_吃_砒霜的细菌_解析微生物的砷代谢

Mini-Review 综述 微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 51(2):154 － 160;4 February 2011 ISSN 0001 － 6209;CN 11 － 1995 /Q http:/ / journals. im. ac. cn / actamicrocn 基金项目:国家自然科学基金重大国际合作项目(31010103903);国家自然科学基金项目(30970075) 作者简介:王革娇(1962 －)，女，哈尔滨人，博士，教授，主要研究方向是微生物代谢重金属的机制与修复。Tel:+ 86-27-87281261;E-mail: gejiao@ mail. hzau. edu. cn 收稿日期:2010-12-16;修回日期:2010-12-30 “吃”砒霜的细菌———解析微生物的砷代谢 王革娇，黄银燕，李洁 华中农业大学生命科学技术学院 农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070 摘要:研究发现一些微生物可以利用剧毒的类金属砷(As)为自身生长获取能量甚至用砷代替磷维持生长。 本文综合了近期的研究进展，从以下 6 方面解析微生物多重的砷代谢产能机制:(1)化能无机自养 As (Ⅲ)氧化供能;(2)有机异养型 As(Ⅲ)氧化供能;(3)呼吸性 As(Ⅴ)还原供能;(4)As(Ⅲ)氧化偶联的光合 作用;(5)As(Ⅲ)氧化、As(Ⅴ)、还原 As(Ⅲ)氧化偶联的光合作用之间的关联;(6)As(Ⅴ)代替磷维持细菌 生长。阐明微生物利用砷的机理在生命起源、生命多样性、进化、地球化学循环及污染治理等方面都具有重 要价值。 关键词:微生物砷代谢，磷代谢，As(Ⅲ)氧化，As(Ⅴ)还原，As(Ⅲ)氧化偶联的光合作用 中图分类号:Q935 文献标识码:A 文章编号:0001-6209 (2011)00-0154-07 砒霜［As2O3］以其剧毒性而闻名，自古就被用 作杀人凶器。地壳中砷含量很高，以三价砷 As(Ⅲ) 和五价砷 As(V)为主。地质成因，加上人为的矿业 开采等因素，造成了世界上近 70 个国家都有地下水 砷超标，而亚洲是砷污染最为严重的地区［1］。水土 砷污染是我国乃至全球极具关注的环境问题。然而 当我们谈“砷”色变的时候，2010 年 12 月，Science 杂 志上刊登的细菌可以用砷代替磷进行生长的文章轰 动了全球［2］。美国科学家从加利福尼亚州的莫诺 湖 (Mono lake )分 离 出 了 1 株 盐 单 胞 菌 (Halomonadac-eae)GFAJ-1 可以在含 As 不加 P 的培 养基上生长。并且研究者认为 DNA 中的磷由砷代 替。由于磷是作为生命体主要的六大基本元素而参 与着机体的生命活动，这种机理的发现对我们对生 命组成的认识贡献巨大。但是，文章中还没有给出 足够的直接证据以证实 DNA 中的磷酸根确实是由 砷酸根所代替的。我们认为该类细菌也有可能是通 过高效利用砷酸根而获得营养，或利用磷的效率极 高，因为文中的培养 基中还存有极 少 量 的 磷 (3. 1 μmol /LPO3 －4 ) ［2］。 其实微生物能够利用砷来生长自 1994 年就已 发现［3］。有些微生物把砷当做必须的粮食，不“吃” 砒霜不能生存。近年来，关于微生物利用砷产能的 研究进展很快，迄今为止，共发现了 6 类微生物砷代 谢机制:微生物的 As(Ⅲ)氧化、细胞质 As(Ⅴ)还 原、呼吸性 As(Ⅴ)还原和 As(Ⅲ)甲基化，As(Ⅲ) 氧化偶联的光合作用以及 As(Ⅴ)代替磷维持微生 物生长。前 4 种机制在我们前期的综述中有较详细 分析［4］，但没有着重涉及微生物利用砷而产能的代 谢。本文结合分析近 3 年该领域的最新进展，从以 下 6 个方面，重点对于微生物如何利用砷，将其转化 为自身的物质或能量，参与生命代谢的机理进行 王革娇等:“吃”砒霜的细菌———解析微生物的砷代谢 . /微生物学报(2011)51(2) 阐述。 