胞遗传学异常,可诊断为B淋巴母细胞白血病null急性白血病的分型
AML的诊断技术及进展
AML的细胞和分子遗传学异常
AML的微小残留病检测急性白血病的诊断和分型依赖于
多种检测方法的联合使用急性白血病的诊断和分型依赖于
多种检测方法的联合使用形态学:外周血片、骨髓(涂片±活检)
细胞化学染色
免疫
型检测:多参数流式细胞仪
细胞遗传学检测
常规核型分析
FISH、CGH、SKY、染色体涂染
分子遗传学检测
融合基因检测(RT-PCR):PML-RARA、AML1-ETO、CBFB-MYH11、MLL-…、BCR-ABL……
基因突变:FLT3-ITD、CEBPA、NPM、TET2、IDH1、NOTCH1、IKZF1、FBXW7……
拷贝数变化(CNV):array-CGH、SNP-array
高通量测序技术……null1950196019701980199020002010确定染色体数目=46发现Ph;
发现+21各种显带技术出现;发现多数AL患者伴有染色体异常FISH出现;阐明某些染色体异常的分子学改变SKY
CGH
PCR技术
FLT3-ITD(1996)
c-KIT突变(1993)
…………..芯片技术:cDNA array
Array-CGH、SNP-array、
测序技术的发展
大量基因突变的发现:JAK2、NPM、CEBPA、PAX5、IKZF1、FLT3、RUNX1、WT1、RAS、NOTCH1…………..新一代高通量测序技术;各种遗传学改变间的相互作用白血病遗传学研究的历史nullG 带nullRP11-438N5G248P8432B2der(X)normal(11)WCP3WCP5FISHnullChromosomal CGHnull69-71,XXYY,+1,del(1)(p11),del(2)(p?),der(3)t(3;11)(p24;?),-4,-4,+6,
+der(7)t(7;10)ins(10;8)(q22;??),-8,-8, ins(10;8)(q22;??),-10,+11,
der(12)t(8;12)(?;p13)t(8;12)(?;?),der(14)t(3;14)(?;q21),-16,+17,+18,-19[cp5] SKYnullOligo array-CGH分辨率高,可发现<5kb的CNV
样本要求量小:0.5ug
费用更低
Agilent
NimbleGen
不能检测单亲二倍体(UPD)、LOH
不能检测平衡性染色体重排APL:STAT5B-RARAAPL:STAT5B-RARAT-ALL患者:UTX 缺失T-ALL患者:UTX 缺失nullSNP-array分辨率高,Affymetrix、Illumina
可检出CNV、单亲二倍体、LOH,可推算样本嵌合度del(11)(p13p13):33.86Mb-36Mb →Removal of NRE → LMO2 activationtelcene1e3-4e2e5e6LMO2NREproximal promoterdistal promoterbreakpoint测序技术的快速发展带来价格的下降测序技术的快速发展带来价格的下降19902001200720102012摩尔定律13年,30亿美元已经进入数千美元测一个全基因组的时代
<2 weeks0.0010.010. 11. 010. 0100. 01000. 010,000. 0100,000. 0null第二代测序技术平台单分子实时测序:第三代测序技术null国际肿瘤基因组协作组:2008年成立
11个国家,20个肿瘤类型,500个肿瘤样本
预计2010年底可完成数百个肿瘤样本的全基因组测序Nature. 2010;April 15. nullDLBCL
MYD88: 39% ABC-DLBCL
Nature:(10 Feb. 2011)
BCL2: 33.5% 主要见于GCB-DLBCL
ASH 2010
B-ALL:CREBBP, NCOR1, ERG, SPI1, TCF4,TCF7L2…
Nature:(10 March 2011)
MM:BRAF, NFKB通路的11个成员…
Nature:(16 March 2011)
CLL:NOTCH1, MYD88…
Nature:(5 Jun 2011)
JEM:(13 Jun 2011)
HCL:BRAF V600E, 48/48
