氮离子注入井冈霉素产生菌诱变高产菌株的研究

氮离子注入井冈霉素产生菌诱变高产菌株的研究 氮离子注入井冈霉素产生菌诱变高产菌株 的研究 江西农业2010,22(4):122,123 AetaAgriculturaeJiangxi 氮离子注入井冈霉素产生菌诱变高产菌株的研究 赵南,吴冬兰,唐洪殷,毛玉华,贺婷,张文宣r (江西核工业瑞丰生化有限责任公司,江西新干331307) 摘要:探索了氮离子注入技术在井冈霉素产生茵高产菌株诱变中的应用.向井冈霉素产生茵注入能量10keV,剂量15 ×10"~-/cm2氮离子实施诱变,再生培养后单茵落接斜面上摇床进行效价测定,筛选高产菌株.结果获得诱变茵株9275.,其 有效A组分含量较出发茵株提高33.52%,且具有高的遗传稳定性. 关键词:氮离子注入;井冈霉素产生茵;诱变;高产菌株 中图分类号:$482.28文献标识码:A文章编号:1001—8581(2010)04—0122—02 StudyonMutationofHigh--yieldingStrainbyInjectingNitrogen IonintoValidamycin..producil~Strain ZHAONan,WUDong—lan,TANGHong—qi,MAOY_u—hua,HETing,ZHANGWen—xaall (JiangxiNuclearIndustrialRuifengBiochemicalLimitedLiabilityCompany,Xin'gan3313 07,China) Abstract:Theapplicationofnitrogenionbeaminjectiontechniqueinthemutationofhigh—yieldingvalidamycin—producing strainwilt8explored.Afterinjecting15×10"nitrogenionspermetriccentimeterwiththeintensityof10keVintovalidamycin—produ. cingstrainformutation,theregeneratedsingle,colonieswereinoculatedinshakeflasksfortheselectingofhigh—yieMingstrains.A mutativestrain9275wasobtained,thecontentofeffectivecomponentAinstrain9275Was33. 52%higherthanthatintheoriginal strain,and9275hadhighgeneticstability. Keywords:Injectionofnitrogenionbeam;Validamycin—producingstrain;M~ation;High —yieldingstrain 井冈霉素作为一种氨基糖苷类农用抗生素,对水稻 纹枯病具有良好的防治效果.自1973年被发现问世以 来,井冈霉素对水稻的高产稳产做出了重大的贡献. 时至今日,井冈霉素仍被广大水稻种植户普遍使用.我 国是井冈霉素的生产大国,对井冈霉素生产的技术开发 和工艺改进从未间断,井冈霉素菌种选育亦然,诸如uV 与DES复合诱变,uV与亚硝酸复合诱变等,均获得 了良好的应用效果.然而,同一品系若多次反复使用相 同手段进行诱变处理,易发生"钝化"现象,即作用于基 因的位点有限,导致突变类型少,诱变处理效果不佳. 离子注入诱变技术始于20世纪80年代,是一种集物理 和化学效应为一体的综合诱变技术,它能引起染色体的 畸变,导致DNA链碱基的损伤,断裂,从而使遗传物质在 基因水平或分子水平上发生改变或缺失,大幅度提高变 异的频率].本文报道氮离子注入技术在井冈霉素菌 种选育中的应用和效果. 1材料与方法 1.1材料出发菌株(公司自有):吸水链霉菌井冈变 种(Streptomyceshygroscopicusvar.jinggangensisYen.) 7005.液态菌丝体培养基:糊精0.65%,牛肉膏1%, MgSO40.08%,KH2PO40.2%,HPO40.4%,甘氨酸 0.7%.混合酶液:纤维素酶0.5%,溶菌酶1.2%,无菌 水配制后微孔滤膜抽滤除菌.再生培养基:见文献[6]. 斜面培养基:葡萄糖1%,L一天冬素0.05%,KHPO 0.o5%,琼脂(青岛海燕牌)1.9%,pH7.摇瓶发酵培养 基:大米粉9%,酵母粉1%,黄豆粉1%,KH:PO0.1%, NaC10.15%,pH7.高效液相色谱仪:13本岛津LC— l0ATVP. 1.2方法 1.2.1原生质体制备见文献[5]. 1.2.2氮离子注入诱变吸取0.1mL原生质体悬浮液 于培养皿内,无菌状态下自然风干.将氮离子注入风干 的原生质体内,引发菌体变异.