1 化能无机自养 As(Ⅲ)氧化供能 As(Ⅲ)氧化菌［As(Ⅲ)-oxidizing bacteria］分 为 两 种 不 同 的 类 型:化 能 无 机 自 养 型 (chemolithoautotrophy ) 和 化 能 有 机 异 养 型 (chemoorganoheterotrophy)。前者能够在有氧或厌 氧的条件下利用无机态 As(Ⅲ)为电子供体，O2 或 NO －3 为电子受体，固定 CO2 作为碳源，提供能量。 其模式菌株是根瘤菌(Rhizobium sp. NT-26)［5 － 6］和 Alkalilimnicola ehrlichii MLHE-1［7 － 8］。 NT-26 菌分离于澳大利亚北部金矿，可以在只 有 As(Ⅲ)作电子供体，O2 作电子受体，CO 2 － 3 作 C 源的培养基上生长，氧化产物为 As(V)。将 As (Ⅲ)氧化酶基因敲除后 NT-26 菌无法生长，因此对 As(Ⅲ)的氧化与生长相关［5］。NT-26 菌的 As(Ⅲ) 氧化型是异源四聚体(α2β2) ［5］，而化能有机异养型 粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis NCIB8687)的 As (Ⅲ)氧化酶成熟蛋白是由大小两个亚基组成的约 100 kDa 的异源二聚体(α1β1) ［9］。Thiomonas sp. 3As 也属于化能无机 自 养 型 的 As (Ⅲ)氧 化 菌［10 － 11］，固定 CO2 的 rbc / cbb 基因受砷的诱导，自养 生长速率与砷浓度成正比［12］。 另一株典型的 As(Ⅲ)氧化型化能自养菌是从 莫诺湖湖底分离的兼性化能自养菌 MLHE-1［7 － 8］。 MLHE-1 有两种代谢途径，在有氧条件下，它以醋酸 盐为电子供体和 C 源进行异养生长［7］。在厌氧条 件下，MLHE-1 菌以 As(Ⅲ)作为电子供体，以硝酸 盐作为电子受体，通过核酮糖 1，5 二磷酸羧化酶 (RuBisCO)固定无机 C 源，由 As(Ⅲ)氧化和反硝化 偶联供能［8］。另据报道，有这种功能的菌还有 Azoarcus sp. DAO1 和 Sinorhizibium sp. DAO10［13］。 2 有机异养型 As(Ⅲ)氧化供能 对于大多数 As (Ⅲ)氧化菌如 Alcaligenes faecalis NCIB8687［9］，假单胞菌 (Pseudomonas sp. TS44)，无色杆菌(Achromobacter sp. SY8)［14］等不能 利用氧化 As(Ⅲ)的能量支持其生长，普遍认为这类 As(Ⅲ)氧化是微生物的一种解毒机制。然而 Muller 等 在 研 究 有 机 异 养 型 As (Ⅲ)氧 化 菌 Herminiimonas arsenicoxydans 时发现该菌对 As(Ⅲ) 具有正趋化性，敲除 As(Ⅲ)氧化酶基因 aoxAB 的突 变株对 As(Ⅲ)几乎没有趋化性。由此推断，H. arsenicoxydans 氧化 As(Ⅲ)产生的能量能够用于它 的鞭毛运动。这是迄今首次报道化能有机异养型 As(Ⅲ)氧化可以提供用于生命运动的能量［15］。 3 呼吸性 As(Ⅴ)还原供能 1994 年，Nature 上报道了有毒的 As(Ⅴ)可以 作为电子受体参与微生物的呼吸代谢，这是首次对 砷参与生命能量代谢的发现［3］。呼吸性 As(Ⅴ)还 原［respiratory As(Ⅴ)reduction］也称异化 As(Ⅴ) 还原，是指细菌或古菌在厌氧的条件下，以无机物 (OH －，S2 －)或有机物(醋酸盐，甲酸盐，延胡索酸， 苹果酸，葡萄糖［16］，苯甲酸盐，甲苯［17］)作为电子供 体，以无机 As(Ⅴ)作为电子受体进行异化还原作 用，产生能量支持微生物的生长。催化反应的厌氧 As(Ⅴ)周质还原酶(Arr)是一个由大(ArrA)小 (ArrB)两个亚基组成的异源二聚体［18］。