nullnull制作:祁飞燕
何 敏
内容:内容:抗体酶的发展历程
抗体酶的结构和性质
抗体酶的反应类型
抗体酶的制备
抗体酶的筛选方法
抗体酶的应用
抗体酶存在的问
抗体酶的发展前景
结束语
null一、抗体酶的发展历程
抗体与酶关系:
(1)共性:都是蛋白质分子;
与底物以及抗原的结合是高度专一的。
(2)区别:酶 反应过渡态(激发态 分子)
抗体 基态分子
null研究进展1946年,Linus Pauling明了酶的催化实质。酶+底物酶-底物
复合物降低活化能反应速率1969年jencks 提出抗体酶设想 ——若抗体能结合反应的
过渡态,理论上他则能够获得类似酶的催化性质 。
1984年Lerner进一步推测:以过渡态类似物作为半抗原
1986年,美国Scripps Clinic研究所的R.A.Lerner等宣布研
制成功首例对羧酸酯水解具有催化活力的抗体酶。null意义:
打破了只有天然酶才有的分子识别和加速催化反应的传统观念, 为酶
学开创了新的领域。
同时也为验证天然酶的催化机制, 进行酶的人工摸拟以及研究天然酶催化作用的起源提供了很好的帮助。
自1986 年抗体酶宣告成功一来的十年里抗体酶已成功地催化了所有六种酶促反应和数十种类型的常规反应。这包括羧酸酯、碳酸酯、磷酯酯、肽键、烯醇醚和糖苷键的水解, 酰胺的形成和水解, 酯交换、内酯化、消除反应, Claisen 重排反应:D iels2A lder 反应、光分解和聚合、顺反异构化、脱羧、环氧化反应等 。
抗体酶在治疗方面也展现出灿烂的前景。 null二、抗体酶的结构和性质二、抗体酶的结构和性质抗体和酶一样是大分子蛋白质, 由2 条相同的轻链(大约2500D ) 和2 条相同的重链(大约5000D) 组成。
轻链由VL (可变区) 和CL (不变区) 组成, 重链也由VH (可变区) 和CH (不变区) 组成。
重链和重链及重链和轻链之间通过二硫键相连。
Fab 片断由轻链和重链VH 及CH1 组成。抗体多样性Fabnull抗体与抗体酶结构异同:
相同点:抗体酶的结构与抗体分子相似(都是由两条轻链
和两条重链构成,每条链都有可变区和不可变区)抗原与轻链和重链的可变区特异的结合,所以可变区基酸的排列决定了抗体分子的特异性 。
区别:其可变区除了具有抗原特异的结合能力外,还被赋予了
酶的催化活性 ,因此本质上抗体酶是一类具有催化活性的疫
球蛋白,在可变区赋予了酶的属性,所以,也称为催化抗体。 null早期抗体酶——双链抗体酶
类似于免疫球蛋白, 含有两条轻链和两条重链, 每条链
都含有不变区和可变区。
随着抗体酶技术的发展, 仅含有可变区的单链抗
体酶已被制备, 它由重链可变区和轻链可变区一起构成
, 不仅保持了较高的亲和力, 而且具有免疫原性低、渗
透能力强的特点, 更适合作为药物 。
抗体酶主要来自IgG抗体分子。 IgG分子是由2条相同的重链及2条相同的轻链靠二硫键连接而成。 三、抗体酶的反应类型三、抗体酶的反应类型酯水解反应
在抗体催化的反应中,研究最广泛的是酯水解反应,它的过渡
态是带负电荷的四面体结构。
步骤(MOPC167催化碳酸脂水解为例):化学合成过
渡态类似物作为半抗原耦合于血
清蛋白注入动
物体内抗体MOPC167单克隆技术分离纯MOPC167在抗体催化碳酸脂反应中,MOPC167和过渡态碳酸脂结合后,提高了反应
物过渡态的稳定性,降低了反应的活化能,从而加速了水解反应的进程。该
反应的产物生成速度常数KCAT达到了(0.40±0.04)min-1,米氏常数Km为
208±43μmol/L。 null1.酯水解反应2.Oxy-Cope重排 半抗原null2. Oxy-Cope重排
Oxy-Cope重排反应是一类热重排可逆反应改变分子的结
构,在分子内引入共轭基团或羟基以增强产物的稳定性,可使