NEJM: (Jun 16 2011)null急性白血病的分型
AML的诊断技术及进展
AML的细胞和分子遗传学异常
AML的微小残留病检测null约55%的AML患者可检出克隆性染色体异常
分子遗传学技术的进展使得多数AML患者检出基因水平的异常,如Flt3、CEBPα及NPM1基因的突变
遗传学异常对于理解AML发病机制、建立新的诊断方法、研发治疗药物或指导临床治疗有重要的价值
在WHO分型建议中,一些特殊的遗传学异常被列为诊断和分型的依据nullAML常见的染色体异常
AML常见的基因突变
AML常见的基因表达异常nullAML常见染色体异常单一异常:45%
≥2种异常:55%-5/5q-;-7/7q-;+8;
-Y;+11;+13;+21; +223q26; del(9q)
t(6;9); t(9;22)等nullAML常见核型异常42.4%18.8%14.4%5.8%5.6%5.4%2.9%江苏省血液研究所AML患者核型异常的分布nullt(8;21)(q22;q22)见于约10%AML,形成8号染色体上的AML1-ETO 融合基因
CR率高,EFS长,预后相对较好
20%-30%伴c-KIT突变,复发率增高,预后较差
≥75%伴性染色体丢失及del(9q)等附加异常,伴性染色体丢失不影响预后,伴del(9q)提示预后不良AML-M2 t(8;21)(q22;q22),9q-,-Yt(8;21)(q22;q22)模式图nullinv(16)(p13;q22)/t(16;16)(p13;q22)见于约5%AML、20%AML-M4及100%AML-M4Eo
遗传学特点:
因16号染色体较小及带型的限制,常规核型分析容易漏诊
有典型形态学改变及常见继发性异常的患者必须行FISH或PCR检测CBFβ/MYH11融合基因
常伴继发性异常:+8,+21,+22
约30%患者亦存在KIT突变,复发率增高、预后欠佳
化疗敏感,预后相对好,易发生CNSLAML-M4Eo 骨髓象AML-M4Eo 骨髓象AML-M4Eo +8,inv(16)FISH检测inv(16)inv(16)模式图nullt(15;17)(q22;q12)见于8-10%AML
对全反式维甲酸敏感,生存期长
分子生物学特征:
易位形成PML/RARα融合基因,是APL特异性的分子生物学标志
PML/RARα对APL诊断具有高度特异性,也是治疗的分子基础 AML-M3 +8, t(15;17)AML-M3 +8, t(15;17) AML-M3 t(11;17)null涉及MLL基因的染色体异常流行病学:见于约5%AML,与单核细胞白血病有特别的联系
遗传学特点:
11q23上受累的基因是MLL,易位的伙伴基因不固定
目前报道的涉及MLL的染色体易位有104种,已经明确的MLL伙伴基因有64种
除t(9;11)外的累及MLL的易位预后多不佳null涉及MLL易位的染色体断裂点的分布nullt(6;9)(p23;q34)/DEK-NUP214约占AML的 0.7-1.8%
M2、M4多见,多有MDS病史
形成DEK-CAN融合基因
69%的儿童患者和78%的成人患者可检出FLT3-ITD
预后不良null累及3q26的染色体异常见于APL以外的各种AML亚型, 占AML的1-2%
多种变异型
t(3;3)(q21;q26):RPN1-EVI1
t(3;7)(q21;q26)
inv(3)(q21q26):RPN1-EVI1
重排导致3q26的EVI1基因表达异常上调
缓解率低、复发率高,预后较差
可检测到由EVI1与位于其上游约2kb处的MDS1基因形成的融合性剪接异构体(EVI1-MDS1)的表达nullt(1;22)(p13;q13)/RBM15-MKL1仅见于AML-M7亚型, 未见于唐氏综合征相关AML-M7患者
多为婴儿,中位年龄4个月
完全缓解率50%
中位生存期8个月
重排形成RBM15-MKL1融合基因
缓解率低、复发率高,预后较差G带(上图)
R带(下图)null其他少见的染色体易位t(9;22)(q34;q11):0.5-1%的AML
累及MOZ的染色体易位
t(8;16)(p11;p13) :MOZ-CBP融合基因,多见于M4和M5亚型,骨髓易见吞噬红细胞现象,预后不佳
inv(8)(p11q13):MOZ-TIF2融合基因
t(8;22)(p11;q13):MOZ-p300融合基因
