中国医科大学
硕士学位论文
5-脂氧化酶与百草枯中毒肺损伤的相关性研究
姓名:马壮
申请学位级别:硕士
专业:急诊医学
指导教师:金抗
20090401
·中文论著摘要·
5一脂氧化酶与百草枯中毒肺损伤的相关性研究
目 的
百草枯(paraquat,PQ)1962作为除草剂上市后,在130多个国家广泛使用,
1966年首次报道百草枯中毒致死病例【l】。PQ中毒可引起多脏器损害,肺是其作用
的主要靶器官,表现为急性肺泡炎和迅速进展的肺间质纤维化,是PQ中毒死亡的
主要原因。因此百草枯中毒的治疗主要集中在减轻肺损伤。百草枯的中毒机制尚
未完全阐明,大量研究证实,以多形核中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophils,
PMN)为主的炎性细胞与多种细胞因子在其发病过程中起着重要作用,其中炎性细
胞因子网络失控已逐渐成为国内外研究者关注的焦点,而如何调控炎性细胞因子
的过度释放,使细胞因子网络恢复平衡状态也已成为研究热点。白三烯
(1eukotrienes,LTs)是重要的炎症介质。肺脏是花生四烯酸的主要合成场所,LTs是
经由5-@氧化酶(5.1ipoxygenase,5-LO)途径的主要花生四烯酸产物,它由肺泡
巨噬细胞和中性粒细胞合成释放。LTs通过刺激骨髓多功能造血干细胞以及这些细
胞在血液中的游走而影响白细胞。白三烯还能增加粘附分子的表达(故而增强白
细胞对微血管的粘附能力),促进细胞运动,使其向靶器官组织游移。一旦白细胞
到达炎症组织局部,白三烯可增强其生存力和活性。白三烯主要介导中性粒细胞、
单核巨噬细胞、肥大细胞的募集【2】。白三烯在肺脏炎症反应中对白细胞的趋化作
用,可能激发肺脏炎症反应的瀑布效应【3】。在Baud等的研究中5-LO的下游产物LT
对纤维细胞的迁移,增殖以及基质蛋白的增生有直接的作用【4】。外源性给予LTD4
可以引起鼠类及人类的纤维细胞增殖并且这种增殖呈剂量依赖性【5】。研究表明,
LTs作为一种重要的前炎症介质,在许多炎性疾病发病机制中的重要作用已被逐渐
认识,但其在PQ中毒发病过程中的作用尚不清楚。本研究的目的旨在从炎性细胞
的角度探讨5-@氧化酶与PQ中毒肺损伤的相关性。
与
1、动物分组
健康雌性Wistar大自鼠40只,完全随机分成对照组和染毒组,染毒组以百
草枯50mg/kg体重灌胃染毒,对照组给以等量的生理盐水。分别于1d,3d,7d,
14d处死lO只,进行支气管肺泡灌洗液的收集及细胞测定,应用RT-PCR反应、
免疫组织化学方法,观察5一L0在mRNA和蛋白水平的变化。
2、支气管肺泡灌洗液的测定
采用在体全肺灌洗法收集支气管肺泡灌洗液,共收集到支气管肺泡灌洗液约
5ml。1500rpm,4℃,离一险lOmin,将离心沉淀的细胞团用0.3ml生理盐水悬
浮,制成细胞悬液。用全自动血细胞计数仪(AC900型)测定支气管肺泡灌洗液白
细胞总数【6】。
3、RNA提取及RT—PCR
用TRIZOL提取总RNA,反转录成cDNA.5-LO基因上游引物
5’.CTCCCAGTGACCACAGAA.3’,下游引物5’.ATACCGAACACCTCAGACA
一3’,扩增片段长496bp,B—actin作为内对照(扩增片段247bp)。循环条件:95
℃,变性5min,94℃30s一54℃lmin-72℃30s,35个循环,72℃延伸5min。15%琼脂
糖凝胶电泳检测。
4、免疫组织化学
肺组织石蜡切片免疫组织化学方法检测5-LO蛋白表达,用链霉菌抗生物素蛋
白一过氧化酶染色法,按试剂盒说明书操作。
结果
1、病理变化
HE染色切片观察,染毒后ld肺泡结构清晰可见,肺泡腔内可见少量炎性细
胞的渗出;染毒后3d肺泡结构可辨认,肺泡腔内可见大量炎性细胞的渗出;染毒
后7d肺泡结构尚可辨认,肺泡腔内充满炎性细胞的渗出,同时肺泡腔内渗出液开
始机化;染毒后14d肺泡结构不清晰,肺泡腔内充满炎性细胞的渗出,但较前有
2
所减少,可见纤维化样改变。
2、BALF中WBC总数的变化
染毒组大鼠BALF中WBC总数比对照组均有统计学意义俨
工程有限公司)
(5) 琼脂糖(Takara公司)
lO
(6) 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺(MERCK公司)
(7)PCR引物(上海生工生物工程有限公司)
