8微生物的遗传与变异

null第八章 微生物的遗传与变异 第八章 微生物的遗传与变异 null第一节 遗传和变异的物质基础第二节 微生物的突变与诱变育种第四节 真菌的基因重组第三节 细菌的基因重组第六节 微生物与基因工程第七节 菌种的衰退、复壮与保藏第五节 微生物基因表达的调控null1）遗传：亲代与子代相似的现象2）变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同的现象3）遗传型(genotype)：决定生物表现型的遗传因子4）表型(phenotype)：具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。遗传型＋环境条件表型遗传（inheritance）和变异（variation）是生命的最本质特性之一几个术语：null6）表型饰变：同样遗传型的生物在不同外界条件下显现的不同表现型的变异，不涉及遗传物质结构改变。 特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为遗传型改变引起的表型变化，发生在基因水平上，可以遗传给子代。 特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9）5）遗传型变异（基因突变）：null微生物是遗传学研究中的良好材料： 微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体， 方便建立纯系。 很多常见微生物都易于人工培养，能够快速、大 量生长繁殖。 物种和代谢类型多样 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株， 操作性强。 第一节 遗传变异的物质基础第一节 遗传变异的物质基础一.核酸是遗传物质的经典实验 ①1928年，F. Griffith（格里菲斯）；1944年O. T. Avery（埃弗雷）的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）转化试验。 ②1952年，Alfred D. Hershy（侯喜）、Martha Chase（蔡斯）的噬菌体感染实验。 ③1956年，H. Fraenkel（法朗克）-Conrat（康勒特）的TMV拆开和重建实验。 null1、经典转化实验 肺炎链球菌： S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力） R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）null1928年，F.Griffth的转化实验null①加S菌DNA ②加S菌DNA及DNA酶以外的酶 ③加S菌的DNA和DNA酶 ④加S菌的RNA ⑤加S菌的蛋白质 ⑥加S菌的荚膜多糖 活R菌长出S菌只有R菌1944年Avery、MacLeod和McCarty从热死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子DNA。null2、噬菌体感染实验实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。32P标记DNA35S标记蛋白质Alfred D. Hershy（侯喜）和Martha Chase（蔡斯）null3、植物病毒TMV重建实验H. Fraenkel（法朗克）-Conrat（康勒特）实验证明，TMV的遗传物质是RNA。结论：结论： 证明核酸（DNA或RNA）是遗传的物质基础（细胞生物的遗传物质是双链DNA；病毒的遗传物质可以是单链的或双链的DNA或RNA,即：ssDNA，dsDNA，ssRNA或dsRNA。） 简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题 微生物与高等生物具有共同的遗传本质Prusiner普鲁西纳(1982)提出羊搔痒病因子是一种蛋白质侵染颗粒 proteinaceous infectious particle，并将之称做Prion或Virino。 -------朊病毒 1997年，Stanley B. Prusiner荣获诺贝尔奖null4.朊病毒的发现和思考:朊病毒 一种具有传染性的蛋白质致病因子蛋白质是遗传物质吗 蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？ ？？？已知的传染性疾病的传播因子必须含有核酸null①真核生物 DNA分子与组蛋白结合构成染色体，每条染色体有单一线性双链DNA分子。一个真核生物细胞内有多条染色体（脉孢菌7条，人23条）。高等生物中有2至多套染色体（动物2倍，水稻4倍），真菌有双倍体，但多数微生物是单倍体。真核细胞核物质外有核膜包围，形成完整细胞核。 ②原核生物 DNA不与组蛋白结合，染色体仅由一条DNA组成，DNA为共价闭合环状双链，一个细胞内只有一条染色体（单倍体haploid）。无核膜包围，只在细胞中央形成核区。 ③质粒plasmid和转座因子 原核生物中，除染色体以外，能够自主复制的共价闭合环状DNA分子。它们携带少量遗传基因，决定细胞的某些性状，并非细菌生活必需。 二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式 (一）遗传物质在微生物细胞中的存在方式null1、细胞水平 2、细胞核水平 3、染色体水平 4、核酸水平 5、基因水平 6、密码子水平 7、核苷酸水平（二）遗传物质在7个水平上的形式 null1、细胞水平 真核微生物：细胞核 原核微生物：核区 细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的2、细胞核水平 真核生物 细胞核 核染色体 原核生物 核区 DNA链核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质null核外染色体真核生物的“质粒” 原核生物的质粒 线粒体 细胞质基因 叶绿体 （质体） 中心体 动 体 共生生物： 卡巴颗粒 酵母菌的2m质粒F因子 R因子 Col质粒 Ti质粒 巨大质粒 降解性质粒核基因组遗 传 物 质 类 型null3、染色体水平 染色体的数目在不同的生物中是不同的；真核生物染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构，真核生物通常为多倍体。 