t(3;5)(q25;q35):NPM1-MLF1融合基因,多见于由MDS转化AML,活检易见多系病态造血,预后不良
t(16 ;21)(p11;q22): FUS-ERG融合基因,多见于M4\M5,易见吞噬红细胞和血小板,预后不良
累及11p15.5NUP98基因的染色体易位:已达25种nullAML常见的染色体异常
AML常见的基因突变
AML常见的基因表达异常nullFLT3-ITD流行病学:
占正常核型-AML患者的28-34%
伴t(15;17)、t(6;9)的AML患者突变率高,而伴t(8;21)、inv(16)和11q23异常的患者中少见
预后意义:
正常核型-AML患者检测到FLT3-ITD提示患者复发率高、生存期短
其不良预后与伴FLT3-ITD的等位基因的数量呈正相关
作为MRD标志的价值有限nullFLT3-TKD流行病学:
占正常核型-AML患者的11-14%
约2.8%的ALL患者也可检测到
预后意义:不明确
分子生物学特点:
最常见的突变类型为累及FLT3第20号外显子第835及836个密码子的错义突变、小片段插入或缺失突变
突变使位于TKD羧基端的A-loop持续活化,进而抑制AML细胞的凋亡
部分AML患者可同时存在FLT3-ITD和FLT3-TKDnullc-KIT 基因突变流行病学:占CN-AML的5-8%,25%CBF相关AML
突变多发生于受体胞外区的8号或17外显子的第816密码子
预后意义:伴KIT突变尤其是第17号外显子D816突变的t(8;21)阳性AML患者的总复发率(CIR)相对高,且EFS、RFS及OS相对较短 nullNPM1 基因突变广泛表达的磷蛋白质,NPM1可与ALK、RARα和MLF-1等形成融合基因,参与白血病或淋巴瘤的发病
流行病学:
25-35%的AML患者
45-62%正常核型AML患者、10-15%核型异常AML患者
预后意义:化疗CR率高,预后良好
分子生物学特点:
突变位点在12号外显子,突变导致NPM1蛋白异常定位于胞浆
40%伴NPM1突变的AML患者可同时检测到FLT3-ITD
NPM1mut/FLT3-ITDneg 预后良好nullCEBPA 基因突变流行病学:可见于5-8%的AML,多见于正常核型患者
分子生物学特点:
羧基端亮氨酸拉链区突变
氨基端无义突变
Green等报道7%(107/1427)的年轻AML患者可检出CEBPA突变,其中45%为单次突变,55%为双次突变,双次突变患者8年生存率优于单次突变或未突变者(54% vs. 31% vs. 34%)
只有CEBPA双次突变才有预后意义J Clin Oncol. 2010 Jun 1;28(16):2739-47. nullCEBPA突变的预后意义nullTET2 基因突变TET2位于4q24,有抑癌基因功能,是AML患者突变率较高的基因之一(约20%)
TET2基因突变也可见于MPN(10%)、CMML(30-50%)、MDS(20%)
TET2基因突变的预后意义尚不明确,早期的报道认为预后良好,但近来有多项研究发现对总生存无影响
TET1基因编码α-酮戊二酸依赖的双加氧酶,将5-甲基胞嘧啶转化为5-羟甲基胞嘧啶,参与甲基化调控
TET2基因与TET1基因有很高的同源性,提示也可能有相同酶活性nullDNMT3A基因突变哺乳动物中,包括4种DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B),
DNMT3A基因位于2p23.3,是重要的从头甲基化酶,也是DNA甲基化的重要参与者
22%的原发性AML可检出DNMT3A基因突变,是预后不良的标志
8%的MDS患者可检出DNMT3A基因突变,有突变的患者总生存率下降、转 AML风险增高Ley TL, et al. NEJM 2010
Walter MJ, et al. Leukemia 2011nullRUNX1基因突变RUNX1基因位于21q22,是转录因子核心结合因子家族成员,在t(8;21)(q22;q22)-AML中,可与位于8q22的RUNX1T1基因形成RUNX1-RUNX1T1融合基因
RUNX1基因的点突变可见于AML、MDS、CMML,原发性MDS患者的RUNX1基因突变率约为7-15%,继发性MDS的突变率更高