重排反应所需的温度大大降低和变成不可逆反应。
步骤(要经过一个六元环的过渡态) :
合成Oxy-Cope重
排反应的过渡态作为半抗原载体蛋白
BSA免疫动物多克隆抗体在200mmol/L的MES(4-吗啉已磺酸)和200mmol/L的NaCl缓冲液中(PH=6.0),
底物和抗体的摩尔比为100∶1及37℃条件下,该抗体能催化3-对甲基苯基-4-
羟基-1,5-已二烯重排生成6-对甲基苯基-5-烯-乙醛。该反应的Km为
1025μmol/L,KCAT为10min-112]。 null3.还原反应
----高度立体选择的还原反应
null4.其他反应
环氧化反应
氧化物开环反应
Diels-Alder反应 (有机合成中有重要作用,而自然界中却不存在催化该反应的酶。)
Claisen重排反应(用分支酸盐变位酶的抑制剂作半抗原而产生的单克隆抗体IF7,在IF7催化下,分支酸盐迅速发生重排。)四、抗体酶的制备方法 四、抗体酶的制备方法 抗体技术的发展经历了3 个阶段:
一是通过免疫动物产生血清多克隆抗体;
二是细胞工程阶段,即用杂交瘤技术生产单克隆抗体;
三是利用基因工程途径
达和改造抗体。抗体酶最初的产生手段步骤:首先,合成稳定的反应过
渡态类似物,将此化合物作为半抗原与载体蛋白相连,
免疫动物制备单克隆抗体,由它诱导产生的抗体,可按
预定方向取得催化活性。该方法中最重要的是半抗原的
分子设计和合成。 null杂交瘤技术
脾脏细胞 骨髓瘤细胞 杂交细胞选择培养杂交瘤细胞单克隆化细胞集落 ELISA筛选抗体酶 该制备方法的关键:要有合适而稳定的过渡态模拟
物作半抗原,以产生与过渡态高度亲和的抗体酶。
本方法所得到的抗体酶的催化能力的高低,在很大
程度上取决于化学模型物的设计,现在应用的设计策略
包括:诱导和转化设计,反应免疫“潜过渡态”半抗原设
计等等。 2.化学修饰法 2.化学修饰法 将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位。
对抗体酶进行结构修饰的关键,是找到一种吻合的方法在抗体结合位置或附近引入酶的催化基团或辅助基团,如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确,空间排布恰到好处,就能产生高活力的抗体酶。
为提高抗体酶的催化能力,可采用邻近效应,静电催化,应变,功能团催化等方法,在抗体结合位点引入催化基团。
3.相似分子诱导法 酶的抑制剂做半抗原,筛选抗体酶(适用于过渡态
类似物难以合成的条件下 )。4.共价抗原免疫法 4.共价抗原免疫法 在亲和标记抑制剂基础上发展起来的新抗体酶制备方法。
如果以亲和标记剂为半抗原,则抗体结合部位将产生与亲和基团电荷性质相反的基团,如:亲核性和亲电性氨基酸、酸性氨基酸及碱性氨基酸等。
该途径适用于产生一些活性部位中含有上述氨基酸的酶。5.基因工程技术
技术原理:已产生的单抗 氨基酸序列碱基顺序 对抗体酶结合部位
氨基酸对应的基因
序列进行定点突变 改变抗体酶的
催化效率 6.抗独特型抗体酶法6.抗独特型抗体酶法根据Jerne 提出的免疫网络学说,抗独特型抗体中的Ab2β能识别并结合Ab1 上与抗原表位结合的补位,其具有抗原内影像作用,可在空间结构上模拟抗原并可能具有抗原的一些性质。
根据这一理论,可以酶作为免疫原诱导机体产生抗体,再利用该抗体继续免疫,诱导产生的抗独特型抗体即可能具有催化活性。
利用该方法的优点是可直接利用酶诱导机体产生抗体,进而产生与酶具有相同活性部位的抗独特型抗体,如果对酶的结构预先进行修饰,还有望诱导产生底物特异性与酶不同的催化性抗体。
利用这一策略,目前已成功制备了具有乙酰胆碱酯酶、β- 内酰胺酶和蛋白酶活性的抗独特型抗体酶。酶-免疫原抗体抗原-抗体抗原抗独特型抗体(催化活性)