(8) RT-PCR反应试剂盒(Takara公司)
(9) SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天生物技术研究所)
(10)5一Lo多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)
(11)其它常用试剂:1MTris.HCL,1.5MTris.HCL,PH8.0,TE缓冲液,Tris-
甘氨酸电泳缓冲液(参照分子克隆实验指南配制)
二、实验方法
健康雌性Wistar大白鼠40只,体重(180_+20)g。完全随机分成对照组和
染毒组,染毒组以百草枯50mg/kg体重灌胃染毒,对照组给以等量的生理盐水。
分别于ld,3d,7d,14d处死10只,进行支气管肺泡灌洗液的收集及细胞测定,
应用RT-PCR反应、免疫组织化学方法,观察5一Lo在mRNA和蛋白水平的变化。
1、支气管肺泡灌洗液的收集及细胞测定
采用在体全肺肺灌洗法收集支气管肺泡灌洗液,将7号塑料输液管的针头端
剪掉,留出约3cm长的一段输液管,将该段输液管的一端套在5ml注射器上,暴
露气管,在气管上剪一小切口,将输液管插入气管腔内,并用止血钳固定。将2ml、
37℃无菌生理盐水缓慢注入肺内,间隔30s后,将其抽回,如此进行3次,共收
集到支气管肺泡灌洗液约5ml。1500rpm,4℃,离,5,10min,将离心沉淀的细胞团
用0.3ml生理盐水悬浮,制成细胞悬液。用全自动血细胞计数仪(AC900型)测定
支气管肺泡灌洗液白细胞总到61。
2、RNA提取及RT—PCR
2.1、肺组织总RNA提取
取肺组织,用高压灭菌后的锡箔纸包裹后于液氮中冻lOmin,击碎后移入2ml
无菌Eppendorf管中。加入lmlTRIZOL试剂,组织匀浆后室温静止5min。加0.2ml
氯仿涡旋振荡15s,室温放置2--一一3min。4。C、12000rpm离心20min,将上清移
入另一新管,加入0.5ml异丙醇混匀,室温放置lOmin。4"C、12000rpm离心
lOmin,弃上清,留置RNA沉淀,加75%乙醇(DEPC水配制)lml,涡旋漂洗一次,
4"C、7500rpm离心5min。弃上清,RNA沉淀放置室温,空气干燥15min。最后
RNA沉淀溶于相等量的0.01%Depc-treatedwater,取少量RNA用于含量及纯度
测定,其余分装后置-80"C保存备用。
2.2、RT—PCR
(1)eDNA第一链合成
用反转录试剂盒将总RNA逆转录成eDNA第一链,反应体积20pl,反应体
系如下:
MgCl:(25ⅡlM)4.0Il1
10XBuffer 2.0U1
dNTP(10mM) 2.0pl
RNasinRibonucleaseinhibitor(1u/la1) O.5ll1
hMVReverseTranscriptase 0.6pl
Oligod(T)。5Primer 1.0pl
总RNA 1.Ou1
ddH:0 8.9Ul
总体积 20.0pl
99℃5min变性,42℃1h,一20℃保存。
(2)引物
用Primer5设计5-LO基因和夕-actin基因引物。引物由上海生物生工有限
公司合成(表4)。
表4,扩增魁馑因和夕-actinmRNA的引物序列
12
反应体系:
eDNA
10×Buffer
MgCl2(25mM)
dNTP(2mM)
目的基因上游引物(20州)
目的基因下游引物(20PIH)
∥-actin上游引物(20州)
夕-actin下游引物(20删)
7aq酶(5u/“1)
ddH:0
总体积 25.0Il1
反应条件:
94℃5min
l
94℃35s
/ \ 35cycles
52℃40s一72℃1min
l
72℃5min
l
4℃保存
(3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,用安莱图像分析仪扫描和Chemilmager5500
软件分析半定量。
3、免疫组织化学
3.1标本制备,术前大鼠腹腔注10%水合氯醛30mg/kg体重,待大鼠麻醉后
固定四肢,仰卧位固定于操作台上。打开胸腔,迅速取出肺组织,一半迅速放入4
%多聚甲醛中固定,常规制备石蜡切片,用于免疫组织化学和免疫荧光染色;一
l
1
l
1
l
l
1
1
1
l
U
p
U
p
U
j.