原核生物的染色体只有闭合环状的DNA链，原核生物为单倍体。 4、核酸水平 核酸种类：DNA，RNA 核酸结构：双链、单链； 环状，线状； 超螺旋状 DNA长度：因种而异null5、基因水平一切具有自主复制能力的遗传功能单位都称为基因。它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的DNA片段。 1909年 丹麦生物学家W．Johansen（约翰逊）结构基因：是为细胞结构、组成型酶(如细胞生化反应所需的 酶)及完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。 调节基因：用于编码调节蛋白的基因。 操纵基因：是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序， 能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转录是否能进行。 重复基因：DNA片段重复 跳跃基因：可在DNA上转移位置的基因（IS因子插入序列、Tn因子转座子）null6、密码子水平密码子（coden）：由3个核苷酸顺序决定，负载遗传信息的基本单位7、核苷酸水平 核苷酸是最小突变单位和交换单位null（三）转座因子（transposible element）细胞中能改变自身位置（例如从染色体或质粒转移到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段DNA序列。也称跳跃基因（jumping gene）或可移动基因（movable gene）。插入序列（insertion sequence,IS)转座子（transposon ,Tn)某些病毒（Mu噬菌体---诱变噬菌体）原核生物的转座因子：转座因子转座因子40年代McClintock在玉米中发现了转座子即跳跃基因，自1967年以来，已在微生物和其它生物中得到普遍证实。1983年获诺贝尔奖。 旧概念：基因是固定在染色体DNA上的一些不可移动的核苷酸片段。 新发现：有些DNA片段不但可在染色体上移动，还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA顺序的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。转座因子的种类（1）转座因子的种类（1）插入序列（IS，insertion sequence）：分子量最小（仅0.7-1.4kb），只能引起转座（transposition）效应而不含其它基因。可以在染色体、F因子等质粒上发现它们。 已知的IS有5种，即 IS1、IS2、IS3、IS4和IS5。 E . coli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS（如IS2，IS3等），通过这些同源序列间的重组，就可使 F因子插入到E . coli的核染色体组上，从而使后者成为Hfr菌株。 因IS在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS引起的突变可以回复，其原因可能是IS被切离，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。转座因子的种类（2）转座因子的种类（2）转座子（Tn，transposon，又称转位子，易位子）：与IS和Mu(诱变)噬菌体相比，Tn的分子量是居中的（一般为2~25kb）。它含有几个至十几个基因，其中除了与转座作用有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其它基因。 Tn(转座子)虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但这些位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易插入。 null 特征：在两端有IR序列 ，分两类： Ⅰ型Compound transposons： 两端为插入序列IS，抗性基因居中。 如Tn5、Tn9、Tn10、Tn4001、Tn4003。 Ⅱ型Complex transposons： 两端为IR(30-50bp)，中间为转座基因和抗性基因。 如Tn1、Tn3、Tn21、Tn1721、Tn551。 转座子 transposon转座因子的种类（3）转座因子的种类（3）Mu噬菌体（即 mutator phage，诱变噬菌体）：它是E . coli的一种温和噬菌体。与必须整合到宿主染色体特定位置上的一般温和噬菌体不同，Mu(诱变)噬菌体并没有一定的整合位置。 与以上的IS（插入序列）和Tn（转座子）两种转座因子相比，Mu(诱变)噬菌体的分子量最大（37kb），它含有20多个基因。,Mu(诱变)噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2%是营养缺陷型突变。（四）质粒转座的遗传学效应：1）插入突变2）产生染色体畸变3）基因的移动和重排（四）质粒null（五）基因的表达 以DNA为，通过RNA聚合酶转录出mRNA，然后将mRNA包含的碱基顺序在核糖体中翻译成相应氨基酸序列的多肽。 ①转录（transcription） 双链DNA→单链，以其中一条为模板→互补mRNA ②翻译(translation) mRNA →多肽nullDNA→RNA→(肽链)→蛋白质三、微生物的基因组结构三、微生物的基因组结构明确基因组的概念，微生物在人类基因组计划中的独特而重要的地位； 人类基因组计划对微生物学发展的影响； 三种代表性微生物基因组结构的特点，特别强调古生菌基因组的独特性及双重特征； 随着基因组全序列测定微生物的增多所发现的新问题： 水平基因转移现象 Woese(伍斯)系统发育树面临的挑战 null微生物基因组结构的特点1、原核生物（细菌）的基因组1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）； 2）基因组上遗传信息具有连续性； 基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数 一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构； 4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝； 5）基因组的重复序列少而短. 基因组genome：一种生物的全套基因。null 细菌染色体DNA的大小和结构 (a)大肠杆菌细胞大小和染色体DNA长度的比较；(b)细菌细胞中的拟核；(c)大肠杆菌染色体结构电镜图。宽1.1~1.5 mm、长2~6 mm的细胞里包装着的一个DNA分子的长度达1 mm；这个环状的DNA分子在细胞中形成含有一个染色体的拟核；在染色体的中心有一个由DNA结合蛋白和膜组成的骨架，DNA分子附着在骨架上形成50~100个超螺旋的环，每个环中含碱基对约50~100 kb，这种多层次折叠使DNA处于高度压缩状态. From figures in referenced book 5.null mRNA不需要加工，转录与翻译同步。 启动子：在－10和－35区具有特征性的序列，被不同的σ因子所识别。 多顺反子：功能相关的多个基因往往聚集成一个操纵子，处于同一个转录单元中。 细菌的转录和翻译同步进行nullnull2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组1）典型的真核染色体结构； 啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。 2）没有明显的操纵子结构； 3）有间隔区（即非编码区）或内含子序列； 4）最显著的特点是重复序列多. 第一个完成基因组测序的真核生物基因组null基因组上有许多较高同源性的 DNA 重复序列，这是一种进化。即可在少数基因发生突变而失去功能时不会影响生命过程，也可适应复杂多变的环境，丰余的基因可在不同的环境种起用多个功能相同或相似的基因产物，有备无患。 酵母菌确实比细菌和病毒进步而富有，而细菌和病毒似乎更聪明，能更经济更有效地利用遗传资源。 null真核生物细胞中的DNA中只有不到5％的DNA用于所需蛋白质的基因表达，其余的DNA起“结构”作用或“调节”作用。 DNA被紧密地包装在多条染色体中，每条染色体中含有一个线状DNA分子，它以左手螺旋方向围着一个个组蛋白八聚体绕圈1.8周，形成串珠状的染色质，被串在一起的小颗粒称为核小体，染色质进一步卷曲形成每圈6个核小体、直径30 nm的染色质丝，它折叠成许多超螺旋环附着在中央骨架上。真核生物的染色体结构 From BIOLOGY by Jack C Carey et al., edsnull插入子的切除和表达子的拼接nullnull3、古生菌（詹氏甲烷球菌）的基因组第一个完成基因组测序的古生菌只有40％的基因与其他两界的生物有同源性 古生菌的基因组在结构上类似于细菌 1.66x106bp的环状染色体DNA 1682个ORF(Open Reading Frame) 3) 负责信息传递功能的基因（复制 、转录和翻译）则类似于真核生物ORF(Opening reading frame)ORF(Opening reading frame)任何一种生物的基因组，都是由不编码和编码蛋白质的核苷酸序列（基因）所组成。基因通常只是基因组的一小部分. 一个基因组拥有的“基因”数目是由两部分组成的：通过实验证明确有蛋白质产物的真实基因、根据起始密码和终止密码序列所确定的潜在基因。生物学家们把这两类基因都称为“开放阅读框” (ＯＲＦ）。因此，一个基因组内的基因数目通常是指ＯＲＦ的数目。 null休息一会儿生物园的紫玉兰null茶花飘香第二节微生物的突变与诱变育种第二节微生物的突变与诱变育种 突变：是由于生物体遗传物质——核酸（DNA或RNA）改变而引起的遗传性状的变化；包括基因突变和染色体畸变。null 基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何可 遗传的改变。基因突变狭义：点突变（一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换）野生型（原始性状）基因突变突变型（新性状）广义：基因突变和染色体畸变（大片段染色体的缺失、重 复、倒位）一、基因突变的定义null自发突变：在自然条件下发生的基因突变。诱发突变：利用物理化学因子处理微生物使其产生的突变。 回复突变：突变菌株发生突变，回复到出发菌株的状态。 基因突变分为 二、基因突变的类型同义突变：碱基的变化没有改变产物氨基酸序列的变化。错义突变：碱基序列的变化引起产物氨基酸的变化。无义突变：碱基的改变是密码子变为终止密码子。移码突变：碱基的缺失或插入使翻译的阅读框发生改变， 从而使氨基酸序列完全变化。不同的碱基变化对遗传信息的改变不同：nullUnull三、微生物突变体的主要类型： 1.形态突变型(morphological mutant) ：引起细胞形态变化或菌落形态改变的突变型（如：色素突变型、无荚膜突变型）。 2.营养突变型（营养缺陷型）：某些微生物经基因突变后由于代谢过程的缺陷而成为必需某种物质才能生活的突变型（如色氨酸营养缺陷型：Trp-）。 