RUNX1基因突变是预后不良的标志nullAML患者常见基因突变和异常表达的预后意义nullDohner, H. et al. Blood 2010;115:453-474485例正常核型年轻AML患者NPM1、CEBPA、MLL、FLT3 (ITD 或TKD)、NRAS和WT1基因突变的检测结果nullAML常见的染色体异常
AML常见的基因突变
AML常见的基因表达异常null异常表达的AML相关基因及其预后意义nullWT1基因高表达WT1基因位于11p13
6.8%的AML患者伴有WT1基因突变
约75%AML患者可检测到WT1高水平表达
缓解率低、预后差
作为泛白血病标志用于缺乏遗传学标志的AMLMRD的监测null AML染色体异常的预后分级null 分子遗传学异常的预后意义白血病的发生需要两类突变协同白血病的发生需要两类突变协同白血病造血祖细胞增殖
不受控制CML样疾病造血祖细胞
分化障碍MDS样疾病Ⅰ类突变Ⅱ类突变 信号转导通路的基因突变如
BCR/ABL、 TEL-PDGFRB、
N-RAS、k-RAS、FLT3-ITD、FLT3-TKD、PTPN11、JAK2等转录因子突变如AML1-ETO、CBFβ-MYH11、PML/RARa、MLL基因重排、CEBPA、NPM1等null急性白血病的分型
AML的诊断技术及进展
AML的细胞和分子遗传学异常
AML的微小残留病检测nullMRD是指在白血病患者完全缓解后,体内残存少量白血病细胞的状态,检测方法包括荧光原位杂交、PCR、流式细胞术
MRD检测对于评估疾病状态、判断疗效、预测复发、早期干预具有重要临床意义
多参数流式细胞仪和荧光定量PCR技术的发展显著提高了MRD检测的敏感性和准确性null常用MRD检测技术及其敏感性 nullFCM技术白血病细胞可出现异常的免疫表型以及细胞散射光特征的改变
FCM检测MRD的原理是对散射光异常或“白血病相关”表型进行检测,可同时定量测定多个参数变化
FCM检测MRD的敏感性约在10-3~10-4
适用范围广、操作快捷
尚未发现真正意义上的白血病细胞特异性抗原null实时定量RT-PCR在PCR中引入了荧光标记分子,通过监测荧光信号的积累来观察整个循环过程,计算PCR产物量
不需要PCR后期处理步骤,重复性好,准确可靠
保持经典PCR灵敏、快速的特点,克服了传统PCR技术不能准确定量和假阳性污染的缺点nullMRD的概念及其检测技术
AML患者的MRD检测标志
AML患者MRD检测的临床意义null一、免疫标志
二、染色体易位和融合基因
三、基因突变
四、异常表达的AML相关基因AML患者的MRD检测标志null正常造血细胞在其分化不同阶段的抗原表达受一系列基因严密控制,在一定分化阶段哪些抗原表达及抗原表达量的多少存在着明显的规律性
AML细胞可出现白血病相关异常免疫表型(LAIP)
非同步抗原同时表达
交叉抗原同时表达
抗原表达量异常
细胞表面与胞浆内抗原同时表达
光散射信号改变等nullFCM检测LAIP作为MRD标志适用于75-85%的AML和95%的ALL患者
一些AML患者的LAIP可见于所有白血病细胞,部分AML的LAIP可仅见于部分白血病细胞
大多数情况下初诊时的LAIP,复发时仍可检出
FCM检测MRD的敏感性约在10-3~10-4,低于RQ-PCR 1 log,但>5色的MFC可部分弥补这一缺陷
LAIP在疾病发展过程中可发生转化,导致假阴性,应用多种抗体组合可减少假阴性null一、免疫标志
二、染色体易位和融合基因
三、基因突变
四、异常表达的AML相关基因AML患者的MRD检测标志nullAML常见染色体异常单一异常:45%
≥2种异常:55%-5/5q-;-7/7q-;+8;
-Y;+11;+13;+21; +223q26; del(9q)
t(6;9); t(9;22)等伴再现性遗传学异常的AML伴再现性遗传学异常的AMLAML with t(8;21)(q22;q22) RUNX1-RUNX1T1
AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16) CBFB-MYH11
APL with t(15;17)(q22;q12) PML-RARA
AML with t(9;11)(p22;q23) MLLT3-MLL
AML with t(6;9)(p23;q34) DEK-NUP214
AML with inv(3)(q21q26.2) or t(3;3) RPN1-EVI1