p
U
U
1
0
5
5
O
5
5
3
3
3
L
L
幺
L
乙
m
m
仉
仉
m
K
半于一800C保存备用。免疫组织化学方法检测5一L0蛋白表达,用链霉菌抗生物素
蛋白一过氧化酶染色法,按试剂盒说明书操作。
3.2石蜡切片二甲苯脱蜡2次,30min/次,继而应用100%、90%、70%乙醇依
次5min,PBS洗3次,5min/次,进行切片的水化。
3.3加过氧化物酶阻断液A灭活内源性过氧化物酶,室温下孵育10min,PBS
洗3次。
3.4抗原修复,切片放入柠檬酸盐缓冲液煮沸8min(小火),冷却后取出;PBS
洗3次,5min/次。
3.5加非免疫性动物血清封闭液B,室温下孵育10min,甩去血清。
3.6加第一抗体40C过夜,PBS洗3次。
3.7加生物素标记的二抗C,室温下孵育10min,PBS洗3次。
3.8加链亲和素.过氧化物酶溶液D,室温下孵育10min,PBS洗3次。
3.9加DAB显色,待显色后自来水冲洗,苏木素复染,脱水,中性树胶封固。
3.10免疫组化染色分析:以不加一抗的正常切片为阴性对照。
三、统计学分析
应用SPSSl3.0ForWindows软件处理数据。生化指标以均数±标准差(J±S)
表示,采用独立样本t检验(independent-samplest test)。相关性分析采用双变量
Pearson相关分析。P
措施 ,肺泡灌洗液中WBC的浓度
可以评价肺损伤的严重程度【191。在本研究中,染毒组大鼠BALF中WBC总数比对照
组均有统计学意义(P(O.01),WBC水平从1d开始增高,7d达高峰,14d较7d有所
减少。
3、5一LO在急性肺损伤中的作用机制
白三烯(1eukotrienes,LTs)是花生四烯酸通过5一脂氧合酶(5.LO)代谢途径产
生的代谢产物,LT是重要的炎症介质。花生四烯酸通过5一Lo直接进入LT途径。
5-LO催化二步反应产生不稳定的环氧化白三烯A4。此后,白三烯A4在水解酶作
用下生成白三烯B4或在白三烯C4合成酶作用下生成白三烯C4,白三烯C4和它的
细胞外代谢物白三烯D4及白三烯E4组成炎性介质合称半胱氨酰基白三烯,是重
要的致炎因子【20】【2l】。肺脏是花生四烯酸的主要合成场所,LT是经由5一Lo途径的
主要花生四烯酸产物,它由肺泡巨噬细胞和中性粒细胞释放【221。LT通过与其特异
性同源性受体结合,能促进炎症部位几乎所有白细胞的聚集,并能增强其功能。
白三烯通过刺激骨髓多功能造血干细胞以及这些细胞在血液中的游走而影响白细
胞。白三烯还能增加粘附分子的表达(故而增强白细胞对微血管的粘附能力),促
进细胞运动,使其向组织游移【23】。一旦白细胞到达炎症组织,白三烯可增强其生
存力和活性。白三烯主要介导中性粒细胞、单核巨噬细胞、肥大细胞的募集【2】。
白三烯在肺脏炎症反应中对白细胞的趋化作用,可能引发肺脏炎症反应的瀑布效
应【31。在Baud等的研究中5-LO的下游产物LT对纤维细胞的迁移,增殖以及基质
蛋白的增生有直接的作用【4】。外源性给予LTD4可以引起鼠类及人类的纤维细胞增
殖并且这种增殖呈剂量依赖性【5】。研究表明,LTs作为一种重要的前炎症介质,在
许多炎性疾病发病机制中的重要作用己被逐渐认识,但其在ALI发病过程中的作
用尚不清楚。在本研究中,染毒组大鼠5-LO表达比对照组均有统计学意义伴o.oo。
5-L0水平从1d开始增强,7d为表达达高峰,14d较7d有所减少,且蛋白和基因
水平变化趋势基本相一致。通过本实验研究,提示大鼠BALF中WBC总数与5一LO
免疫组化结果10D值之间存在显著的相关关系,推测5-L0在百草枯中毒急性肺损
伤及肺纤维化中可能有一定作用,但是具体机制还需要进一步的实验验证。
结论
研究表明大鼠BALF中WBC总数与病理学变化趋势基本上是一致的。5.LO
蛋白和基因水平的变化趋势基本上是一致的。大鼠BALF中WBC总数与5-LO免
疫组化结果IOD值之间存在显著的正相关关系(F0.981,P<0.001)。通过本实验研
究,提示5-LO可能通过影响肺组织中WBC含量的变化在百草枯引起的急性肺损
伤及肺纤维化中有一定作用。
24
本研究创新性的自我评价
5-)J旨氧化酶(5-LO)与百草枯(PQ)中毒肺损伤的相关性国内外尚未见报道,
本研究从蛋白水平和基因水平探索了5一L0与PQ中毒肺损伤的相关性,并探讨其机
制,为进一步研究5-LO在百草枯中毒肺损伤中的作用奠定了基础。
·参考文献·
1. ChanBS,LazzaroVA,Seale吧eta1.Therenalexcretorymechanismsandtheroleoforganic
cationsinmodulatingtherenalhandlingofparaquat[J].PharmacolTher,1998,79:193-203.