null2、营养缺陷型（auxotroph）特点：在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长负选择标记（突变株不能通过选择平板直接获得）缺乏合成其生存所必需的营养物的突变型。null营养缺陷型实验步骤见 P 208第三段影印平板（Replica plating）法是Lederberg夫妇在1952年建立null 3.抗性突变型(resistant mutant )：由于基因突变而获得抵抗药物、噬菌体、辐射等的突变体。（如抗链霉素突变体：Strr, resistance）. 4.条件致死突变型(conditional lethal mutant): 在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。 5.其他突变型：发酵、毒力、糖发酵能力，代谢产物的种类和产量的突变，以及致死突变型。null 1）自发性 2）不对应性 3）稀有性 4）规律性 四、基因突变的特点 5）独立性 6）可诱变性 7）遗传性 8）可逆性 null 基因突变的自发性和非对应性的证明 一种观点认为，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”、“驯化”。 另一种观点认为，基因突变是自发的。 如何证明基因突变的非对应性？ 三个经典实验 变量实验、涂布实验、影印实验 1943年S. E. Luria与M. Dlbruck进行了Fluctuation test 1949年H. B. Newcombe的Respreding plated incubacion 1952年J. Lederberg夫妇用Replica- plating结束了争论证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！ null基因突变自发性和不对应性的实验证明：三个经典实验 变量实验 涂布实验 影印实验证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。野生型 （原始性状）特定环境突变型 （适应环境的新性状）驯化定向诱变筛选？？？突变的原因？null1.变量试验（fluctuation analysis） 也称波动试验，彷徨试验 1943年，美国的鲁里亚（Salvador. Luria）和德尔玻留克（Max. Delbruck）设计。null结论：抗噬菌体突变体的出现与接触噬菌体与否无关。null2.影印培养试验（replica plating ） ： 1952年美国莱德伯格夫妇Joshua Lederberg and Esther Lederberg设计。结论：抗药性突变体的出现与接触药物与否无关。null3.涂布试验： 1949年美国纽康博(Newcombe)设计。结论：抗噬菌体突变体的出现与接触噬菌体与否无关。null五、基因突变的机制 1.自发突变的机制主要的原因是：碱基互变异构体的存在导致形成不同 的碱基配对。腺嘌呤氨基式 A－T配对腺嘌呤亚氨基式 A－C配对结果：导致AT GC碱基置换：碱基与碱基之间的交换导致突变的发生 转换：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的碱基置换。 颠换：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的碱基置换。null2、诱发突变的机制 （1）碱基的置换（转换、颠换） 碱基对置换substitution 转换transition： 颠换transversion：null（2）移码突变frame-shift mutant ：添加或缺失核 苷酸，引起阅读错误（是指由诱变剂引起的DNA分子中一个或少数几个核苷酸[碱基对]的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录或转译错误的一类突变）null（3）染色体畸变chromosomal aberration ：缺失、重复、插入、易位、倒位（指生物细胞中染色体数目的增减［染色体组数、同一组内染色体数目］和结构的改变［片段的添加、缺失、重复、移位和倒位］）。nullA、碱基类似物-------5-BU尿嘧啶引起碱基的转换5－溴尿嘧啶 （胸腺嘧啶结构类似物）3、诱变剂null5-BUe(酮式)与A配对,5-BUk(烯醇式)与G配对, 结果: A:T A:BUe(酮式) A:T A:T G:BUk(烯醇式) G:C A:BU A:T－－G:CnullB、插入染料nullC、与DNA碱基直接起化学反应的诱变剂 亚硝酸引起DNA的碱基转换nullD、辐射和热嘧啶嘧啶二聚体UVnullnullnull“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果所有生物的DNA在结构及特性上具有一致性艾姆氏试验（Ames test） ：利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用概念：利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便而有效方法。null美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，因此称为Ames试验 具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率 回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变 null证明Ames试验重要性的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其 药效显著，在60-70年代十分流行， 但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的 妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确 具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用 但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大 量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。 