对希瓦氏 菌(Shewanella sp. ANA-3)的研究中发现碳代谢抑 制系统中 cAMP 的受体蛋白(CRP)激活 arr 操纵子 的达，缺失两个腺苷酸环化酶基因(cya)ANA-3 突变株(ANA-3 基因组中共四个预测的 cya)不能在 以 As(Ⅴ)为电子受体的培养基上生长。故 C 代谢 抑制系统在 ANA-3 菌呼吸性 As(Ⅴ)还原中起很重 要的作用，而厌氧抑制基因(arcA，etrA)的缺失对此 影响不大［19］。在 ANA-3 菌中，阻遏砷调控蛋白 ArsR 除了调控砷抗性离子泵 ars 系统，也调控 arr 的 表达。其中 ArsR2(ANA-3 有 3 个 ArsR)可结合在 arr 启动子区域，在 As(Ⅲ)的诱导下，ArsR2 解离， 与此同时，CRP 结合到相同的区域，启动 arr 的表 达［20］。 4 As(Ⅲ)氧化偶联的光合作用 剧毒的 As(Ⅲ)可以在一些微生物里像 H2O 一 样作为电子供体进行光合作用，2008 年，Science 报 道的这一发现对该研究领域有较大震撼［21］。Kulp 等人在莫诺湖由温泉冲泡的厌氧盐水池的表面岩石 上发现的生物膜可以在缺氧条件下，发生不产生氧 气的光合作用，同时，存在与岩石表面泥浆中的 As 551 Gejiao Wang et al. / Acta Microbiologica Sinica(2011)51(2) (Ⅲ)被氧化为 As(Ⅴ)。对生物膜进行热击或在黑 暗条件下不发生上述现象。形成生物膜的微生物是 类似于外硫红螺菌属的紫细菌和颤藻属的蓝细菌。 从中分离纯化出一株砷氧化光合自养细菌 PHS-1， 与一株属于 γ-Proteobacteria 的光合细菌外红硫螺菌 (Ectothiorhodospira shaposhnikovi )16S rRNA 基因同 源性达 99. 4%。在厌氧光照条件下 PHS-1 菌可以 用 As(Ⅲ)作为唯一的电子供体，进行光合作用固定 CO2 来生长 ［21］。 图 1 呼吸性 As(V)还原酶(ArrA)，AoxB 型 As(III)氧化酶，MLHE-1 的 ArxA 型 As(III)氧化酶的系 统进化树［24］ Fig. 1 Phylogenetic analysis of arsenate respiratory reductases (ArrA)，AoxB-type arsenite oxidases，and the ArxA-type arsenite oxidase of MLHE-1［24］. 5 As(Ⅲ)氧化、As(Ⅴ)还原和 As (Ⅲ)氧化偶联的光合作用 3 种代谢的 关联 以上 3 种机制因两个巧合而联系更加紧密。巧 合 1:MLHE-1 菌中一直没有发现 As(Ⅲ)氧化酶 AoxAB，而只发现了两个与呼吸性 As(Ⅴ)还原酶大 亚基 ArrA 同源性很高的蛋白(ArrA，Mlg_0216，Mlg _2426)［22］。巧合 2:在 PHS-1 菌中也没有发现 As (Ⅲ)氧化酶，只发现一个预定的呼吸性 As(Ⅴ)还 原酶(ArrAB)［21］。两个巧合使人不得不怀疑呼吸 性 As(Ⅴ)还原酶是否也能进行 As(Ⅲ)氧化。 Richey 等人将 MLHE-1 菌的 ArrAB 蛋白(Mlg_0216， Mlg_0215)纯化，在体外进行酶活实验发现 ArrAB 在厌氧条件下既能进行 As(Ⅲ)氧化，又能进行 As (Ⅴ)还 原。将 两 株 呼 吸 性 As (Ⅴ)还 原 菌 Alkaliphilus oremlandii 和 Shewanella sp. strain ANA-3 的 ArrAB 同样进行体外实验，发现 ArrAB 能进行 As (Ⅲ)氧化。体外实验表明 ArrAB 是一个氧化还原 双向酶(bidirectional enzyme)［22］。 随后对 MLHE-1 菌进一步研究表明 arrA(mlg_ 0216)只在厌氧条件下有 As(Ⅲ)存在时才表达， 该基因敲除后，无法进行与反硝化偶联的 As(Ⅲ) 氧化。