水中总大肠菌群的测定

水中总大肠菌群的测定 微生物综合实验:水中细菌总数和大肠菌群的测定 一实验目的 1、学习水样的采取和水样细菌总数测定的方法。 2、了解水源水的平板菌落计数的。 3、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。 二、实验原理 水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。本实验应用平板计数 技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的差 别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此， 以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目 前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。我国1ml自来水中细菌总数不得超过 100个。 大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37?培养24~28h能发酵乳糖产酸与产气的 革兰氏阴性无芽孢杆菌，它们普遍存在于肠道中，且具有数量多，与多数肠道病原菌存 活期相近，易于培养和观察等特点。大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。 大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法两种。本实验采用多管发酵法，它被称为水 的标准分析法，即将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌 群的阳性管数后在检索表中查出大肠菌群的近似值。我国规定:每升自来水中大肠菌群 数不得超过3个。 三、实验材料和用具: 1、培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，乳糖蛋白胨培养基，三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基，伊红美兰培养基(EMB培养基)。 2、试剂:无菌水、结晶紫染液、卢氏碘液、95%乙醇、番红染色液。 3、器皿:灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，德汉氏小管，载玻片，无菌空瓶，移液管，接种环，酒精灯，注射器，显微镜等。 四、实验步骤 第一周(2008-11-11) 1、 制备无菌水:取4支试管，向每支试管中加入9ml自来水。 2、 配制:牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15~20g， 蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4) 乳糖蛋白胨培养基(蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖 5g，NaCl 5g，1(6%溴甲 酚紫乙醇溶液 1ml，蒸馏水 1000ml，pH 7.2~7.4) 三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基(将上述乳糖蛋白胨培养基浓缩3倍配制) 3、 将以上配制的无菌水和培养基全部进行灭菌处理。 第二周 (11-17)(周一)水样的采集: 1、自来水 :先将自来水龙头用火焰烧灼3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟，以排除管道内积存的死水，随后用已灭菌的三角烧瓶接取水样，以供检测。 2、池水、河水或湖水:应取距水面10—15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞 瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入4?冰箱中保存。 (11-18)(周二) 1、水中细菌总数测定 (1)自来水:用无菌移液管吸取0.2ml水样，涂布到倒好的牛肉膏蛋白胨培养基上。然后将其倒置于37?恒温箱内培养24小时。此水样重复两个培养皿。 (2)池水、河水或湖水: -1-2-3-4?水样稀释:取4支无菌试管，依次编号为10、10、10、10，然后在上述每支试管中 -1-1加入9ml无菌水。接着取1ml水样加入到10试管中，摇匀;另取1ml无菌移液管从10 -2-3-4试管中吸1ml水样至10试管中(注意点同上)，如此稀释至10、10管(稀释倍数视水样污染程度而定，取在平板上能长出30~300个菌落的稀释倍数为宜)。 ?涂平板:每个稀释度的试管中各取0.2ml稀释水样加入到牛肉膏蛋白胨培养基上进行涂布，每个稀释度重复两个培养皿。 ?将所有培养皿倒置于37?恒温箱内培养24小时。 2、水中大肠菌群的检测:初发酵试验 (1)自来水:在2个装有50ml 3倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的三角瓶中，各加入100ml水样。另在10支各装有5ml 3倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的试管中，各加入10ml水样，混匀后37?恒温箱内培养24h。 (2)池水、河水或湖水:在装有5ml和50ml 3倍浓缩乳糖蛋白胨培养基试管或三角瓶中分别加入10ml和100ml的原水样。然后在装有10ml乳糖蛋白胨培养基试管中分别加入 -1-2-31ml 10、10和10的稀释水样和1ml原水样，混匀后，37?培养24h(每个稀释度重复两个试管)。 3、配制伊红美兰培养基(蛋白胨10g，KHPO 2g，乳糖10g, 2%伊红Y溶液20ml, 24 0.65%美蓝溶液10ml，琼脂20g, 蒸馏水1000ml，pH 7.1)，然后进行灭菌处理。 (11-19)(周三) 1、水中细菌总数测定:计菌落数 将培养24h的平板取出，用肉眼观察，计平板上的细菌菌落数。 2、水中大肠菌群的检测:将产气产酸的阳性管放入4?冰箱中保存，记下阳性管数;将不产气产酸的阴性管继续放入37?恒温箱内培养24h。 (11-20)(周四) 将37?恒温箱内产气产酸的阳性管也放入4?冰箱中保存，记下阳性管数。 第三周 (11-24)(周一) 水中大肠菌群的检测:将经24h或48h培养后产酸产气或仅产酸的试管中菌液分别划线接种于伊红美兰琼脂平板上，于37?培养24h。 (11-25)(周二) 1、水中大肠菌群的检测(确定性试验用平板分离):将出现以下3种特征的菌落进行涂片、革兰氏染色和镜检。?深紫黑色，具有金属光泽的菌落。?紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。?淡紫红色，中心颜色较深的菌落。将革兰氏阴性菌挑选出进行复发酵试验。并且标记出阳性菌落的培养皿继续放入4?冰箱中保存。 2、配制乳糖蛋白胨培养基并灭菌(配方同上)。 第四周 (12-1)(周一) 水中大肠菌群的检测(复发酵试验):将选择出的菌落，经涂片、染色镜检后，若为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则用接种环挑取此菌落的一部分转接含乳糖蛋白胨培养基试管，37?培养24h。 (12-2)(周二) 观察实验结果，若呈现产酸产气即证实存在有大肠菌群。整个实验结束，完成实验。 五、实验结果及分析 1、水中细菌总数的测定(菌落数) 水样类型 1号平皿菌落数 2号平皿菌落数 平均数 1ml不同稀释度 水样的平均菌 落数 自来水 12 13 12.5 62.5 -110 26 9 17.5 87.5 -210 3 6 4.5 22.5 -310 4 3 3.5 17.5 -410 3 1 1.5 7.5 自来水中细菌总数为62.5(个,ml); 湖水中细菌总数为875(个,ml)。 分析: ?1ml自来水中细菌总数为62.5个，虽然符合我国规定1ml自来水中细菌总数不得超过100个，但数量还是有些偏多，可能是实验操作过程中无菌操作做得不够好，导致有杂菌进入到水样中。如果下次做此试验时应予以注意。 ?湖水细菌总数的测定比较成功。各稀释度的平均菌落数随稀释度的变化而有规律的变化。其细菌总数的值也比较合理，说明湖水是受污染的。 2、水中大肠菌群的检测 (1)自来水: 100ml水量中阳性管数为1个; 10ml水量中阳性管数为8个。 经查表得:自来水中大肠菌群含量为51个/L (2)湖水: -1-2 10、10稀释度各有一个阴性管，其余都为阳性管 经查表得:湖水中大肠菌群数为2300个/L。 分析: ? 1L自来水中大肠菌群数51个，不符合饮用标准。但此数据并不可信，因为在实验过程 中由于缺少严格的无菌意识，杂菌污染的可能非常大。 ? 湖水中大肠菌群数为2300个/L.，可见数量较多，被污染的程度比较严重。这次实验比较成功，实验数据合情合理。 ? 在复发酵试验中两管自来水水样又均为阴性反应，足以见得操作过程要在无菌的环境中才可。