nullAmes试验null六、DNA损伤的修复1、光复活作用嘧啶二聚体嘧 啶 光解酶null2、切除修复null3、重组修复null4、SOS修复 DNA分子受到较大范围的重大损伤时诱导产生的一种应急反应。错误倾向的SOS修复null七、微生物突变体的筛选： 微生物突变机率很低，必需经过筛选才能获得相应突变体，筛选的方法很多，只讲3种。 （一）青霉素浓缩法： 在基本培养基中加入青霉素后培养细菌，因青霉素只对生长着的细菌有作用，（因为青霉素是干扰短肽之间肽键的形成，只有生长着的细菌才会合成细胞壁，所以青霉素只对生长着的细菌起杀灭作用）,在基本培养基里只有野生型的细菌才能生长，所以野生型的细菌被杀死，而营养缺陷型的细菌则被保留，用完全培养基培养后能生长出来缺陷型。null （二）菌丝过滤法： 把菌丝型的菌类（霉菌或放线菌）的孢子放在基本培养基里培养，由于在这种培养基里缺陷型孢子不能萌发或虽萌发不长出菌丝体，而野生型能够萌发并形成菌丝体，通过过滤即可将野生型淘汰。 （三）梯度培养皿法： 主要用于筛选抗性突变体，将含药物（一般为抗生素）的培养基倒入斜放的培养皿中，待凝固后放平，并倒入不含药物的培养基，即制成形成一定药物梯度的平板，接种细菌并培养后，就可得到具有不同程度抗性的突变体。null八、微生物诱变育种诱变育种：指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。（1）使用简便有效的诱变剂（2）选用优良的出发菌株 （3）处理单细胞或单孢子悬浮液诱变剂物理因素：紫外线、激光、离子束、X射线、r射线等 化学因素：烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物null（4）使用最佳的处理剂量致死剂量：将微生物全部杀死的剂量 亚致死剂量：将M大部分杀死，只留下很少的活菌体，如杀死99%以上，存活不到1%，或者杀死90%以上，存活在10%以下。 弱致死剂量：杀死一大半，存活一小半，如杀死50-70%，存活30%-50%诱变处理一般选用亚致死剂量。 处理剂量：是指处理因素对微生物的生物学效应 剂量 = 强度（浓度）× 作用时间 相对剂量 = 杀菌率null（5）设计高效率筛选诱变检出营养缺陷型淘汰野生型鉴定营养缺陷型富集培养 （抗生素法） （菌丝过滤法）影印平板法生长谱法突变株的筛选：产量突变株的筛选 抗药性突变株的筛选 营养缺陷型突变株的筛选null九.微生物育种 ①自发突变育种breeding by spontaneous mutation 生产育种 定向培育 ②诱变育种breeding by induced mutation 用物理（X-ray、UV等）化学（吖啶、亚硝酸、碱基类似物）因素诱变育种，获得突变机率提高。 null茗茶花香null贪得无厌、憨态可掬的猴子null克隆clone 不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成新个体，即无性繁殖。 基因重组gene recombination 两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新的基因型个体的过程。重组获得的后代具有新的基因组合，表现出不同于亲本的新性状。 原核微生物没有有性生殖，其基因重组通过转化、接合、转导方式进行。第三节 细菌的基因重组null 真核微生物与原核微生物在基因重组的形式上有所不同。 真核微生物的基因重组，在有性繁殖过程中发生。当真核微生物两个配子融合为一个合子并进行减数分裂时，部分染色体发生交换。交换实质上就是基因重组。 原核微生物的基因重组，通常只是部分遗传物质的转移和重组，形成的是部分合子（半合子），并通过转化、接合和转导等3种形式进行。null供体菌受体菌DNA片段1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力一、细菌的遗传转化（genetic transformation）null1.概念：转化是游离的DNA片段的转移和重组（受体细胞从外界直接吸收了来自供体细胞的DNA片段，并与其同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得了新的遗传特性，这种现象称为转化——黄秀梨）。 转化子：经转化后出现了供体性状的受体细胞，即是转化成功的菌落。 转化因子：有转化活性的外来DNA片段。 感受态：受体菌最易接受外源游离DNA并实现转化的生理状态（细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态）。 ①自然感受态是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制； ②人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA 的能力，或人为地将DNA导入细胞内null2.发现：1928年，英国的格里菲斯（Griffith）. 3.转化条件：①受体菌：必须处于感受态，才能吸收外源DNA；②外源DNA(通常为双链)：相对分子量越高，亲缘关系 越近，DNA的越 纯，转化率越高。 4.转化过程： 主要通过3个步骤 完成： ①感受态的出现 ②转化因子的吸附 与掺入 ③转化因子的整合 nullnull ①感受态的出现 也即感受态细胞的建立：可用人工方法提高受体菌的感受态水平，通常以CaCl2、cAMP等处理菌体。