而将 MLHE-1 菌中 arrA(mlg_2426)敲除后 不发生类似情况。所以在 MLHE-1 中起 As(Ⅲ)氧 化作用的是 ArrA(Mlg_0216)。ArrA(Mlg_0216) 具有类似于 AoxB 的 As(Ⅲ)氧化功能，却与 ArrA 同源性很高，所以 ArrA(Mlg_0216)被重新命名为 ArxA(arsenate reductase arsenite oxidase )，一种新 型的 As(Ⅲ)氧化酶，在系统进化树上填补了 ArrA 和 AoxB 之间的空隙(图 1)。ArrA 和 AoxB 都属于 二甲基亚砜(DMSO)还原酶家族。MLHE-1 菌也 有一个类似于其它 As(Ⅲ)氧化菌中的 As(Ⅲ) 氧化 酶 aox 操 纵 子，比 如 它 与 本 课 题 组 在 651 王革娇等:“吃”砒霜的细菌———解析微生物的砷代谢 . /微生物学报(2011)51(2) Achromobacter sp. SY8 中发现的 As(Ⅲ)氧化酶 aox 操 纵 子 aoxXRSABCD 相 类 似［14］ (图 2)。 MLHE-1 菌中有活性的 ArxA 有一个［4Fe-4S］结 构，而 SY8 菌的 AoxB 有一个［3Fe-4S］结构。ArxB (Mlg_0215)有四个［4Fe-4S］结构而 AoxA 有一个 ［2Fe-2S］结构［14，23］。MLHE-1 菌中的 ArxC 是预定 的膜蛋白 NrfD，ArxD 与细胞质分子伴侣 TorD 同 源，ArxE 类似于肽酰脯氨酰异构酶［24］。 研究者还发现在 As(Ⅲ)氧化偶联的光合细菌 PHS-1 中 ArrA 的同源序列与 MLHE-1 菌的 ArxA 有 80% 同源性，因为 PHS-1 与 MLHE-1 菌都属于 Ectothiorhodospiraceae，所以可以推测，PHS-1 菌中 arrA 的同源基因在厌氧光合 As(Ⅲ)氧化途径中进 行 As(Ⅲ)氧化。从进化的角度研究 arrA ，aoxB， arxA 这 3 个基因将深化我们对微生物将砷作为能源 物质进行代谢的认识［24］。 图 2 MLHE-1 菌的 arx 操纵子［24］与 SY8 菌的 aox 操纵子的比较［14］ Fig. 2 Comparison between arx operon of strain MLHE-1［24］ and aox operon of strain SY8［14］. 6 As(Ⅴ)代替磷维持细菌生长 Wolfe-Simon 等 人 发 现 的 GFAJ-1 菌 (Halomonadaceae)分离自美国加利福尼亚含高盐碱 的莫诺湖。该菌可以在 + As(Ⅴ)/ -P 的培养基内稳 定生长，并伴随有细胞形态的改变。研究者发现，在 这种特定的培养条件下，细胞体内砷含量显著高于 磷，而认为其中微量的磷含量(0. 02%)不足以支持 细胞生长。同时研究者利用73 As 同位素标记以及 X 射线，NanaSIMS 探测到砷分布于细胞内的重要生物 分子 DNA、蛋白质和脂类中。特别是在 DNA 中，研 究者得到的数据显示砷比磷多得多(P /As = 0. 09)，X 射线吸收近边结构(XANES)和广延 X 射线 吸收精细结构(EXAFS)分析也说明 As 在细胞中主 要以 AsO3 －4 存在，因此研究者推断，砷类似于磷的 存在形式，充当 DNA 的骨架成分［2］。 7 探讨和展望 砷能代替磷而维持生命的报道令人耳目一新， “砷基生命”的出现使得生命组成形式变的更加多 样化，但是这项研究中［2］还有一些问题需要进一步 论证。首先研究者并没有给出直接证据说明 DNA 中 PO3 －4 被 AsO 3 － 4 所替代，实验结果只是说明了砷 以较高的含量存在于 DNA 分子中，具体的作用还不 可知。实际上，利用核磁共振等方法对 DNA 的结构 进行测定，可以说明 DNA 中 AsO3 －4 的结构位置及 数量，这将是对该发现的有力证实。