2.Peters-GoldenM,HendersonWRJr.Leukotrienes[J].NEnglJ Med,2007Nov
1;357(18):1841-54.
3. BowtonDL.LeukotrieneB4,acuterespiratorydistresssyndrome,andoutcomes[J].CritCare
Med2000;28(I):262-263.
4. BaudL.Modulationoffibroblastproliferationbysulfidopeptideleukotriencs:effectof
indomethacin[J].JoumalofImmunology138:1190-1195.
5. VannellaKM.Cysteinyllcukotrien嚣areautocrineandparacrineregulatorsoffibrocyte
function[J].JImmunol,2007Dec1;179(11):7883·90.
6. 赵洪文,吕长俊,李振华,等.支气管肺泡灌洗液细胞定量【J】.中国医科大学学
报,1994,23(1):23—25.
7. 黄韶清,周玉淑,刘仁树.现代急性中毒诊断治疗学【M】.北京:人民军医出版社,
2002:309.311.
8. ChenCM,LuaAC.1ungtoxicityofparaquatintherat【J】.journalofToxicologyEnviromental
HealthPartA2000,60(7):477-487.
9. 张秋金,沈洪,张维,等.纳洛酮与甲基泼尼松龙联用对急性肺损伤大鼠肺组织核转录因子
-r.B表达的影响[J】.中国危重病急救医学,2005,17(6):370-3721.
10. BernardGKArtigasA,BrighamKL,甜a1.TheAmerican-EuropeanconsensusconferenceOn
acuterespiratorydistresssyndrome:definifions,mechanisms,relevantoutcomes,andclinical
trialcoordination[J].AmJRespirCritCareMcd,1994,149(3):818-8241.
11.张文武.急诊内科学【M】.北京:人民卫生出版社,2002:11.
12.WongRC,StevensJB.Paraquattoxicityinvitro,Pulmonaryalveolarmacrophages[J].Jtoxicol
EnvironHealth,1985,15:417-429.
13.VenkatesanN.Pulmonaryprotectiveeffectsofcurcuminagainstparaquattoxicity[J].LifeSci,
2000,66(2):21-28.
14.RoccoallNegriEM,KurtzPM,eta1.Lungtissuemechanicsmodelinginacutelung
injury[J】.AmJRespirCritCareMed,2001,164:1067-1071.
15·Wallace·Pathogenesisofacutemicrovascularlunginjuryandtheacuterespiratorydi8懈s
syndrome[J].EurResp,2002,7:22-321.
16·DowneyGP,DongQ,KrugerJ,etaLRegulationofneutrophilactivationinacutelung
injury[J].Chest,1999,116:103-1101.
17·KazuhitoKawabata,TetsuyaHagio,ShigeruMatsumoto,etaLDelayednentrophilelastase
inhibitionpreventssubsequentprogressionofaeutolungmjuryinducaxibyendo幻lxin
inhalationinhamsters[J].AmJRespirCritCareMed,2000,161(6):2013-20181.
18· KanaokaY,BoyceJA.Cysteinylkmkotrienesandtheirr∞eptors:cellulardis幽60nand
functionininlmuneandinflammatoryresponses【J】.Immunol,2004,173(3):1503.1510.