诱变后原生质体再生形 成单菌落,转接于斜面培养基置38)oC下培养70,72h 至成熟,挖取0.5cm斜面孢子接入摇瓶进行筛选,在温 度38?下以转速220r/min离心92h至发酵终点放瓶, 通过发酵滤液效价测定结果考察正变幅度和正变频率, 确定最优氮离子注入剂量条件. 1.2.3HPLC含量检测方法色谱条件:StableBond C18反相柱;柱温:室温;检测器:uV210am;流动相:称 取0.7g无水N%HP04,溶于100mL二次重蒸水中,用 HPO4调节pH值至7.0,加入30mL甲醇混匀,0.45肌 微孔滤膜过滤脱气;流速:1.0mL/min;进样体积:20. 1.2.4正变频率和正变幅度的统计随机抽取3O支诱 变单菌落斜面为考查对象,根据摇瓶发酵效价(以A组 分计,下同)数据作如下界定:与出发菌株对比,效价高 于5%为正变株,反之为非正变株(或无义变株);正变菌 株数量与所有菌株数量(3o株)的比率即为正变率;正变 菌株的效价均值增产百分比为正变幅度. 收稿日期:2010—02—04 作者简介:赵南(1973一),男,江西南昌人,工程师,从事工业微生物研究. 4期赵南等:氮离子注人片冈霉素产生菌诱变高产菌株的研究123 2结果与 2.1氮离子注入最适剂量的确定在氮离子束注入能 量为10keV时,设定注入剂量5X10,10X10",15X 10", 20X10",25X10"ion/em五个水平,各试验组作相 应处理后与出发菌株同上摇床,考察诱变效果,确定最适 剂量,结果如1. 表1各剂量诱变效果对比 表1数据显示,当诱变剂量为10X10"ion/cm时, 菌株的正变率最高,达到23.3%;当诱变剂量为15X10" ion/cm时,菌株的正变幅最大,达到l6.37%.鉴于菌 种选育好中求优的特殊性,在保证一定正变率的前提下, 参数正变幅的考察应成为最核心的内容,因此将15× 10"ion/em2确定为诱变的最适剂量. 2.2氮离子注入井冈霉素产生菌诱变筛选结果按照 确定的诱变条件,以7005为出发菌株连续进行二轮递推 式筛选,选育系谱如图1所示. 7005 N离子束,10keV,15X10"ion/em2 8068 N离子束,10keV,15X10"ion/em 9275 图1氮离子注入井冈霉素产生菌诱变系谱 第一轮诱变以7005为出发菌株,接出单菌落斜面 129支,与对照出发菌株同上摇床,经初,复筛获得 8068.第二轮以8068为出发株,接出单菌落斜面i42 支,同法获得9275.过程及筛选结果见表2. 表2出发菌株及诱变菌株摇瓶效价比较结果 二轮诱变得到的8068,9275与出发株相比,发酵效 价均有不同程度提高,其中9275出现正变累积效应,有 效A组分提高幅度达33.52%. 2.39275'诱变菌株的遗传稳定性'将9275连续传代, 每代菌株选3只发酵摇瓶同上摇床,得效价数据平均后 进行对比,结果见表3. 表39275'诱变菌株的遗传稳定性 表3数据显示,与9275诱变亲株Fl相比,各传代菌 株的发酵水平虽产生一定波动,但都维持在?3%的范围 之内,验证了9275诱变菌株高产,稳产的遗传特性. 3讨论 本研究对井冈霉素产生菌注入能量10keV,剂量15 X10"-@/em2氮离子实施诱变,获得9275诱变菌株,增 产能力达33.52%,且其遗传特性稳定,说明氮离子束注 入法在井冈霉素选育中具有良好的诱变效果.但从 8068到9275诱变增产幅度呈递减趋势,可能与诱变菌 株对离子注入处理的敏感性大大降低有关,因此寻找新 型有效的诱变手段是下一步工作的方向. 曾经试图通过建立抗性筛选模型或形态学观察,在 摇瓶考察前进行初步筛选,以提高筛选效率,但还没有取 得进展,因此后期筛选工作有一定的随机性,有待进一步 探索改进. 井冈霉素摇瓶发酵周期为9o一92h,而规模化生产 周期仅为46h左右,两者相差甚远.如能通过调整摇瓶 发酵的工艺条件,使之符合大生产的时间要求,那么诱变 获得的高产菌株将更贴近生产实践. 参考文献: [1]沈寅初.井冈霉素研究开发25年[J].植物保护,1996,22 (4):44—45. [2]廖晓殉,陶科,侯太平.井冈霉素产生菌的诱变选育及发酵条件 优化[J].四川大学(自然科学版),2O08,45(4):963-966. [3]牛莉娜,葛翠风,葛绍荣.链霉素抗性筛选井冈霉紊高产菌株 的研究[J].安徽农业科学,2007,35(28):8930—8932. [4]施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学[M].福州:福建科学技 术出版社,1991.77—97. [5]张晓勇,林壁润,高向阳,等.农用抗生素高产菌株的诱变筛 选新技术[J].广东农业科学,2006,(5):80-82,91. [6]邹坚.应用原生质体诱变技术筛选井冈霉素高产菌种的研究 [J].现代农药,2O03,2(2):27-28.