另一方面，如果 当 DNA 中存在着这种元素之间的替代，那么是否是 元素的完全替代还不确定，因为数据显示其中仍有 微量的磷存在。其次，该替代是否会改变原有的 DNA 骨架结构也有待阐明，因为常温下，砷化合物 不如磷化合物稳定，如果 DNA 分子中 AsO3 －4 作为 连接骨架，原有的双螺旋结构就有可能因为这种不 稳定性而发生改变。这些都有待于进一步的研究。 另外，虽然有“砷基生命”的出现，但是我们还无法 得知这种生命的出现到底是由于在极端条件下菌体 为适应而做出的改变，还是远古以来就存在着这样 的生物。 从 AoxB、ArrA、ArxA 3 个蛋白的进化树推测这 3 个蛋白在进化过程中存在一定联系。根据地球上 厌氧生命出现早于好氧生命这个理论，我们推测 AoxB 的出现晚于 ArrA 和 ArxA，根据进化树的位置 关系推测 ArxA 进化上可能是连接其他两者的桥 梁，有以下两种进化可能:ArrA→ ArxA→ AoxB 或 751 Gejiao Wang et al. / Acta Microbiologica Sinica(2011)51(2) A rrA←ArxA→AoxB。是哪种进化模式或者两种模 式都有，可能与地球上早期 As(Ⅲ)与 As(Ⅴ)出现 的顺序或者含量差别有关，而这类蛋白的进化与砷 代替磷是否相关还有待进一步研究。 微生物通过代谢砷参与物质和能量的循环。本 课题组通过对化能自养和异养型砷氧化菌的研究发 现，长期受砷污染的土壤中砷氧化、还原菌的多样性 丰富且砷抗性强，水平基因转移可能加速了砷抗性 菌的侧向进化［25］;不同深度的砷污染地下水周围沉 积物中砷氧化和还原菌的种类的分布与地质因素、 砷含量等有关，同时这些细菌的代谢也影响着砷在 地表、沉积物和地下水之间的转移［26］。我们还发现 抗砷菌及相关基因在高富集砷植物蜈蚣草根际具有 特殊性，接种抗砷菌增强了蜈蚣草对土壤砷的富集 效率，表明根际抗砷菌在蜈蚣草对砷的富集过程中 起到重要作用［27］。而且，土壤磷含量与根际抗砷菌 种群的变化及砷由地表层向地下的渗透都有重要关 联。对两株典型的砷氧化菌的氧化调控机制研究预 示了多组分的砷感应调控模式［14］，砷氧化还可能与 细菌生长及运动性相关。对该类细菌代谢砷参与物 质和能量的循环中的重要作用的阐明，以及微生物 砷代谢与磷、硫代谢的关联机制的研究是今后科研 工作的重点。另外，微生物的砷甲基化［28 － 29］是否也 参与能量代谢也是值得关注的科学问题。 纵观全文，加利福尼亚州的莫诺湖这个名字极 其耀眼。该湖几乎拥有全部上文提及的新奇砷代谢 菌(表 1)。这个神奇的湖其实是一个与外界封闭的 “死湖”。它是北美最古老的湖泊之一，上百万年的 蒸腾作用造就了它高盐碱，高砷(H2AsO － 3 ，HAsO 2 － 4 ) 的特性，也保留了很多古老而特殊的生命［30］。 表 1 自莫诺湖分离的砷代谢菌株 Table 1 List of the bacteria isolated from Mono Lake As metabolism type Bacterial name Growth using As(Ⅴ)instead of P GFAJ-1(Halomonadaceae) ［2］ Chemoautotrophic As(Ⅲ) oxidizer Alkalilimnicola ehrlichii MLHE-1［7］ Respiratory As(Ⅴ)-reducer Bacillus selenitireducens MLS10［30］ Bacillus arsenicoselenatis E1H［30］ Photosynthesis As(Ⅲ)oxidizer Ectothiorhodospira sp. PHS-1［21］ 综上所述，阐明微生物利用砷的机理在生命起 源、生命多样性、进化和地球化学循环等方面都具有 重要价值。我们推测，如果莫诺湖是地球早期恶劣 环境的现代模拟，那么对这些微生物的研究有助于 我们对地球早期生命的形成，进化和代谢模式的认 识。