（如CAMP能使感受态水平提高10000倍）。 ②转化因子的吸附与掺入 也称DNA的结合和摄取：首先是供体双链DNA与受体细胞壁上的接受位点相结合，随后其中一条链被细胞表面上的核酸降解酶降解，降解产生的能量协助把另一条链推进受体细胞。亦发现有完整的双链被摄取的情况（G-的嗜血杆菌）。null ③ 转化因子的整合 当单链进入受体细胞后，便与双链结构的受体染色体DNA同源片段发生交换重组（若是双链DNA被受体细胞摄取，则由DNA结合蛋白或胞内的小泡囊，转运到受体染色体区，一条链被切除降解，另一条链则与单链进入受体菌的情况相同，即是与受体菌DNA整合），形成供体DNA-受体DNA复合物，再通过DNA复制和细胞分裂而表现出转化性状，形成转化子。null5.转化的普遍性： 在20多种细菌中发现了转化现象。肺炎链球菌，大肠杆菌，嗜血杆菌属，芽孢杆菌属，假单胞杆菌属，奈瑟氏球菌属，葡萄球菌属，根瘤菌属。 6.转化的性状： 形态变化，荚膜物质，糖发酵、耐药性，抗原性，致病力，代谢产物，营养需要的变化。转化率一般在0.1-1%。null1)概念: 噬菌体DNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒7.转染(transfection)：2)转染的特点： 提纯的噬菌体DNA以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。null8.人工转化：用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。 在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，不是由细菌自身的基因所控制，是基因工程的奠基石和基础技术。 用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。电穿孔法（electroporation):用高压脉冲电流击破细胞膜形成小孔，使各种大分子（包括DNA)能通过这些小孔进入细胞，所以又称电转化。null（一）转导及发现： 1.概念： 遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组称为转导（以完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，把一个细胞<供体细胞>的DNA片段转移到另一个细胞<受体细胞>中，并使后者发生遗传变异的过程）。 转导子： 通过转导获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞，称为转导子。二、细菌的转导(transduction)转导转导回本章目录null 转导噬菌体： 携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为转导噬菌体或转导颗粒。 完全缺陷噬菌体： 在噬菌体内仅含有供体DNA的称为完全缺陷噬菌体。 部分缺陷噬菌体： 在噬菌体内同时含有供体DNA和噬菌体DNA的称为部分缺陷噬菌体。 2.发现：1952年，美国的科学工作者辛德（Zinder）和莱德伯格(Lederberg)。null意外地发现:1951年，Joshua Lederberg(莱德伯格)和Norton Zinder(辛德)为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！ 3.转导的类型: 完全转导 普遍性转导: 流产转导 低频转导 局限性转导: 高频转导 null（二）普遍性转导和局限性转导： 根据噬菌体和转导DNA产生途径的不同，可将转导分为普遍性转导和局限性转导。 1.普遍性转导：可以把供体菌的任何一个DNA片段带给受体菌的转导。null普遍转导（generalized transduction）噬菌体可以转导供体菌染色体的任何部分到受体细胞中普遍性转导的三种后果：外源DNA被降解，转导失败。进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换 而形成稳定的转导子流产转导null1)完全(普遍性)转导complete transduction ：转导DNA能进行正常的重组复制,形成的后代都是遗传性稳定的转导子(transductant) null2)流产(普遍性)转导: 转导DNA不能进行正常的重组复制仅能通过转录而得到表达，只能将这段DNA分配给一个子细胞，另一个子细胞只能获得供体基因的产物酶，这样的转导称为流产普遍性转导。null2.局限性转导specialized transduction ： 1)概念:只能把一个或少数几个基因带给受体菌的转导。 2)发现: 1954年在大肠杆菌K12中发现。 3)过程:当溶原菌群经诱导后，其中极少数前噬菌体从宿主染色体脱落时产生错误切割，从而把宿主的某些基因（ λ前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal＋和bio＋，故形成的转导噬菌体通常带有ga1＋或bio＋）整合到噬菌体的基因组上 ，当这样的噬菌体侵染另一宿主菌时，噬菌体 DNA 与受体菌的 DNA 同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性，而形成转导子（缺陷溶源菌）。 null局限转导：温和噬菌体感染整合到细菌染色体的特定位点上 宿主细胞发生溶源化溶源菌因诱导而发生裂解时， 在前噬菌体二侧的少数宿主 基因因偶尔发生的不正常切 割而连在噬菌体DNA上部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中null缺陷噬菌体DNA分子在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的局限转导子。