AML -M7 with t(1;22)(p13;q13) RBM15-MKL1
? AML with mutated NPM1
? AML with mutated CEBPAnull一、免疫标志
二、染色体易位和融合基因
三、基因突变
四、异常表达的AML相关基因AML患者的MRD检测标志null发生率高
在病程中稳定存在
突变集中于热点部位
目前以NPM1基因A型突变最为常用基因突变在MRD检测中应用的要求nullPHF6基因突变类型nullAML患者常见基因突变及其预后意义nullNPM1基因突变类型null一、免疫标志
二、染色体易位和融合基因
三、基因突变
四、异常表达的AML相关基因AML患者的MRD检测标志null异常表达的AML相关基因及其预后意义nullMRD的概念及其检测技术
AML患者的MRD检测标志
AML患者MRD检测的临床意义null一、FCM检测LAIP
二、RQ-PCR检测遗传学标志AML患者MRD检测的临床意义null美国西雅图移植中心
99例CR1接受同胞相合或无关供体HSCT的AML患者
移植前采用10色MFC检测骨髓标本MRD水平
75例患者未检出MRD,24例患者检出不同程度MRD
<0.01%:2例
0.01%-0.1%:8例
>0.1%:14例
评估移植前MRD水平对预后的影响HSCT前MRD水平对AML患者预后的影响J Clin Oncol 2011; 29(11):1190-1197.null2年总生存率:移植前MRD阴性患者显著高于阳性患者(76.6% vs 30.2%)
2年复发率:移植前MRD阴性患者显著低于阳性患者(17.6% vs 64.9%)
移植前MRD水平有助于提示移植预后J Clin Oncol 2011; 29(11):1190-1197.null荷兰、英国多中心协作组,94例儿童AML患者
68%的患者可检出2个以上LAIP,26%的患者可检出1个LAIP,6%的患者无LAIPFCM检测LAIP在儿童AML患者中的应用Leukemia (2010) 24, 1599–1606null随着巩固治疗的进行,MRD的水平呈逐渐降低的趋势Leukemia (2010) 24, 1599–1606null诱导化疗后MRD水平可作为判断患者预后的独立因素,不同组别3年无病生存期或总生存期有显著差异Leukemia (2010) 24, 1599–1606null一、FCM检测LAIP
二、RQ-PCR检测遗传学标志null一项406例APL的动态RQ-PCR检测结果显示,MRD持续阳性或由阴性转为阳性为APL复发的指证
RQ-PCR检测PML-RARA基因的敏感性为10-3-10-5,分子复发患者PML-RARA基因的上升速度约为1 log/月
PB和BM的对照试验显示,BM检测的敏感性约为PB的1.5倍
每隔3个月进行BM的PML-RARA检测是理想的MRD检测策略,可提前发现复发迹象,并尽早砷剂治疗,防止血液学复发RQ-PCR检测PML-RARA融合基因J Clin Oncol 2009; 27:3650–3658.nullMRC AML-15方案对APL患者每隔3个月进行BM的PML-RARA检测,发现复发迹象后给予砷剂治疗,白血病复发率明显低于未常规进行MRD检测的AML 12方案组J Clin Oncol 2009; 27:3650–3658.nullRQ-PCR检测PML-RARA融合基因可早期提示APL复发J Clin Oncol 2009; 27:3650-3658.null动态RQ-PCR检测结果显示,AML1-ETO、CBFB-MYH11融合基因的表达水平与复发密切相关
经过巩固治疗后,在长期缓解的核心结合因子白血病患者中,常可检测到低水平的融合基因转录
以104个ABL1基因拷贝作为内参照, AML1-ETO融合基因低于10-12个拷贝预示患者可达长期缓解RQ-PCR检测AML1-ETO、CBFB-MYH11对早期发现AML复发的意义Blood 2010; 115:453-474null不同遗传学背景的AML细胞,其克隆增殖速度和分子水平复发的变化存在较大差异
Ommen HB等采用RQ-PCR技术对74例伴有分子标志(PML-RARA、AML1-ETO、CBFB-MYH11融合基因和NPM1突变)的复发AML患者进行MRD动态监测