如果这些微生物的特性是由于环境作用进化而 来，那我们也很难完全否定，在我们原本认为不适合 生命生存的宇宙其它星球上可能存在生命。 参考文献 ［1 ］ Sun G. Arsenic contamination and arsenicosis in China. Toxicology and Applied Pharmacology，2004，198:268 － 271. ［2 ］Wolfe-Simon F，Blum JS，Kulp TR，Gordon GW，Hoeft SE，Pett-Ridge J， Stolz JF，Webb SM，Weber PK， Davies PCW，Anbar AD，Oremland RS. A bacterium that can grow by using arsenic instead of phosphorus. Science，2010，www. sciencexpress. org，DOI:10. 1126 / science. 1197258. ［3 ］ Ahmann D，Roberts AL，Krumholz LR，Morel FM. Microbe grows by reducing arsenic. Nature，1994，371: 750. ［4 ］蔡林，王革娇，抗砷性微生物及其抗砷分子机制研究 进展 .微生物学通报 (Microbiology) ，2009，36 (8): 1 － 7 . ［5 ］ Santini J， Sly L， Schnagl R， Macy J. A new chemolithoautotrophic arsenite-oxidizing bacterium isolated from a gold mine:phylogenetic，physiological， and preliminary biochemical studies. 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As(Ⅲ)oxidation coupling with photosynthesis;5. The interactions among As(Ⅲ)oxidation，As(Ⅴ)reduction and As(Ⅲ)oxidation coupling with photosynthesis;6. Growth using As (Ⅴ) instead of phosphorus. Gaining information of microbial arsenic metabolisms is fundamental important for better understanding of life creation，biodiversity，evaluation，biogeochemical cycle and bioremediation. Keywords:microbial arsenic metabolism，phosphorus metabolism，As(Ⅲ) oxidation，As(Ⅴ) reduction，As(Ⅲ) oxidation coupling with photosynthesis (本文责编:王晋芳) Supported by the Major International Joint Research Project of the Chinese National Natural Science Foundation (31010103903)and by the Chinese National Natural Science Foundation (30970075) * Corresponding author. Tel / Fax: + 86-27-87281261 /87280670;E-mail:gejiao@ mail. hzau. edu. cn Received:16 December 2010 / Revised:30 December 2010 061