1)低频转导：低频转导 裂解物正常噬菌体极少量的部分 缺陷噬菌体 （局限转导噬菌体）转导颗粒局限转导子 （极少量）低感染复数null缺陷噬菌体（defective phage）丢失了自身部分基因并被同等长度的宿主基因所取代的噬菌体,如λdgal或λdbio。 低频转导（1ow frequancy transduction, LFT）形成转导子的频率很低，只有10-4-10-6 。 高频转导（high frequancy transduction, HFT ）形成转导子的频率很高, 理论上可达 50%。 高频转导是双重溶源的结果： λ ─┐ │＋ E.coli k12 → [E.coli K12(λ/λdgal )F ] λdgal ┘ ↓UV 转导噬菌体（λgal）→ 转导子菌落 辅助噬菌体（λ）→ 噬菌斑 null2)高频转导：低频转导 裂解物正常噬菌体极少量的 部分缺陷噬菌体 （局限转导噬菌体）转导颗粒高感染复数双重溶源菌缺陷噬菌体和正常噬菌体同步复制高频转导 裂解物部分缺陷噬菌 （局限转导噬菌体）正常噬菌体等量转导颗粒局限转导子 （大量）null(三)局限转导与普遍转导的主要区别：1.局限转导中被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。2.局限性转导是将整合区的个别基因导入受体菌。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性(任何的)。 3.局限性转导的噬菌体温和噬菌体----烈性噬菌体.普遍性转导的噬菌体为烈性噬菌体,（四）转导的普遍性： 沙门氏菌、埃希氏菌、假单胞菌、葡萄球菌、变形杆菌等属的菌类有转导现象。null(五)溶源转变(lysonenic conversion) 1)概念:当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象。 2)特点:当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶源转变而获得的性状也同时消失。溶源转变与转导有本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带任何供体菌的基因；其次，这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的。 3)典型例子： 不产毒素的白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae) 菌株在被噬菌体感染而发生溶源化时，会变成产白喉毒素的致病菌株。null三、细菌的接合作用(conjugation)（一）接合及发现 1.概念：遗传物质通过细胞与细胞的直接接触而进行遗传信息转移和重组的过程。 2.发现：1946年美国科学工作者莱德伯格（ Joshua Lederberg）和塔图姆（ Edward L. Tatum）在进行E.coli k12的多重营养缺陷型杂交实验研究时发现的。 （二）大肠杆菌的接合 1.材料：A：大肠杆菌K12苏氨酸和亮氨酸营养缺陷型Bio+Met+Thr-Leu- B：大肠杆菌K12生物素和甲硫氨酸营养缺陷型Bio-Met-Thr+Leu+ null2.实验： 1)单独培养均不生长， 2)混合培养生长； 3)分别放入U形管的两端，不能生长，说明不是转化； 证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ） 4)电镜下看到了通过性纤毛的接和；F-F+null（三）F因子和接合 1.几个名词： 1)F因子(致育因子或称性质粒) ：①概念：是决定大肠杆菌性别的因子，是能控制大肠杆菌性纤毛（性丝）形成的小分子DNA，呈超螺旋状态 ，分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程进行的20多个基因。 它既可以在细胞内独立存在, 具有自主与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中的能力,又可插入(即整合)到染色体上。 ②F因子特点： A.可经接合作用而获得 B.可通过一些理化因素( 如吖啶橙、Ni2+、Co2+、利福平、丝裂霉素C、硫酸十二酯钠、亚硝基胍、溴化乙锭、环己亚胺和加热等)的处理，而从细胞中消失。 C.在大肠杆菌中，F因子的DNA含量约占总染色体含量的2%.nullF因子null2)F-菌株(“雌性”菌株)：不含F因子的菌株.(不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成F+菌株) 。 3)F＋菌株(雄性菌株)：含有游离F因子的菌株.(F因子独立存在，细胞表面有性菌毛)。 4)Hfr菌株：含有整合在细胞核DNA上的F因子的菌株。(F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。) 高频重组菌株（high frequency recombination）。与F-接合后，重组频率比F+高几百倍。 在Hfr细胞中，存在与染色体特定位点相整合的F因子(产生频率约10-5)。当它与F-菌株发生接合时，Hfr染色体在F因子处发生断裂，由环状变成线状。整段线状染色体转移至F- 细胞的全过程约需100 min。在转移时，由于断裂发生在F因子中，所以必然要等Hfr的整条染色体组全部转移完成后，F因子才能完全进入F- 细胞。但转移过程易中断，所以越在前端的基因，进入的机会就越多，故在F- 中出现重组子的时间就越早，频率也高。 null5)F’菌株：含有游离的，但带有一小段宿主细胞核DNA的F因子菌株。(Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为 F’因子。 细胞表面同样有性菌毛。) 携带有F’因子的菌株，其性状介于F+与Hfr之间，这就是初生F’菌株。初生F’菌株与F- 菌株接合，可使后者转变成F’ 菌株，这就是次生F’ 菌株，它既获得了F因子，又获得了来自初生F’ 菌株的若干遗传性状。