防腐挑战性实验方法(1)

防腐挑战性实验方法防腐挑战性实验规程一、目的本方法及摘自欧盟标准BP2002XVICEFFICAIYOFANTIMICROBIALPRESERVATION,测定化妆品抵抗微生物的能力。二、材料及工具1.待检样品600g（实际操作中常用300g以节约样品）；2.电子秤1台、不锈钢勺子、200ml烧杯、10ml试管、150ml三角烧瓶、酒精灯1盏、1ml移液枪（100～1000μL）、1ml移液枪枪尖、灭菌培养皿、0.85%灭菌生理盐水；3.适量普通营养琼脂培养基、虎红培养基；4.金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠艾希氏菌、黑曲霉、白色念珠霉菌的菌种各1支，其菌种传代次数<5代。三、步骤1.标准悬液的配制1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。2.细菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止；此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。3.霉菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。4.分别称取待测样品100g，倒入5个烧杯中，分别标记大、金、绿、黑、白及日期。5.分别在5个烧杯中，对应加入1ml浓度为1×107～1×108cfu/ml的细菌菌悬液及霉菌菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5±2.5℃的培养箱中培养，霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养。6.水溶性样品10g加入90ml无菌生理盐水，稀释后取1ml样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。7.油溶性样品取10g样品，加入10ml无菌吐温-80和10ml无菌白矿油，再加70ml无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；吸取1ml已稀释的样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。8.培养细菌放在32.5±2.5℃的培养箱中培养48h；霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养5天。9.分别在2天、7天、14天、28天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。10.菌落计数的标准方法①先选取平均菌落数在30～300之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选取平均菌落数在5～50之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；②有两个稀释度在30～300之间，求比值。若比值≤2，平均数；若比值>2，以其中较小的稀释度计算细菌总数；③所有稀释度都大于300，以稀释度最高的平均菌落数计算；④所有稀释度都小于30，以稀释度最低的平均菌落数计算；⑤所有稀释度均在30～300之外，其中一个大于300，而相邻的加一稀释度小于30，则以最接近30或300的平均菌落数计算；⑥若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；⑦若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则可将此平皿菌落计数后×2，以报告全皿菌落数。例1：不同稀释度平均菌落数两稀释度菌数之比报告方式10-410-510-6例：10-6×倍数/10-5×倍数cfu/ml或cfu/g1136516420—16400或1.6×10422760295461.638000或3.8×10432890271602.227100或2.7×1044不可计4650513—513000或5.1×105527115—270或2.7×1026不可计30512—30500或3.1×1047000——四、注意事项1.由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入培养皿后，应尽快倒入熔化并冷却至45℃左右培养基，立即摇匀；2.实验结束后，所有与菌接触之物品，必须在121℃灭菌45min后处理，人员用75%酒精消毒；3.如遇停电，应将培养箱中培养皿放入冰箱，待情况正常后再放入培养箱，如出现上述情况没有及时处理则重新实验。五、结果标准将活的细菌和活的霉菌计数后取lg，检验标准如下：菌种类型lg[“初始的菌落计数值”-“第x天的菌落计数值”]第14天2天、7天、14天、28天细菌≥3没有增加现象（NI）霉菌≥1没有增加现象（NI）注：①这里是以10为底的lg，而非以自然对数e=2.718为底的log；②lg(ab)=lg(a)lg(b)lg(a/b)=lg(a)-lg(b)  lg(a-b)≠lg(a)-lg(b)lg(ab)=b*lg(a)六、实例1.合格的实验记录2天7天14天28天结果大肠艾希氏菌2.82.94.25.8OK铜绿假单胞菌3.13.34.55.8OK金黄色葡萄球菌2.62.93.34.6OK白色假丝酵母2.02.33.55.1OK黑曲霉1.72.02.33.7OK2天7天14天28天结果大肠艾希氏菌3.25.95.95.9OK铜绿假单胞菌2.33.95.85.8OK金黄色葡萄球菌2.03.85.85.8OK白色假丝酵母1.32.75.35.3OK黑曲霉1.92.65.25.2OK2.不合格的实验记录2天7天14天28天结果大肠艾希氏菌3.33.64.54.5OK铜绿假单胞菌3.13.53.23.8不合格金黄色葡萄球菌3.13.53.93.3不合格白色假丝酵母2.02.83.85.1OK黑曲霉1.82.22.82.5不合格2天7天14天28天结果大肠艾希氏菌-0.8-0.9-2.7—不合格铜绿假单胞菌-0.6-0.7-3.1—不合格金黄色葡萄球菌-0.7-1.0-2.5—不合格白色假丝酵母-0.7-1.0-2.7—不合格黑曲霉-0.18-0.48-2.0—不合格七、实验需求设备、器具设备名称需求数量要求用途1冰箱1易清洁消毒存放菌种、标准悬液2电子秤1易清洁消毒样品重量测试3浊度仪1易清洁消毒检测细菌菌悬液之浓度4不锈钢桌3放置样品，规格待定5无菌操作台1易清洁消毒微生物实验用，要求等级10000级6风淋室1易清洁消毒人员除尘，保证无菌室之洁净度7生化培养箱3易清洁消毒细菌、霉菌培养各1台；保存琼脂为液体状态及紧急烘干器皿，需用1台8显微镜1易清洁消毒霉菌总数观测用9台灯1易清洁消毒光线不够时观察菌落总数用10空气过滤器1无菌室降温及换气用，要求等级10000级，配备无菌空气过滤网11移液枪2100~1000uL移取菌液用；备用12恒温水浴锅1易清洁消毒用于油性样品之充分溶解，规格待定13自动灭菌锅1自动物品灭菌用14牛角勺100称取样品用；备用15酒精灯2无菌操作台配套用；备用16200ml烧杯100盛装样品用；备用17500ml烧杯10盛装样品用；备用18150ml三角烧瓶10盛装样品用；备用1910ml试管100配备塞子盛装无菌生理盐水；备用20移液枪枪尖100移液枪配套用；备用21紫外灯管6空间灭菌；备用22培养皿200（套）细菌、霉菌总数测定用；备用23血细胞计数板2霉菌计数用；备用24革兰氏染色配套盒1革兰氏染色用25普通营养琼脂10瓶装自配培养基用；备用26虎红琼脂10瓶装自配培养基用；备用27氯化钠2分析纯自配生理盐水用；备用28硫酸1分析纯用于配置标准悬液29氯化钡1分析纯用于配置标准悬液30保鲜膜2保存样品用；备用注：此配置为常规性配置，其他缺少之器具可于后期购置。