19·CaironiP,IchinoseF,LiuR,etaL5-Lipoxygenasedeficiencypreventsrespiratoryfailureduring
ventilator-inducedlunginjury[J].AmJRespirCritCareMed2005;172(3):334-343.
20·UozumiN,KumeKNagaseT,etaLRoleofcytosolicphospholipaseA2inallergicresponse
andparturition[J].Naturel997;390:618.22.
21·HendersonWRJr,ChiEY,BollingerJC再eta/.ImportanceofgroupX-secretedphospholipase
A2inall嘤en血duccdairwayinflammationandremodelinginasthmamodel[J].ExpMed
2007;204:865-77.
22·Peters-GoldenM,BrockTG.5-LipoxygenaseandFLAP[J].ProstaglandinsLe舡kotEssentFatty
Acids2003;69:99.109.
23·TagerAM,LusterAD.BLTlandBLT2:theleukotrieneB4receptors[J].Prostaglandins础ot
EssentFattyAcids2003;69:123.34.
27
·综述·
急性百草枯中毒发病机制与临床治疗进展
百草枯(paraquat,PQ,1,l·二甲基-4,4-联吡啶二氯化物)于1882年
合成,1932年作为氧化还原反应指示剂使用,1955年发现其除草作用,1962作
为除草剂上市后,在130多个国家广泛使用,1966年首次报道百草枯中毒致死病
例【11。百草枯的中毒机制尚未完全阐明,现就近年来国内外对百草枯中毒的发病
机制和临床治疗进展做一综述。
1、PQ的理化性质【2】
PQ(paraquat,PQ,1,1-二甲基·4,4一联吡啶二氯化物)纯品为白色结
晶,常用商品以二氯化物的20%水剂,不挥发,易溶于水,酸性条件下稳定,约
在30"C能分解。肺是百草枯损伤的主要靶器官,亦是引起PQ急、慢性中毒和死
亡的主要原因。PQ通过能量依赖过程逐渐在肺内聚集,与血浆蛋白结合很少,
且不经代谢,大多以原型由肾脏排泄,少量通过胆汁排泄。
2、PQ中毒机制
2.1氧化损伤【3】
2.1.1超氧负离子如过氧化氢(H202)、羟自由基(oH一)。研究发现含
有高水平过氧化物歧化酶的细菌或其他生化系统(在体外肝和肾脏)可抵御PQ
中毒,因为过氧化物歧化酶可以消除超氧负离子毒性,因此可以证明超氧负离子
在PQ中毒中具有重要的作用。另外,暴露于高氧状态下,可以加重PQ中毒也进
一步证明分子氧在介导中毒方面的作用。
2.1.2细胞内NADPH氧化NADPH是细胞内使百草枯还原的主要还原剂,
NADPH的消耗导致依赖NADPH的生化过程中断。有证据表明服用百草枯降低大鼠肺
内NADPH含量,肺内戊糖旁路酶类迅速增高,提示NADPH需求升高。
2.1.3脂质过氧化反应使细胞多不饱和脂肪酸氧化变性。脂质过氧化物,
即多不饱和脂肪酸的氧化变性产物是PQ中毒的可能机制,有关研究显示中毒动物
体内脂质过氧化物明显升高;组织或细胞内谷胱甘肽含量较低时,更易PQ中毒,
因为还原型谷胱甘肽(GSH)可能在拮抗百草枯的氧化作用发挥重要作用。
2.2炎性细胞
已证实PQ肺损伤所致的炎性反应特征表现为肺内皮和上皮细胞膜受损,血
管通透性增加,膜脂质氧化物和多形核白细胞浸润(PMN),并随服毒量增大,
PMN浸润加型41。Roc圮,o等【51研究表明将30mg/l【g百草枯注入大鼠腹腔244'时后
出现严重急性肺损伤(ALI),间质水肿,肺泡内出血,分叶核白细胞和单核细胞
炎症,透明膜形成,肺内皮细胞和上皮细胞通透性增加;蛋白丰富的水肿液聚集
在间质和肺泡间隔,从而导致动脉缺氧,肺顺应性降低,呼吸功增加。近年来,
对ALI/ARDS的认识逐步发展致对炎症发生、调控的认识。大量研究证实,以多形
核中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophils,PMN)为主的炎性细胞与多种细胞因
子在其发病过程中起着重要作用,其中炎性