以这种接合来传递供体菌基因的方式，称为F因子转导(F-duction)、性导(sexduction) 。 在次生的F’ 群体中，大约有10%的F’因子重新整合到染色体组上，而恢复成Hfr菌。 null2.几种杂交结果： F＋×F- F＋ ＋F＋ F’×F- F’+ F’ Hfr+F-(大多数情况下) Hfr×F- Hfr+Hfr（极少数情况下） 附加体：既能以游离状态存在又能整合到细胞核DNA上去的质粒称为附加体。null1） F+×F-杂交1）F+ 细菌通过性毛与F- 细菌接触并发生相互作用； 2）F因子出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F- 细菌中。 3）F因子的一条链一进入F- 细菌中，在F- 细菌中复制新的 F因子从而变成F+ 4）原有F+ 细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+ 的拷贝。F+ ＋ F+ null Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过程,就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组,由此而得名为高频重组菌株。2）Hfr ×F-杂交 Hfr菌株仍然保持着F+ 细胞的特征，具有F 性菌毛，并象F+一样与F- 细胞进行接合。 所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移。Hfr＋ F-Hfr＋ F- (少数Hfr)nullF因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。 Hfr×F- 杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。 染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F- 中出现重组子的时间就越早，频率也高。null3）F′×F-杂交F′×F-与F+×F-的不同： 供体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞 a）与染色体发生重组； b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体；细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）。F′＋ F′null四细菌基因转移方式的比较： 转化 转导 接合 供体菌解体 ＋ ＋ — DNA转移方式 游离的DNA片段通过 通过供体菌的裂解， 两细菌接触后通过 受体菌的细胞膜直接 噬菌体的外壳蛋白包 性纤毛直接把游离 进入受体菌内 裹供体菌的DNA片段 DNA片段送入受体 转入受体菌内 菌内 参与细菌 G＋，G—菌 G＋，G—菌 几乎全为G—菌 所转移的供体 约20个基因 约20个基因 20个基因到整个 菌的DNA量 细胞核DNA 质体转移 ＋ ＋ ＋ 对DNA酶的抗性 — ＋ ＋ 单向转移 — ＋ ＋null“接合” “转化” 及“转导”这三种在自然界中存在的细菌遗传重组过程各自的特点：外源DNA的来源及进入途径有差异null五. 原生质体融合1.概念:将遗传性状不同的两种菌（包括种间、种内、及属间）原生质体融合成为一个新的重组子的技术。2.原生质体融合步骤：1、原生质体制备 2、原生质体融合和再生 3、融合子的选择null原生质体融合回本章目录null 微生物细胞融合的研究始于1976年。 主要过程： 先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子。null++null 杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。 有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。 （一）有性杂交第四节 真菌的基因重组能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以进行有性杂交null 粗糙脉孢菌的有性杂交null（二）准性杂交1.准性生殖:是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。它是类似于有性生殖，但比之更为原始的一种生殖方式，它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。在半知菌类中最为常见。2、异核体形成1、菌丝联合3、核配4、体细胞交换和单倍体化2.准性生殖的过程： 杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减数分裂，但在有丝分裂中可以发生染色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子。 nullnullnull第五节 微生物基因表达的调控 一、操纵子（operon)的转录调控操纵子：一个或多个结构基因联接在一起，形成一个在结构和功 能上协同作用的整体，受同一个调节基因、操纵基因 (operator)和启动区（promoter)的调控。null1、负转录调控（negative transcription control)1）负控诱导系统-- E.coli的乳糖操纵子 调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），阻遏蛋白可以与操纵区结合，起着阻止结构基因转录的作用。E.coli的乳糖操纵子（无乳糖时不能产生利用乳糖的酶，有时则能）2）负控阻遏系统-- E.coli的色氨酸操纵子a、没有辅阻遏物存在时，阻遏蛋白不与操纵区结合，转录进行。 b、有辅阻遏物