CBFB-MYH11阳性克隆的倍增时间明显长于其他克隆AML分子水平复发的动态差异Blood 2010; 115:453-474nullOmmen, H. B. et al. Blood 2010;115:198-205RQ-PCR检测显示,AML1-ETO、CBFB-MYH11、PML-RARA、NPM突变等分子标志在血液学复发前可观察到逐渐升高的趋势, CBFB-MYH11白血病克隆的倍增时间(36天)长于AML1-ETO(14天)、PML-RARA(12天)、NPM突变(11天)null由于CBFB-MYH11相关白血病复发时白血病细胞增殖缓慢,有学者认为PB检测MRD足以提早发现复发迹象,并及时进行干预
近期的一项研究对53例AML1-ETO相关白血病患者进行了长期随访,结果显示巩固治疗期间及治疗完成后一年内,每3个月1次MRD检测足以早期鉴别出复发患者Blood 2010;115:198-205J Clin Oncol. 2010 Aug 10;28(23):3724-9.nullAML1-ETO、CBFB-MYH11、PML-RARA等特异性的融合基因是最理想的MRD检测标志
RQ-PCR技术是检测上述标志的理想手段nullWT1是常用于AML患者MRD检测的泛白血病标志
有关WT1是否是可行MRD标志仍存在不一致的结论
J Clin Oncol 2008; 26: 5429-35
J Clin Oncol 2008; 26: 4595-602
Blood 2009; 113: 4505-11
引起争议的部分原因是不同的引物设计方案
6.8%的AML存在WT1基因突变,且集中于3’端,若将探针设计于WT1基因3’端,可能导致假阴性结果WT1基因作为MRD标志的价值Current Opinion in Oncology 2010, 22:656–663nullCilloni等通过系统性的分析和评估,最终选定于WT1基因的5’端设计引物,并对正常外周血、骨髓和白血病患者样本中WT1的表达进行了大样本的研究
504例AML患者的RQ-PCR检测结果显示,由于PB和BM的WT1基因表达背景较高,因此WT1基因作为MRD标志的敏感性并不高
WT1基因更适合作为诱导化疗后早期评价的指标,作为长期微量MRD动态检测的准确性有限Current Opinion in Oncology 2010, 22:656–663nullJ Clin Oncol 2009; 27:5195–5201.标准DA(7+3)诱导化疗后WT1基因表达水平下降<2 log的AML患者复发率显著升高(p=0.004)nullRQ-PCR检测显示,PB和PBSC的WT1基因表达为50/10000 ABL拷贝,BM为250/10000 ABL拷贝,由于PB的WT1基因表达背景低于BM(P<0.001),可能更适合作为标本来源J Clin Oncol 2009; 27:5195–5201.null基因突变在AML患者MRD检测中
的意义尚待积累更多的临床数据nullFLT3-ITD可见于>25% 的AML患者,少数初诊时检出FLT3-ITD的患者复发时原有的FLT3-ITD可缺如,并出现新的FLT3突变
RAS和WT1基因突变与FLT3-ITD类似,也有不稳定的特点,部分患者复发时突变可丢失
CEBP-a突变也较为稳定,,可能成为MRD标志之一,但GC含量高,扩增困难nullNPM1基因突变在AML患者中检出率近30%,80%为A型突变,且多见于正常核型AML
NPM1基因突变是AML患者常见基因突变中最重要的MRD标志,敏感性可达10-5,疾病进展中也较稳定,提示其为白血病发生的早期事件
RQ-PCR检测NPM1突变可作为MRD的监测手段
采用RQ-PCR进行的动态监测显示,80%血液学复发患者在平均97天前检测到分子水平的复发
NPM1突变由阴性转为阳性
或NPM1突变阳性的患者拷贝数上升1个数量级Blood 2009, 114:2220-2231.nullBlood. 2011;117(9):2577-2584.nullAML的诊断、治疗趋势:依赖于实验室检测、分型越来越细、治疗趋向个体化
细胞和分子遗传学异常对于AML患者的发病机制研究、诊断、分型、风险分层、预后判断和MRD监测有重要意义
随着更多临床和实验室数据的积累,各种基因突变等分子遗传学异常也将在AML的诊断和临床治疗中发挥重要的作用结 语nullThanks for your attention!